肖晗汕，李滔滔*，湯涵，陳怡，汪無忌，劉純，胡治遠，余松林，文瑞明，劉石泉

1(湖南城市學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 益陽，413000)2(黑茶金花湖南省重點實驗室(湖南城市學(xué)院)，湖南 益陽，413000)

冠突散囊菌[1-2]又稱金花菌，因其在茯磚茶中可形成顆粒飽滿的子囊果[3-5]，類似金花而得名。冠突散囊菌的生長狀況是評價茯磚茶品質(zhì)的理化指標(biāo)之一，已列入國家標(biāo)準(zhǔn)。且前研究表明，茯磚茶具有多種功效，包括抗氧化、降血脂和降血糖等[6-11]。在茯磚茶發(fā)花過程中，冠突散囊菌大量生長[12-14]，其他微生物受到一定的抑制，提示冠突囊菌在生長階段產(chǎn)生具有抑菌活性的物質(zhì)；同時長期保存的茯磚茶較少出現(xiàn)雜菌污染的情況，提示茯磚茶中的金花可持續(xù)提供抑菌物質(zhì)。目前已證實金花菌發(fā)酵液有一定的抑菌活性[15-16]，其提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏桿菌、枯草芽孢桿菌與白色鏈霉菌有抑制作用?，F(xiàn)有文獻大都集中在金花菌發(fā)酵液和茯磚茶[17-20]的抑菌效果研究，但對冠突散囊菌的繁殖體(子囊果、子囊孢子和分生孢子)提取物抑菌活性的研究較少。本論文采用玻璃珠振搖法破碎金花菌繁殖體，獲得相應(yīng)提取物，探討其對金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色鏈霉菌和白色念珠菌的抑菌活性，同時為茯磚茶較難染菌，金花菌天然抗菌劑的開發(fā)和利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

冠突散囊菌(JH1205)由黑茶金花湖南省重點實驗室提供。

1.2 設(shè)備與試劑

BBS-DDC超凈工作臺，山東博科；HWS-100F恒溫培養(yǎng)箱，上海丙林；R-3001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長城科工；YKW-303臺式恒溫振蕩器，上海程造；BKQ-Z30I立式壓力蒸汽滅菌鍋，山東博科。

瓊脂(不含抗生素)、蔗糖、NaCl、蛋白胨、土豆等(除蛋白胨，土豆外均為分析純)。

1.3 實驗方法

1.3.1 冠突散囊菌中子囊果與分生孢子的獲得

子囊果的獲得：分別將制備好的金花散茶和儲存6年的金花散茶過100目篩，篩選分離獲得。

參照劉作易等的研究[21]，微調(diào)冠突散囊菌產(chǎn)分生孢子的條件，在高滲液體培養(yǎng)基中接種金花菌孢子懸液，于36 ℃靜置培養(yǎng)4 d，再用無菌水沖洗菌膜上的分生孢子，獲得冠突散囊菌分生孢子懸液；高滲培養(yǎng)基為添加10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl和20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蔗糖的PDA培養(yǎng)基。

1.3.2 冠突散囊菌中子囊果、子囊孢子與分生孢子中抑菌物質(zhì)的提取

子囊果中抑菌物質(zhì)的提?。悍Q2 g子囊果裝入錐形瓶中，加30 mL 蒸餾水和玻璃珠若干(玻璃珠鋪滿瓶底)，置于180 r/min搖床中振搖120 min。將破碎后的子囊果溶液在4 000 r/min的條件下離心10 min，保留上清液(此為子囊果提取物)；將沉淀物用蒸餾水清洗后，加蒸餾水溶解制成懸濁液，再用4層紗布過濾獲得子囊孢子懸濁液，調(diào)節(jié)子囊孢子濃度為10-7個/mL，加入玻璃珠后置于-18 ℃冰箱冷凍1 d，再60 ℃水浴加熱1.5 h，取出置于180 r/min搖床中振搖10 h，4 000 r/min離心10 min，保留上清液(此為子囊孢子提取物)。

分生孢子中抑菌活性物質(zhì)的提?。禾崛》椒ê妥幽益咦又谢钚晕镔|(zhì)的提取一致。

所有提取物濃縮至100 mg/mL進行抑菌實驗。

1.3.3 抑菌實驗

將滅菌后的濾紙片浸入濃縮后的提取物中，浸泡15 min，瀝干，置于涂布有0.3 mL供試菌(新鮮培養(yǎng)菌種，OD值為0.4)的BL(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)平板中，恒溫培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈的大小，平行測定3次。供試菌為金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌，此4種菌培養(yǎng)溫度為37 ℃；白色念珠菌和白色鏈霉菌，此2種菌培養(yǎng)溫度為30 ℃。

1.3.4 穩(wěn)定性實驗

1.3.4.1 溫度穩(wěn)定性

取適量子囊果提取物，分別置于室溫(25 ℃)、40、60、80、100、121 ℃下分別處理1 h，冷卻至室溫后，以未處理的樣品為對照，以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為供試菌，用1.3.3中方法驗證其抑菌活性的變化，每個處理重復(fù)3次，將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈半徑。

1.3.4.2 pH值穩(wěn)定性

取適量子囊果提取物，采用1 mol/L HCl溶液和NaOH溶液分別調(diào)pH值至2、4、6、8、10，放置2 h，以未處理的樣品為對照，以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為供試菌，用1.3.3方法驗證其抑菌活性的變化，每個處理重復(fù)3次，將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈半徑。

1.3.4.3 紫外光穩(wěn)定性

取適量子囊果提取物，置于30 W紫外燈下，距離30 cm，照射發(fā)酵液濃縮液1、2、3、4、5 h，以未處理的樣品為對照，以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為供試菌，用1.3.3中方法驗證其抑菌活性的變化，每個處理重復(fù)3次，將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈半徑。

1.3.5 冠突散囊菌子囊果提取物不同濃度下的抑菌實驗

按1.3.3中所述實驗方法，將浸泡不同濃度子囊果提取物的濾紙片，置于涂布有0.3 mL供試菌的BL培養(yǎng)基平板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈的大小，平行測定3次。供試菌為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 冠突散囊菌觀察

按1.3.1中實驗方案分離得到冠突散囊菌的子囊果、子囊孢子和分生孢子，并進行觀察，結(jié)果如圖1所示。冠突散囊菌的繁殖方式分為無性繁殖和有性繁殖2種方式，有性繁殖時產(chǎn)生大量黃色閉囊殼(子囊果)，外表纏繞有大量營養(yǎng)菌絲，子囊果破裂，釋放子囊孢子；無性繁殖時只產(chǎn)生分生孢子。在普通培養(yǎng)基中，冠突散囊菌進行有性繁殖，形成表面粗糙而致密的金黃色菌膜(圖1-a)；在高滲液體培養(yǎng)基中，冠突散囊菌進行無性繁殖，生成緊致而細(xì)密的灰白色菌膜，表面相對有性型較為光滑(圖1-b)。冠突散囊菌在茶葉基質(zhì)中，以有性繁殖為主，在茶葉基質(zhì)表面形成大量的金黃色顆粒，此為冠突散囊菌的子囊果(圖1-c)。從液體培養(yǎng)基上的菌膜顏色，即可區(qū)分冠突散囊菌的繁殖方式。光鏡觀察下，子囊孢子與分生孢子形態(tài)基本一致，均為球形或橢球形(圖1-d、圖1-e)。

a-有性菌體(子囊果);b-無性菌體(分生孢子);c-長滿子囊果的散茶;d-光鏡下子囊孢子;e-光鏡下分生孢子圖1 冠突散囊菌不同繁殖體圖片F(xiàn)ig.1 The picture of eurotium cristatum propagule

2.2 冠突散囊菌子囊果、子囊孢子和分生孢子提取物的抑菌活性

由表1可知，冠突散囊菌的無性繁殖體和有性繁殖體的提取物表現(xiàn)出截然不同的抑菌活性，無性繁殖體(分生孢子)提取物對6種供試菌均未檢測到抑菌活性，而有性繁殖體子囊果和子囊孢子提取物，具有明顯的抑菌活性。子囊果提取物和子囊孢子提取物對6種供試菌的抑菌能力有所差別，其中子囊果提取物的抑菌效果更好，例如子囊果提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌全半徑最大可達到5.8 mm，子囊孢子對其抑菌圈半徑為2.7 mm。

表1 子囊果、子囊孢子及分生孢子提取物對供試菌的抑菌圈半徑 單位：mm

子囊果和子囊孢子提取物對不同微生物的抑制作用有很大區(qū)別，對金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、白色鏈霉菌和大腸桿菌的抑制效果最好；對枯草芽孢桿菌和白色念珠菌的抑制效果較弱。金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌和枯草芽孢桿菌均為革蘭氏陽性菌，枯草芽孢桿菌的抑菌圈半徑最大為0.9 mm，而金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌的抑菌圈半徑最大為5.8 mm；大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，其最大抑菌圈半徑可達5.8 mm，這說明子囊果和子囊孢子提取物的抑菌作用不依賴于微生物細(xì)胞壁的組成。

冠突散囊菌子囊果儲存時間對其抑菌活性有顯著影響。隨著儲存時間(6年)的延長，子囊孢子提取物對金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌和大腸桿菌的抑制作用基本不變，但對白色鏈霉菌的抑制作用增強了2倍(抑菌圈半徑從2.2 mm增加至4.5 mm)，對枯草芽孢桿菌和白色念珠菌的抑制作用則消失。除了白色念珠菌，陳年子囊果的提取物對其余5種供試菌的抑菌活性均比新鮮子囊果提取物的抑菌活性更強，這說明在長時間的儲存過程中，子囊果中積累了更多或更有效的抑菌活性物質(zhì)。

2.3 冠突散囊菌子囊果中抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性

2.3.1 熱穩(wěn)定性

由表2可知，經(jīng)不同溫度處理的金花菌子囊果提取物仍對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有抑制作用；隨著處理溫度的升高，其對金黃色葡萄球菌的抑制作用逐漸降低，且降低幅度較大，當(dāng)121 ℃處理1 h后，其抑菌圈半徑從6.0 mm降低到1.5 mm，降低幅度為75%。隨著溫度的升高，子囊果提取物對大腸桿菌的抑制作用也有所降低，但相對于金黃色葡萄球菌，其降低幅度更小(抑菌圈半徑從4.7 mm降低到2.4 mm，降低幅度為49%)，這說明金花菌子囊果中可抑制大腸桿菌的物質(zhì)具有更好的熱穩(wěn)定性。

表2 金花菌子囊果提取物的熱穩(wěn)定性 單位：mm

2.3.2 酸堿穩(wěn)定性

金花菌子囊果提取物初始 pH值為6，其對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為5.7 mm，對大腸桿菌的抑菌圈直徑為3.5 mm，由表3可知，經(jīng)過不同pH值的酸堿處理后，金花菌子囊果提取物仍對大腸桿菌有抑制作用；僅在酸性條件下，對金黃色葡萄球菌有抑制作用。pH值為4 時，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑均為最大，說明在pH 值低于原液的酸性條件下，其中的抑菌物質(zhì)作用隨pH 值降低而明顯增強。金花菌子囊果提取物中對金黃色葡萄球菌有抑制作用的物質(zhì)具有一定的耐酸能力，耐堿能力弱。

表3 金花菌子囊果提取物的酸堿穩(wěn)定性 單位：mm

pH為2的子囊果提取物對大腸桿菌的抑菌圈直徑為對照組的1.29倍，pH為4的子囊果提取物對大腸桿菌的抑菌圈直徑為對照組的1.34 倍，說明在pH 值低于原液的酸性條件下，其中對大腸桿菌的抑菌物質(zhì)作用有所增強，當(dāng)pH 值<4 時，抑菌作用亦隨pH 值降低而減弱；在堿性條件下，其抑菌作用減弱，由此可見，金花菌子囊果提取物中對大腸桿菌有抑制作用的物質(zhì)具有一定的耐酸堿能力，有較強的耐酸能力。

2.3.3 紫外光穩(wěn)定性

由表4可知，金花菌子囊果提取物經(jīng)過不同時間紫外光照射后，其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用的變化有所不同。對于金黃色葡萄球菌，在紫外線照射子囊果提取物2 h后，其抑菌活性開始下降，但隨著照射時間繼續(xù)延長至5 h，其抑菌活性無明顯的降低，表明子囊果提取物中能抑制金黃色葡萄球菌生長的物質(zhì)具有一定的紫外線穩(wěn)定性。

表4 金花菌子囊果提取物的紫外光穩(wěn)定性 單位：mm

對于大腸桿菌，在紫外線照射子囊果提取物4 h后，其抑菌活性開始下降，再繼續(xù)延長照射時間至5 h，其抑菌活性基本不變，表明子囊果提取物中能抑制大腸桿菌生長的物質(zhì)比抑制黃色葡萄球菌生長的物質(zhì)，具有更好的紫外線穩(wěn)定性。

2.3.4 冠突散囊菌子囊果提取物不同質(zhì)量濃度下的抑菌效果

圖2為冠突散囊菌子囊果提取物不同質(zhì)量濃度時，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用，由圖2可知，隨著提取物質(zhì)量濃度的降低，所測得抑菌圈半徑越來越小，說明抑菌效果越來越差。當(dāng)提取物質(zhì)量濃度降低至20 mg/mL，抑菌圈消失，這說明用冠突散囊菌子囊果提取物做抑菌劑時，需調(diào)節(jié)其質(zhì)量濃度>20 mg/mL。

圖2 冠突散囊菌子囊果提取物對金黃色葡萄糖球菌和大腸桿菌的抑菌圈半徑Fig.2 The radius of inhibition cycle of Eurotium cristatum extract on Escherichia coli and Staphylococcus aureus

3 結(jié)論

本文研究了冠突散囊菌繁殖體中提取物質(zhì)的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)其有性繁殖體(子囊果和子囊孢子)提取物對細(xì)菌、真菌、放線菌有抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌和大腸桿菌的抑制效果最好；無性繁殖體(分生孢子)提取物未檢測到抑菌活性。子囊果提取物的抑菌活性強于子囊孢子提取物；隨著儲存時間的增加，子囊果中提取物的抑菌活性得到增強，子囊孢子中提取物的抑菌活性基本不變。研究還表明，抑菌物質(zhì)有良好的紫外線穩(wěn)定性和一定的熱穩(wěn)定性，在酸性條件下抑菌物質(zhì)的抑菌活性保持不變，甚至增強，這有利于抑菌物質(zhì)添加在果汁等酸性飲料中，有利于用于酸性飲料的冠突散囊菌天然防腐劑應(yīng)用開發(fā)。