湯 涵， 李滔滔， 汪無忌， 劉 純， 陳 怡，肖晗汕， 劉石泉， 胡治遠(yuǎn)， 余松林， 文瑞明

（湖南城市學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院/黑茶金花湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 益陽413000）

茯磚茶在自然發(fā)花工藝完成后，表面生有金黃色的顆粒，這種顆粒被稱為“金花”[1]。“金花”實(shí)為冠突散囊菌（Eurotium cristatum）的閉囊殼[2-3]，因此冠突散囊菌俗稱為金花菌。閉囊殼即子囊果，是冠突散囊菌有性繁殖孢子（子囊孢子）的生成部位，呈球形或近球形，成熟子囊果無規(guī)律破裂釋放子囊[3]，子囊為一層擬薄壁組織包裹8個(gè)子囊孢子[4]。子囊孢子雙凸鏡形，具冠狀突起及小疣，表面明顯粗糙[5]。冠突散囊菌具有多種功效，包括抗氧化、降脂減肥、抗癌、抑菌等[6-9]，其在茯磚茶發(fā)花過程中形成生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，其他種類的微生物很少存在[10-11]，其可能產(chǎn)生不利于雜菌生長(zhǎng)的產(chǎn)物[12]。目前，冠突散囊菌抑菌活性研究大都集中在冠突散囊菌發(fā)酵液[13]，即冠突散囊菌胞外產(chǎn)物的抑菌性能，而冠突散囊菌胞內(nèi)活性成分抑菌性能的研究較少。成熟子囊果較易破裂釋放子囊，子囊孢子孢壁質(zhì)地堅(jiān)韌、耐酸堿、極難氧化分解[12]，限制了對(duì)孢子內(nèi)有效抑菌成分的準(zhǔn)確分析。為了提取冠突散囊菌子囊孢子內(nèi)的有效抑菌成分，對(duì)冠突散囊菌子囊果及子囊孢子進(jìn)行破壁。

作者以冠突散囊菌子囊果和子囊孢子為研究對(duì)象，擬采用超聲法、玻璃珠振搖法破碎子囊果，超聲法、玻璃珠振搖法、萌發(fā)法破壁子囊孢子，獲得子囊果提取物及子囊孢子提取物，對(duì)比不同破壁方法獲得的提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑制作用的影響，探尋對(duì)抑菌活性影響最小且高效的破壁提取方法，為冠突散囊菌天然抑菌物質(zhì)的開發(fā)提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑冠突散囊菌（編號(hào)JH1206）：黑茶金花湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

茯磚茶:湖南益陽茶廠股份有限公司提供;瓊脂、蔗糖、氯化鈉、牛肉膏和蛋白胨:國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;土豆:購于菜市場(chǎng)。

1.1.2 主要儀器設(shè)備JY96-IIN超聲波細(xì)胞破碎儀：上海滬析實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；BLD-210倒置顯微鏡：北京世紀(jì)科信科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：浙江力辰儀器科技有限公司產(chǎn)品；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠制造；TS-100C恒溫振蕩器：上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司產(chǎn)品；DT5-2B低速離心機(jī)：北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司產(chǎn)品；101-2AB電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)：上海博訊儀器有限公司產(chǎn)品；YXQ-100G立式壓力蒸汽滅菌器：上海東亞壓力容器制造有限公司產(chǎn)品；AUW220電子天平：日本島津公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 冠突散囊菌子囊果的破碎

1）冠突散囊菌子囊果的獲取 選擇作者所在實(shí)驗(yàn)室自制的茶葉（表面冠突散囊菌生長(zhǎng)茂盛的冠突散囊菌散茶），過100目網(wǎng)篩分離冠突散囊菌子囊果，將分離的子囊果收集到干凈的玻璃儲(chǔ)罐中置于室溫備用。

2）超聲法破碎冠突散囊菌子囊果 稱取2 g子囊果置于燒杯中，加30 mL蒸餾水混勻，置于超聲波細(xì)胞破碎儀中破碎，設(shè)置時(shí)間20 min，調(diào)整功率分別為360、720、1 080、1 440、1 800 W。

3）玻璃珠振搖法破碎冠突散囊菌子囊果 稱取2 g子囊果裝入組織培養(yǎng)瓶中，加30 mL蒸餾水混勻，加玻璃珠若干（玻璃珠直徑為2 mm，鋪滿瓶底），然后放入180 r/min的搖床中振搖60 min。

1.2.2 冠突散囊菌子囊孢子的破壁

1）冠突散囊菌子囊孢子的獲取 稱取適量子囊果于組織培養(yǎng)瓶中，加30 mL蒸餾水，加玻璃珠若干（玻璃珠鋪滿瓶底），然后放入180 r/min的搖床中振搖60 min。將破碎后的子囊果用10層紗布過濾兩遍，取濾渣，將子囊孢子細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為107個(gè)/mL。

2）超聲法破壁冠突散囊菌子囊孢子 取30 mL子囊孢子懸液，在超聲時(shí)間20 min條件下，調(diào)節(jié)功率分別為360、720、1 080、1 440、1 800 W。在超聲功率1 800 W條件下，調(diào)節(jié)超聲時(shí)間分別為10、20、30、40、50 min。

3）玻璃珠振搖法破壁冠突散囊菌子囊孢子 根據(jù)文獻(xiàn)[14]，取30 mL子囊孢子懸液于組織培養(yǎng)瓶中（玻璃珠鋪滿瓶底），置于-18℃冰箱冷凍1 d。將冷凍好的子囊孢子立即于60℃水浴鍋中分別水浴加熱1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，再放入180 r/min的搖床中分別振搖2、4、6、8、10 h。

4）萌發(fā)法破壁冠突散囊菌子囊孢子 取30 mL子囊孢子懸液于組織培養(yǎng)瓶中，放入30℃、120 r/min的搖床中振搖培養(yǎng)48 h。

1.2.3 冠突散囊菌子囊孢子破壁率的測(cè)定及計(jì)算

式中：W為子囊孢子破壁率，%；N1為子囊孢子總數(shù)，個(gè)；N2為未破壁子囊孢子總數(shù)，個(gè)[15]。

1.2.4 冠突散囊菌子囊果和子囊孢子提取物抑菌活性的檢測(cè)在40℃條件下，將子囊果或子囊孢子提取物放置于真空干燥箱烘干,再添加適量的水，溶解固體物質(zhì)，使其質(zhì)量溶度為200 mg/mL。在無菌操作條件下，滴入0.2 mL提取液于滅菌后的濾紙片上，等待其充分吸收并晾干。用蒸餾水將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌液配制成OD值為0.4的菌懸液，分別取0.3 mL均勻涂布于已制好的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中。將準(zhǔn)備好的濾紙片貼于含菌平板中，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，于37℃培養(yǎng)24 h后測(cè)定抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 冠突散囊菌子囊果破碎方法對(duì)其抑菌活性的影響

2.1.1 超聲法破碎冠突散囊菌子囊果結(jié)果由圖1可知，破碎前的子囊果呈球形或近球形，因不透光而呈現(xiàn)黑褐色；經(jīng)過超聲處理，具有規(guī)則形狀的子囊果消失，伴隨出現(xiàn)大量絮狀物。超聲功率為360 W時(shí)子囊果基本完全破碎，隨著超聲功率的增加，子囊果破碎程度增加，聚集的絮狀物體積減小，周圍密集地分散著釋放出的子囊孢子。

圖1 400倍光學(xué)顯微鏡下不同超聲功率破碎后的子囊果Fig.1 Microscope(400×)photo of ascocarps broken under different ultrasonic power condition

為探究超聲法破碎子囊果對(duì)其抑菌活性的影響，以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌，采用1.2.4中方法檢測(cè)超聲破碎后子囊果內(nèi)含物的抑菌效果，結(jié)果為：采用超聲法破碎冠突散囊菌子囊果的提取物對(duì)大腸桿菌無明顯的抑制作用；超聲功率在1 440 W以下時(shí)，子囊果提取物對(duì)金黃色葡萄球菌無抑制作用，當(dāng)超聲功率增加至1 800 W，提取物表現(xiàn)出抑制作用，其抑菌圈半徑為1.0 mm。

2.1.2 玻璃珠振搖法破碎冠突散囊菌子囊果結(jié)果通過400倍光學(xué)顯微鏡觀察玻璃珠振搖法破碎的子囊果，結(jié)果見圖2。冠突散囊菌子囊果在有玻璃珠的情況下，振搖60 min后，即可完全破碎，破碎后的子囊果外壁破裂，釋放出里面的子囊孢子以及內(nèi)容物。子囊果破碎后出現(xiàn)很多聚集在一起的絮狀物，為破碎的子囊果外壁及子囊擬薄壁組織，此結(jié)果和超聲法破碎子囊果結(jié)果一致。

圖2 400倍光學(xué)顯微鏡下玻璃珠振搖法處理的子囊果Fig.2 Microscope (400×)photo of ascocarps disrupted using glass bead-beating method

為探究玻璃珠振搖法破碎子囊果對(duì)其抑菌活性的影響，將破碎后的子囊果于4 000 r/min離心20 min，取上清液將質(zhì)量濃度定至200 mg/mL，以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌，采用1.2.4的方法進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，玻璃珠振搖法處理后的子囊果提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌圈半徑分別為5.8 mm和12.6 mm。對(duì)比超聲法，玻璃珠振搖法破碎子囊果后的提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用更強(qiáng)，這說明玻璃珠振搖法能更好地保留冠突散囊菌子囊果中的抑菌物質(zhì)。超聲法處理子囊果后，其提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用減弱，甚至消失，這說明超聲波對(duì)提取物中的抑菌物質(zhì)有破壞作用。因此，玻璃珠振搖法比超聲法更合適于提取冠突散囊菌子囊果中的抑菌物質(zhì)。

圖3 玻璃珠振搖法破碎子囊果所得提取物的抑菌作用Fig.3 Antibacterial activities of ascocarps extract obtained using glass bead-beating method

2.2 冠突散囊菌子囊孢子破壁方法對(duì)其抑菌活性的影響

2.2.1 超聲法破壁冠突散囊菌子囊孢子結(jié)果在設(shè)置的條件下用超聲法處理子囊孢子，破壁率見圖4。在超聲時(shí)間20 min條件下，隨著超聲功率的增加，子囊孢子的破壁率增加，最高為43.8%；固定超聲功率為1 800 W，增加超聲時(shí)間，子囊孢子的破壁率可進(jìn)一步提高，最高可達(dá)到67.5%。

圖4 超聲條件對(duì)子囊孢子破壁率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic condition on ascospores breakage rate

為探究超聲法破壁子囊孢子對(duì)其抑菌活性的影響，將超聲功率為1 800 W、時(shí)間50 min破壁后的子囊孢子提取物濃縮至200 mg/mL，采用1.2.4的方法檢測(cè)提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性，結(jié)果見圖5。由圖可知，提取物對(duì)金黃色葡萄球菌無明顯的抑菌作用，對(duì)大腸桿菌有微弱的抑菌作用。這說明超聲法雖然能破壁冠突散囊菌子囊孢子，但子囊孢子提取物喪失了抑菌活性，因此超聲法不適合于提取冠突散囊菌有性繁殖體中子囊孢子的抑菌活性物質(zhì)。

圖5 超聲功率為1 800 W、時(shí)間50 min處理的子囊孢子提取物對(duì)指示菌的抑菌效果Fig.5 Bacteriostasis results of ascospore extracts against the tested bacteria obtained with ultrasonication under 1 800 W for 50 min

2.2.2 玻璃珠振搖法破壁冠突散囊菌子囊孢子結(jié)果從子囊果中釋放的孢子，呈現(xiàn)規(guī)整、豐滿的球形，經(jīng)過紗布過濾后可去除大部分菌絲和破碎的子囊果壁，如圖6（a）所示。破壁后的子囊孢子樣本中豐滿、規(guī)整的球形狀態(tài)的子囊孢子明顯減少，同時(shí)出現(xiàn)類似子囊果破壁后聚集在一起的絮狀物質(zhì)（見圖6（b））。每隔2 h取樣測(cè)子囊孢子的細(xì)胞濃度，得到不同水浴加熱時(shí)間、不同振搖時(shí)間子囊孢子破壁率，結(jié)果見表1。在振搖時(shí)間較短（2～4 h）的條件下，60℃水浴加熱時(shí)間對(duì)冠突散囊菌子囊孢子破壁率影響較大，其中水浴加熱時(shí)間為1.5 h最好，振搖2 h后子囊孢子的破壁率即可達(dá)到81.8%；隨著振搖時(shí)間的延長(zhǎng)，60℃水浴加熱時(shí)間的影響逐漸降低。水浴加熱時(shí)間較短（1.0～1.5 h）的條件下，子囊孢子的破壁率能在較短的時(shí)間（2 h）內(nèi)達(dá)到80%以上；隨著振搖時(shí)間的延長(zhǎng)，子囊孢子的破壁率還可進(jìn)一步提高，最高可達(dá)94.8%。子囊孢子的最佳破壁條件為水浴加熱時(shí)間1.5 h、振搖10 h。

圖6 400倍光學(xué)顯微鏡下玻璃珠振搖法處理的子囊孢子Fig.6 Microscope(400×)photo of ascospores disrupted using glass bead-beating method

表1 不同水浴加熱時(shí)間、振搖時(shí)間對(duì)子囊孢子破壁率的影響Table 1 Effect of different heating time of water bath and shaking time on the breakage rate of ascospores

為了探討玻璃珠振搖法處理的子囊孢子抑菌性能，將60℃水浴加熱1.5 h后再恒溫振搖10 h的樣本，離心取上清液，將上清液濃縮至200 mg/mL，采用1.2.4的方法檢測(cè)其抑菌活性，結(jié)果見圖7。提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有抑制作用，其抑菌圈半徑分別為2.3、2.4 mm。

圖7 冠突散囊菌子囊孢子提取物對(duì)指示菌的抑制作用Fig.7 Antibacterial activities of ascospore extracts obtained using glass bead-beating method

2.2.3 萌發(fā)法破壁冠突散囊菌子囊孢子結(jié)果取30 mL子囊孢子懸液于組織培養(yǎng)瓶中，放于30℃、120 r/min的搖床中振搖培養(yǎng)48 h。每隔3 h取樣測(cè)定子囊孢子的細(xì)胞濃度，得到不同萌發(fā)時(shí)間子囊孢子破壁率，如圖8所示。萌發(fā)法對(duì)冠突散囊菌子囊孢子的破壁率在40%～60%，萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)可增加子囊孢子的破壁率，但萌發(fā)法的破壁率低于玻璃珠振搖法。采用1.2.4中的方法檢測(cè)其提取物的抑菌活性，提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均無明顯的抑制作用，可能是因?yàn)楣谕簧⒛揖咦釉诿劝l(fā)過程中，需消耗部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而這些被消耗的物質(zhì)具有抑菌活性。因此，萌發(fā)法不適合于提取冠突散囊菌有性繁殖體中的子囊孢子抑菌物質(zhì)。

圖8 萌發(fā)法破壁子囊孢子的結(jié)果Fig.8 Results of ascospores disrupted using germination method

3 結(jié)語

作者采用超聲法、玻璃珠振搖法和萌發(fā)法處理冠突散囊菌有性繁殖體，探討不同破壁方法處理冠突散囊菌有性繁殖體所得提取物的抑菌活性。結(jié)果表明：冠突散囊菌子囊果較易破碎，其提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用，最大抑菌圈半徑分別為5.8 mm和12.6 mm；超聲法破碎冠突散囊菌子囊果后，其抑菌性能有所下降，可能是超聲對(duì)抑菌物質(zhì)有破壞作用。子囊果提取物經(jīng)過60℃處理1 h后，其對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈降低至一半[6]，而超聲處理過程會(huì)伴隨溫度的上升，這說明超聲法附帶的升溫現(xiàn)象將破壞子囊果中的抑菌物質(zhì)。因此，玻璃珠振搖法比超聲法更適合于提取冠突散囊菌子囊果中的抑菌物質(zhì)。

子囊孢子比子囊果更難破碎，在相同的超聲條件下（功率360 W，時(shí)間20 min），子囊果可以完全破碎，而子囊孢子的破碎率只有32%。為提高玻璃珠振搖法對(duì)子囊孢子的破壁率，在玻璃珠振搖法處理之前，增加一個(gè)驟變的溫差處理過程，通過這種溫差處理，增加子囊孢子壁的脆性，從而提高破壁率[14]。增加溫差處理后，玻璃珠振搖法對(duì)子囊孢子的破壁率最大，最高可達(dá)到94.8%，其次是超聲法，子囊孢子的破壁率可達(dá)到67.5%，萌發(fā)法對(duì)子囊孢子的破壁率在40%～60%。3種破壁子囊孢子的方法中，只有溫差條件下的玻璃珠振搖法處理子囊孢子后，所得提取物有抑菌活性（金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈半徑分別為2.3、2.4 mm），此外玻璃珠振搖法還具有操作簡(jiǎn)便、高效等優(yōu)點(diǎn)。因此，玻璃珠振搖法是提取冠突散囊菌有性繁殖體中抑菌物質(zhì)的首選方法，具有一定的開發(fā)價(jià)值。

3種方法中，玻璃珠振搖法對(duì)子囊果和子囊孢子的破壁率最高，其提取物的抑菌活性最好。玻璃珠振搖法提取的子囊孢子提取物，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈半徑分別為2.4、2.3 mm；提取的子囊果提取物，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈半徑分別為5.8 mm和12.6 mm。子囊果提取物60℃處理1 h后，其金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈降低至一半[6]，這說明高溫處理能降低子囊果中物質(zhì)的抑菌物質(zhì)活性。造成子囊果提取物抑菌活性強(qiáng)于子囊孢子提取物抑菌活性的原因，可能是由于玻璃珠振搖法處理子囊孢子之前經(jīng)過60℃處理1.5 h，破壞了其中部分抑菌活性物質(zhì)。