蔣容港， 黃 燕， 金友蘭， 李永迪， 黃建安，3， 李 勤*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學 茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學 國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學 植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙410128；4.湖南省益陽茶廠有限公司，湖南 益陽413043）

茯磚茶是以黑毛茶為原料，經(jīng)氣蒸、渥堆、壓磚、發(fā)花（發(fā)酵）和干燥等工序加工而成[1]。“發(fā)花”是茯磚茶獨特的加工工序，其實質(zhì)是通過控制環(huán)境溫濕度促使優(yōu)勢微生物冠突散囊菌（Eurotium cristatum）大量生長繁殖形成“金花”，進而催化茶葉內(nèi)含物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，形成茯磚茶特有的品質(zhì)風味[2]?！敖鸹ā钡臄?shù)量和質(zhì)量是判別茯磚茶品質(zhì)優(yōu)劣的重要特征性指標[3]。

香氣是決定茶葉品質(zhì)最重要的關(guān)鍵因素之一[4-5]。茯磚茶香氣成分以醇類、醛類、酮類等化合物為主[6-10]。茯磚茶特征香氣“菌花香”是一種復(fù)合型香氣類型，是在黑毛茶香氣基礎(chǔ)上，增加了陳香、花香和火功香，最終協(xié)調(diào)而成[11]。有研究表明，經(jīng)“發(fā)花”工序后，茯磚茶中酮類、萜烯醇類、酮類、雜氧類化合物含量顯著增加，推測這些揮發(fā)性成分的增加與茯磚茶特征香氣形成有關(guān)[7，11]。但是，茯磚茶特征香氣的呈香物質(zhì)種類以及來源鮮見詳細報道。

本研究中以茯磚茶及其分離的“金花”菌體和去“金花”純茶為研究對象，采用感官審評、固相微萃?。⊿olid phase microextraction，SPME）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 （Gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）、香氣活力值（Odor active values，OAV）結(jié)合化學計量學方法，研究茯磚茶特征香氣的呈香物質(zhì)及其來源，以期為“菌花香”的形成機制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1 樣品及制備湖南益陽茶廠有限公司生產(chǎn)的機制茯磚茶購于長沙縣星沙鎮(zhèn)三壺茶行。將整塊茯磚茶破碎成小塊，采用茶針將茶葉中“金花”輕輕挑下，使茶葉與“金花”分離，并過100目篩，得到茯磚茶、去“金花”純茶和“金花”菌體3種待測樣品，如圖1所示。

圖1 茯磚茶、去“金花”純茶和“金花”菌體樣品Fig.1 Fu brick tea，tea base without ‘Golden flower’and‘Golden flower’

1.1.2 實驗試劑C8～C40偶數(shù)正構(gòu)烷烴標準品：美國o2si公司產(chǎn)品；癸酸乙酯、1-辛烯-3-醇、苯甲醇、雪松醇、苯甲醛、苯乙酮、β-紫羅酮、水楊酸甲酯：美國Sigma-Aldrich試劑公司產(chǎn)品；α-松油醇、芳樟醇、苯乙醇、香葉醇、己醛、庚醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛、（E）-2-壬烯醛、β-環(huán)檸檬醛、癸醛、2-庚酮、甲基庚烯酮、茶香酮、6-甲基-3，5-庚二烯-2-酮、對甲基苯乙酮、α-紫羅酮、2-十一烷酮、香葉基丙酮、萘、2-甲基萘、1-甲基萘、1，2，3-三甲氧基苯、二苯并呋喃、棕櫚酸乙酯、二氫獼猴桃內(nèi)酯、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚：北京J&K公司產(chǎn)品；香葉酸甲酯：上海安普實驗科技股份有限公司產(chǎn)品；乙醇（色譜純）、氯化鈉：國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 實驗器材7890B/7693型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司產(chǎn)品；手動SPME進樣器、65μm PDME/DVB固相微萃取頭：美國Supelco公司產(chǎn)品；AE240型電子天平：瑞士Mettler公司產(chǎn)品；984TA7CHSEUA型陶瓷加熱面板磁力攪拌器：美國Talboys公司產(chǎn)品；LDP-350型高速多功能粉碎機：浙江永康市紅太陽機電有限公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 感官審評根據(jù)GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》中的方法[12]，由5名專業(yè)人員對樣品的外形、湯色、香氣、滋味進行感官審評。

1.2.2 固相微萃取法參考Xu等的方法[13]。將固相微萃取頭在氣相色譜儀的進樣口經(jīng)250℃老化0.5 h備用；稱取樣品1.000 g置于15 mL頂空瓶中，加入轉(zhuǎn)子，再加入5 mL煮沸去離子水和0.500 g NaCl，然后加入10μL癸酸乙酯（8.64 mg/L）作為內(nèi)標，以帶聚四氟乙烯墊片的蓋子密封，搖勻。放在磁力加熱攪拌器（頂空加熱平臺）上，加熱板溫度60℃，轉(zhuǎn)速600 r/min，將固相微萃取頭插入頂空瓶頂空部位，平衡10 min后推出纖維頭，纖維頭離液面約1 cm，調(diào)整萃取時間和萃取溫度。萃取完成后收回纖維頭，立即插入氣相色譜（GC）進樣口，于230℃下解析5 min。所有樣品重復(fù)3次。

1.2.3 GC-MS分析條件GC條件：色譜柱HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm），載氣為氦氣（純度>99.999%），進樣口溫度250℃，柱流量1 mL/min，脈沖不分流；起始溫度40℃保持3 min，以3℃/min升到80℃，以2℃/min升到90℃，以3℃/min升到150℃，以5℃/min升到180℃，15℃/min升到230℃，保持2 min，溶劑延遲3 min。

MS條件：離子源EI，離子源溫度230℃；接口溫度250℃；EI源能量70 eV；電子倍增器電壓1 104 V；質(zhì)量掃描范圍（m/z）35～400；定量采用選擇離子掃描，每個物質(zhì)選擇一個定量離子，兩個定性離子。

1.2.4 空白基質(zhì)的制備參照Du等的方法，稱取QC樣品50 g于1 L圓底燒瓶，加水300 mL，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在低溫下（40～50℃）不斷補水旋蒸，定時取樣檢測，直至檢測不到揮發(fā)性成分（信噪比<3），冷凍干燥后作為空白基質(zhì)[14]。

1.2.5 定性定量方法

1）定性方法 由GC-MS分析得到各色譜峰的質(zhì)譜信息與NIST17標準譜庫進行檢索比對，匹配指數(shù)大于80%作為物質(zhì)鑒定標準；根據(jù)保留指數(shù)計算公式[15]，結(jié)合保留時間求出各待測物質(zhì)的保留指數(shù)（RI），并通過文獻以及數(shù)據(jù)庫的保留指數(shù)進行鑒定；將待測物質(zhì)的特征離子以及RI與標準品比較進行定性。

2）定量方法 定量標準曲線：采用空白基質(zhì)配制5個不同質(zhì)量濃度的標準品溶液，以標準品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，標準品峰面積與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標，建立標準曲線。34種揮發(fā)性成分的標準曲線R2值為0.990 1～0.999 9，說明建立的標準曲線可以很好地對待測物質(zhì)進行定量分析。將混標溶液用無水乙醇稀釋為一系列質(zhì)量濃度溶液，吸取不同質(zhì)量濃度混標溶液20μL到裝有空白基質(zhì)的頂空瓶中，同時加入20μL內(nèi)標溶液，在優(yōu)化條件下進行萃取，然后經(jīng)GC-MS分析測定。以標準品質(zhì)量濃度為橫坐標，標準品峰面積與內(nèi)標峰面積比為縱坐標，建立標準曲線，通過目標峰面積與內(nèi)標峰面積比值即可算出目標峰質(zhì)量濃度。具有標準品的化合物采用標準曲線外標法定量；對于不具有標準品的物質(zhì)，采用官能團相同、碳原子數(shù)相近的標準品進行估算[16]。

1.2.6 OAV計算OAV為某香氣成分的質(zhì)量濃度與其嗅覺閾值的比值[17]，按下式計算：

式中：C為香氣成分的質(zhì)量濃度，μg/L；OT為該香氣成分的閾值，μg/L。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20數(shù)據(jù)處理軟件（IBM）進行方差分析（Analysis of variance，ANOVA）；采用SIMCA-P 14.1軟件進行主成分分析 （Principal component analysis，PCA）、層序聚類分析（Hierarchical cluster analysis，HCA）和偏最小二乘判別分析（Partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）；P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官審評

感官審評結(jié)果表明（見表1），茯磚茶、“金花”菌體和去“金花”純茶的香氣感官屬性明顯不同。茯磚茶香氣呈現(xiàn)典型的菌花香，帶木香，略帶泥土味；“金花”菌體香氣呈現(xiàn)花香，蘑菇香，略帶菌花香；去“金花”純茶香氣呈現(xiàn)青草氣，帶木香，無菌花香。由此可見，茯磚茶特征香氣“菌花香”是去“金花”純茶和“金花”菌體中呈香揮發(fā)性成分共同作用的結(jié)果，二者對茯磚茶特征香氣的形成均具有重要作用。

表1 感官審評Table 1 Sensory evaluation

2.2 揮發(fā)性成分定性定量分析

定性分析表明（見表2），茯磚茶、去“金花”純茶、“金花”菌體共鑒定59種揮發(fā)性成分，其中醇類化合物13種，酮類化合物16種，醛類化合物9種，碳氫化合物9種，酯類化合物5種，雜氧類化合物3種，酚類化合物1種、吡咯類化合物1種、含氮類化合物1種、內(nèi)酯類化合物1種。

表2 揮發(fā)性成分定性定量Table 2 Identified and quantified of volatile compounds

定量分析表明（見圖2），茯磚茶、去“金花”純茶、“金花”菌體中揮發(fā)性成分質(zhì)量濃度較高的均為醇類化合物，分別含有（1 546.09±16.82）、（1 267.06±40.55）、（2 993.64±167.05）μg/L， 占 比 分 別 為（41.43±0.50）%、（35.58±0.84）%、（53.43±0.22）%；酯類化合物是茯磚茶和“金花”菌體中含量（質(zhì)量濃度）次高的揮發(fā)性成分，分別含有（582.14±14.66）、（1 227.06±25.23）μg/L，占比分別為（15.60±0.41）%、（21.93±0.82）%。而去“金花”純茶中醛類化合物是含量（質(zhì)量濃度）次高的揮發(fā)性成分，含有（662.91±80.87）μg/L，占比（18.58±0.58）%。苯甲醇、二氫獼猴桃內(nèi)酯、水楊酸甲酯、苯乙醇、氧化芳樟醇II、棕櫚酸乙酯、氧化芳樟醇I、芳樟醇、己醛和雪松醇是含量（質(zhì)量濃度）最高的前10種揮發(fā)性化合物。其中，茯磚茶中含量（質(zhì)量濃度）最高的揮發(fā)性成分是水楊酸甲酯，其質(zhì)量濃度達到（444.670±11.335）μg/L，占比 （11.59±0.26）%； 其 次 是 二 氫 獼 猴 桃 內(nèi) 酯（417.627±53.746）μg/L占比（10.89±1.44）%、苯甲醇（318.510±10.921）μg/L（占比（8.51±0.37）%）、氧化芳樟醇Ⅱ（276.493±23.249）μg/L（占比（7.39±0.57）%）和苯乙醇（241.950±15.931）μg/L（占比（6.47±0.47）%）。去“金花”純茶中含量（質(zhì)量濃度）最高的揮發(fā)性成分是二氫獼猴桃內(nèi)酯，其質(zhì)量濃度達到（533.764±23.968）μg/L（占比（14.43±1.01）%）；其次是苯甲醇（291.220±22.865）μg/L（占比（7.86±0.48）%）、水楊酸甲酯（261.959±15.198）μg/L（占比（7.35±0.25）%）、己醛（219.780±41.828）μg/L（占比（6.14±1.00）%）和苯乙醇（213.676±5.412）μg/L（占比（6.00±0.18）%）。“金花”菌體含量（質(zhì)量濃度）最高的揮發(fā)性成分是苯甲醇，其質(zhì)量濃度達到（1 143.638±84.668）μg/L（占比（20.32±0.46）%）；其次是棕櫚酸乙酯（707.180±9.818）μg/L（占比（11.81±2.09）%）、苯 乙 醇 （639.930±61.847）μg/L （占 比 （11.36±0.52）%）、水楊酸甲酯（453.938±34.685）μg/L（占比（8.20±0.25）%）和二氫獼猴桃內(nèi)酯（435.912±17.448）μg/L（占比（7.89±0.16）%）。由此可見，茯磚茶、去“金花”純茶和“金花”菌體三者在揮發(fā)性成分組成上類似，但含量差異較大。

圖2 各類揮發(fā)性成分質(zhì)量濃度（絕對含量）與質(zhì)量分數(shù)相對含量Fig.2 Contents of various volatiles

續(xù)表2

續(xù)表2

2.3 茯磚茶特征香氣呈香物質(zhì)及其來源分析

前人研究認為OAV＞1的揮發(fā)性成分對樣品香氣形成有貢獻，OAV＞10的揮發(fā)性成分被認為是重要香氣成分[18-19]。根據(jù)文獻報道的揮發(fā)性成分的閾值和屬性描述，計算各個差異揮發(fā)性成分的OAV。結(jié)果表明（見表3），共有38種揮發(fā)性成分可計算OAV，茯磚茶中16種揮發(fā)性成分OAV>1，是其特征香氣形成的呈香揮發(fā)性物質(zhì)，分別是苯甲醇、香葉醇、庚醛、1-辛烯-3-醇、芳樟醇、雪松醇、茶吡咯、（E，E）-2，4-辛二烯醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛、β-環(huán)檸檬醛、己醛、D-檸檬烯、α-紫羅酮、β-紫羅酮、苯乙酮和水楊酸甲酯。其中，OAV＞10的化合物有6種，包括OAV最高的雪松醇，達308.81±21.89；其次為芳樟醇（42.45±2.56）、己醛（36.58±0.69）、（E，E）-2，4-辛二烯醛（12.82±0.34）、茶吡咯（12.39±0.71）和水楊酸甲酯（11.12±0.28）。OAV>10的化合物是茯磚茶特征香氣形成的重要呈香揮發(fā)性物質(zhì)。

表3 揮發(fā)性成分OAV和香氣描述Table 3 OAV and aroma attributes of volatile compounds

續(xù)表3

為研究茯磚茶特征香氣中呈香揮發(fā)性成分的來源，采用PCA、HCA、PLS-DA、ANOVA結(jié)合OAV，研究茯磚茶、去“金花”純茶和“金花”菌體中揮發(fā)性成分組成的差異及呈香揮發(fā)性成分的來源。PCA和HCA分析表明（見圖3（a）（b）），茯磚茶、去“金花”純茶和“金花”菌體可明顯分為3組，表明3組樣品間揮發(fā)性成分組成具有顯著差異?；赑CA和HCA結(jié)果，構(gòu)建了PLS-DA模型，擬合參數(shù)R2X=0.972、Q2=0.984，置換檢驗?zāi)Ｐ蚏2=0.662、Q2=-0.181，表明該判別模型有較好的解釋能力，且不存在過擬合現(xiàn)象（見圖3（c）（d））。

圖3 多元統(tǒng)計分析Fig.3 Multivariate statistical analysis

如圖4所示，共篩選了14種差異揮發(fā)性成分（VIP>1且P＜0.05），其中7種差異揮發(fā)性成分屬于茯磚茶呈香揮發(fā)性物質(zhì)（OAV＞1），分別是苯甲醇、水楊酸甲酯、己醛、芳樟醇、雪松醇、（E，E）-2，4-辛二烯醛和1-辛稀-3-醇。具有青草氣屬性的己醛和（E，E）-2，4-辛二烯醛在去“金花”純茶中的含量顯著高于其在“金花”菌體中的含量，且OAV＞10屬重要呈香物質(zhì)，表明茯磚茶特征香氣中的青草氣屬性主要由去“金花”純茶貢獻；而具有花香屬性的苯甲醇和芳樟醇，具有木香屬性的雪松醇，具有冬青香屬性的水楊酸甲酯和具有蘑菇香屬性的1-辛烯-3-醇在“金花”菌體中的含量顯著高于其在去“金花”純茶中的含量，且OAV＞10屬重要呈香物質(zhì)，表明茯磚茶特征香氣中的花香屬性、木香屬性、冬青香屬性和蘑菇香屬性主要由“金花”菌體貢獻。此外，茯磚茶呈香揮發(fā)性成分中具有花香屬性的香葉醇、α-紫羅酮、β-紫羅酮和苯乙酮，具有青草氣屬性庚醛和（E，E）-2，4-庚二烯醛，具有果香屬性的β-環(huán)檸檬醛和D-檸檬烯，具有烘烤香屬性的茶吡咯對茯磚茶特征香氣形成也有貢獻，但其含量在“金花”純茶和“金花”菌體中無顯著性差異，可能起一定的協(xié)調(diào)作用。

圖4 茯磚茶、去“金花”純茶和“金花”菌體間差異揮發(fā)性成分熱圖Fig.4 Heatmap of the differential volatile compounds among Fu brick tea，tea base without‘Golden flower’and‘Golden flower’

3 結(jié) 語

茶葉香氣是由眾多特征香氣組分按照一定比例相互作用形成的整體感官感受，其表現(xiàn)受香氣組分種類、含量、閾值以及相互作用效應(yīng)等多種因素的影響[20]。本研究中將具有典型“菌花香”的茯磚茶中的“金花”菌體去除后，剩余的去“金花”純茶樣品無“菌花香”。GC-MS分析發(fā)現(xiàn)，茯磚茶、去“金花”純茶和“金花”菌體揮發(fā)性成分組成相似，但各揮發(fā)性成分間含量差異較大，可能是因為茶葉本身吸附香氣的屬性導(dǎo)致其吸附了“金花”菌體中部分的揮發(fā)性成分，或去“金花”純茶樣品中還含有部分肉眼無法察覺的少量“金花”菌體造成。

茶葉中香氣提取方法主要有同時蒸餾萃取法（Simultaneous distillation and solventextraction，SDE）、 減 壓 蒸 餾 萃 取 法 （Vacuum distillation extraction，VDE）和固相微萃取法等。本研究中采用的是固相微萃取法，相比其他香氣提取方法更能體現(xiàn)茶葉的固有香氣，且無有機溶劑干擾，但其缺點是無法自動進樣以及不同材質(zhì)的萃取纖維對茶葉的吸附能力不一致，可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)分析時香氣組成比例失衡[21]。

前人研究推測，茯磚茶“菌花香”是在黑毛茶原有香型的基礎(chǔ)上再添加花香、陳香和火功香等最終協(xié)調(diào)形成的“菌花香”[2，11]。本研究中基于OAV分析法，鑒定了16種茯磚茶呈香揮發(fā)性成分，主要以青草氣屬性、木香屬性和花香屬性物質(zhì)為主，與其他學者研究結(jié)果相同[9，22]。進一步采用化學計量學方法篩選出14種差異揮發(fā)性成分，其中7種差異揮發(fā)性成分屬于茯磚茶呈香物質(zhì)且在去“金花”純茶和“金花”菌體中含量差異顯著，包括“金花”菌體中富含苯甲醇、芳樟醇、雪松醇、1-辛稀-3-醇和水楊酸甲酯，主要貢獻了茯磚茶的花香、木香、蘑菇香和冬青香屬性。花香屬性的芳樟醇及其氧化產(chǎn)物、苯甲醇和冬青油香藥香型的水楊酸甲酯被認為是茯磚茶“菌花香”的關(guān)鍵成分[9，23]，且芳樟醇及氧化芳樟醇的增加與茯磚茶、普洱茶發(fā)酵過程中真菌生長密切相關(guān)[7，24]。雪松醇是普洱茶或陳茶中木香和陳香的主要成分[25-26]，而蘑菇香型、脂香型的1-辛烯-3-醇是微生物酶氧化裂解亞油酸的真菌次生代謝產(chǎn)物[27-28]，對茯茶特征香氣的形成也具有重要貢獻[29]。而去“金花”純茶中富含己醛和（E，E）-2，4-辛二烯醛，主要貢獻了“菌花香”的青草氣屬性。己醛和（E，E）-2，4-辛二烯醛是茶葉中常見的青草氣成分，也是茯磚茶和普洱茶中青草氣的主要來源[2，14]。茯磚茶其他成分作為茯磚茶的基質(zhì)，也可通過間接和協(xié)同作用促進茶香味的形成[30]。此外，已鑒定的揮發(fā)性物質(zhì)中有部分化合物由于閾值缺乏或未知，無法利用OAV法衡量其對茯磚茶特征香氣的貢獻，需進一步研究?？傊?，茯磚茶特征香氣是在“金花”菌體和去“金花”純茶中揮發(fā)性成分的共同作用下形成的，二者缺一不可。