徐亞男, 楊秋霞, 賈澤峰

(1. 聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252059；2. 中國科學(xué)院微生物研究所真菌學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101)

皰衣屬[Phlyctis(Wallr.) Flot.]為地衣型真菌，隸屬于真菌界(Fungi)子囊菌門(Ascomycota)茶漬綱(Lecanoromycetes)厚頂盤目(Ostropales)皰衣科(Phlyctidaceae)。該屬在世界上分布較為廣泛，主要分布于熱帶與亞熱帶地區(qū)，目前全世界已報(bào)道該屬有25種[1]。1850 年，F(xiàn)lotow 以Phlyctis agelaea(Ach.) Flot.為模式種界定了皰衣屬[2]?！吨袊匾戮C覽》收錄中國該屬4 種[3]，之后又報(bào)道了1 種[2]，主要分布在云南[4]、香港[5-6]、臺(tái)灣[7]、湖北[8]和甘肅[2,9]等地區(qū)。

皰衣屬地衣的特征是地衣體殼狀，樹皮生或石生，表面光滑至具有裂縫，常具初生地衣體；子囊盤通常深陷于地衣體中，近埋生或貼生，常帶有白色粉霜；側(cè)絲單一，頂端相互交織，少有分叉；子囊長橢圓狀至棍棒狀，內(nèi)含1~8 個(gè)孢子；子囊孢子無色透明，橫隔多胞或磚壁型。光合共生藻為綠藻[10-11]。

本研究基于形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、化學(xué)、分子生物學(xué)和生物地理學(xué)等方法，對(duì)中國皰衣屬地衣進(jìn)行初步研究，報(bào)道中國一新記錄種：類喜馬拉雅皰衣(Phlyctis subhimalayensisS. Joshi & Upreti)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

研究標(biāo)本采集地為云南，現(xiàn)保藏于中國科學(xué)院微生物研究所菌物標(biāo)本館HMAS-L、山東師范大學(xué)植物標(biāo)本室(SDNU)、Korean Lichen Research Institute (KoLRI)和荷蘭CBS 標(biāo)本室(ABL)。

1.2 表型研究

在體視顯微鏡(Motic SMZ-168 和LEICA M125)下觀察外部形態(tài)并拍照。在光學(xué)顯微鏡(Zeiss Axioscope 2)下對(duì)子囊器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察并拍照。化學(xué)特征：利用顏色反應(yīng)，使用K 試劑(10%氫氧化鉀水溶液)、C 試劑(次氯酸鈉水溶液)和P 試劑(將對(duì)苯二胺溶于無水乙醇，配成5%乙醇溶液)進(jìn)行測試;使用標(biāo)準(zhǔn)的薄層色譜法(TLC)檢測地衣中所含次生代謝物，溶劑系統(tǒng)為C 系統(tǒng)[12-14]。

1.3 基因型研究

DNA的提取擴(kuò)增和測序采用CTAB 法從皰衣屬標(biāo)本的子囊組織中提取總DNA[15]，采用PCR擴(kuò)增核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS)，引物為ITS5/ITS4[16]。反應(yīng)體系總體積為25μL，包括正反向引物各1μL，模板DNA 2μL，ddH2O 8μL 和2×TaqPCR MasterMix?13μL。擴(kuò)增程序[17]為：95 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃1 min，共34 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并由天一輝遠(yuǎn)(北京)生物有限公司進(jìn)行測序。因研究標(biāo)本較陳舊，因此，對(duì)同一份標(biāo)本提取DNA 2 次，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序，并作為2 條單獨(dú)的ITS 序列應(yīng)用于該屬的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建(表1)。

表1 地衣標(biāo)本信息和ITS 序列的GenBank 登錄號(hào)Table 1 Lichen specimen information and GenBank accession No.

系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建通過查閱文獻(xiàn)，在NCBI網(wǎng)站下載20 條序列，與本研究的2 條皰衣屬序列,共22 條序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以皰衣科親緣關(guān)系較近的凹盤衣科(Gyalectaceae)的Gyalecta屬為外群[18]。使用BioEdit V 7.0.5 中的ClustalW Multiple Alignment 利用最大似然法(Maximum-likelihood,ML)進(jìn)行比對(duì)[19-20]，使用在線網(wǎng)站Cipres Science Gateway (http://www.phylo.org)中的RAxML HPC V.8.2.6 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[21]，運(yùn)算方法選擇GTR+I+G模型，每個(gè)節(jié)點(diǎn)設(shè)置1 000 次重復(fù)以評(píng)價(jià)自展支持值。獲得的系統(tǒng)樹文件在FigTree V. 1.4.2 中查看和編輯，自展支持值(bootstrap)≥75%的分支可信(圖1)。

圖1 基于ITS 序列構(gòu)建的皰衣屬系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Phlyctis based on ITS sequences

2 結(jié)果和分析

2.1 類喜馬拉雅皰衣 (新擬) 圖2

圖2 類喜馬拉雅皰衣(HMAS-L 105300)。A: 地衣體和子囊器；B: 子囊及子囊孢子; C: 子囊孢子。標(biāo)尺: A=0.5 mm; B=20 μm; C=10 μmFig. 2 Phlyctis subhimalayensis (HMAS-L 105300). A: Thallus with ascomata; B: Ascuswith ascospores; C: Ascospores. Bars: A=0.5 mm; B=20 μm; C=10 μm

Phlyctis subhimalayensisS. Joshi & Upreti,Lichenologist 44(3): 365 (2012)

地衣體殼狀，上表面白色或灰白色，平滑且連續(xù)，無粉芽及裂芽，無前地衣體；共生藻為綠藻。子囊器為子囊盤，埋生于地衣體內(nèi)，子囊盤數(shù)量較多，直徑0.2~0.5 mm，呈分散狀或2~3 個(gè)聚集在一起，近似圓形或拉長到角狀，盤面呈黑色，圓形至不規(guī)則，平至凹狀，具有白色粉霜，邊緣灰白色,且呈葉片狀。囊層基呈淺褐色至淺黃色，子實(shí)層無色，I-；側(cè)絲較為簡單，頂端相互交織，且不腫脹, 無分叉；子囊棍棒狀，8 個(gè)孢子，60~73μm×12~16μm，I-；子囊孢子無色透明，梭形，具5~7橫隔, 37~45μm×4~6μm，I-。

化學(xué)反應(yīng)：地衣體K-，C-，KC-，P-；未檢測到地衣次生代謝產(chǎn)物。

基物：樹皮。

研究標(biāo)本：云南，楚雄市，附近山上，海拔2 200 m；2002-10-26，任強(qiáng)301 (HMAS-L105300)。

世界分布：印度的喜馬拉雅山北部和東部[22]。

討論：該種主要特征為地衣體表面無粉芽，子囊盤表面帶有白色粉霜，子囊8 個(gè)孢子，孢子橫隔型，具有5~7 個(gè)橫隔，囊層基呈淺褐色至淺黃色, 無地衣次生代謝產(chǎn)物。在圖1 中，P. subhimalayensis的2 條自測序列完全一致，能夠完好代表標(biāo)本HMAS-L 105300。分子數(shù)據(jù)分析表明，該種與Phlyctis屬其他物種很好的聚為一單系分支，支持值高達(dá)99%;且與Phlyctis屬其他物種明顯分開，作為獨(dú)立分支,因此鑒定為P. subhimalayensis。

該種與P. himalayensis(Nyl.) D. D. Awasthi 和P. karnatakanaS. Joshi & Upreti 較為相似，子囊孢子具有7 個(gè)橫隔，但在子囊孢子的大小和地衣次生代謝產(chǎn)物方面明顯區(qū)分于后兩者，P. karnatakana的子囊孢子25~35μm×4~7μm，P. himalayensis的子囊孢子60~75μm×18~24μm，二者地衣體均遇K+紅色，P. himalayensis具有未知的地衣化合物，P.karnatakana具有降斑點(diǎn)酸(norstictic acid)[23-24]。此外，該種還與P. megalospora(P. James) D. J. Galloway & G. Guzmán 具有相似之處，這2 種的子囊孢子均呈橫隔型，然而P. megalospora的孢子大小為285~390μm×79~95μm，且地衣體含斑點(diǎn)酸(stictic acid)和茶痂衣酸(psoromic acid)[10]。

2.2 中國已報(bào)道皰衣屬物種

亮皰衣Phlyctis argena(Ach.) Flot., Bot. Ztg. 8:572 (1850)

地衣體殼狀，表面被粉芽堆覆蓋，帶有白色粉霜，聚集在地衣體表面。子囊盤不常見，子囊單孢，子囊孢子無色透明，磚壁型，100~150μm×25~50μm。含有降斑點(diǎn)酸。

研究標(biāo)本：臺(tái)灣，南投縣河谷，950 m，Aptroot 52055、53436 (ABL)。

基物：樹皮。分布：臺(tái)灣[6]。

討論：該種主要特征是地衣體具有豐富的粉芽；子囊盤不常見；子囊單孢，子囊孢子磚壁型,大小100~150μm×25~50μm。本種與P. agelaea、P. speirea、P. karnatakana和P. subargena相似，如子囊盤表面都具有白色粉霜，含有降斑點(diǎn)酸，但這4 種地衣體表面均無豐富的粉芽[2,5,9,24]。

卡納皰衣Phlyctis karnatakanaS. Joshi &Upreti, Bryologist 113(4): 726 (2010)。

地衣體殼狀，樹皮生。子囊盤直徑為0.4~0.5μm,具有輕微粉霜，子囊棒狀，含有8 個(gè)孢子，子囊孢子透明，橫隔型，25~35μm×4~7μm，含有降斑點(diǎn)酸。

研究標(biāo)本：云南，普洱市國家森林公園, 1 552 m,王欣宇CH130421 (KoLRI 020827)。

基物：樹皮。

分布：云南[2]。

討論：該種的子囊孢子具有7 個(gè)橫隔，與P.himalayensis和P. longifera(Nyl.) D. J. Galloway &Guzmán 相似，但后兩者具有較大的子囊孢子，分別為60~75μm×6~8μm 和55~86μm×5~7μm，且地衣體含有斑點(diǎn)酸[10,23]。該種在孢子橫隔型與P. uncinata和P. communisChitale & Makhija 相近，不同點(diǎn)在于P. uncinata的子囊孢子50~54μm×5~7μm, 具有8 個(gè)橫隔；P. communis的子囊孢子具有7~16 個(gè)橫隔，含有斑點(diǎn)酸和水楊嗪酸(salazinic acid)[25-26]。

裂皰皰衣Phlyctis schizosporaZahlbr., in Handel-Mazzetti, Symb. Sinic. 3: 178 (1930)

地衣體殼狀，灰色至淡灰綠色，子囊盤直徑0.3~0.6 mm；子囊棒狀，含有單孢；子囊孢子褐色，磚壁型，73~85μm×25~37μm。未檢測到地衣次生代謝產(chǎn)物。

研究標(biāo)本：湖北，神農(nóng)架，2 900 m，魏江春和陳建斌10896 (HMAS-L)。

基物：竹子。

分布：湖北[7]。

討論：該種主要特征為地衣體不含地衣次生代謝產(chǎn)物，與本研究中的新記錄種P. subhimalayensis較為相似，但后者的子囊含有8 個(gè)孢子，且子囊孢子橫隔型，37~45μm×4~6μm[22]。

灰色皰衣Phlyctis speireaG. Merr., Ottawa Nat.27(9): 118(1913)

地衣體殼狀，子囊盤直徑0.3~0.5 mm，通常具有白色粉霜，子囊橢圓形，含有單孢或2 個(gè)孢子,子囊孢子無色透明，磚壁型，40~80μm×25~35μm,I-。含有降斑點(diǎn)酸。

研究標(biāo)本：甘肅，文縣邱家壩，2 620 m，楊芳20070197、20070443、20070451 (SDNU)。

基物：樹皮。

分布：甘肅[2]。

討論：該種主要特征是子囊盤表面黑褐色, 具有白色粉霜，子囊單孢或2 個(gè)孢子，子囊孢子磚壁型，40~80μm×25~35μm，含有降斑點(diǎn)酸。該種與P. communisChitale & Makhija 較為相似，表面均呈灰色，具有白色粉霜，子囊盤埋生在地衣體中，但P. communis子囊含有8 個(gè)孢子，子囊孢子橫隔型，18~33(~45)μm×6~9μm，含有降斑點(diǎn)酸和水楊嗪酸[26]。

亞亮皰衣Phlyctis subargenaR. Ma & H. Y.Wang, Mycotaxon 114: 362 (2010)

地衣體殼狀。子囊盤直徑0.1~0.3 mm，通常3~8(~10)聚集在一起，盤面紅褐色，具有白色粉霜；子囊棒狀，含有2 個(gè)孢子；子囊孢子透明，磚壁型，42~78μm×30~42μm。含有降斑點(diǎn)酸。

研究標(biāo)本：甘肅，文縣邱家壩，2 450 m，楊芳20070024、20070045、20070381 (SDNU)。

基物：樹皮。

分布：甘肅[9]。

討論：該種地衣體表面嚴(yán)重粉芽化，子囊含有2 個(gè)孢子，含有降斑點(diǎn)酸。皰衣屬中含有降斑點(diǎn)酸的物種有6 種，分別是：P.agelaea(Ach.) Flot.、P.chilensisD. J. Galloway & Guzmán、P. speireaG.Merr.、P. uncinataStirt.、P. argena(Ach.) Flot.和P.karnatakanaS. Joshi & Upreti，他們各具明顯不同特征：P.agelaea地衣體表面無粉芽；P. chilensis子囊單孢，子囊孢子磚壁型，(190~)230~270(~285)μm×55~70μm；P. speirea子囊單孢或2 個(gè)孢子，子囊孢子磚壁型，40~80μm×25~35μm；P. uncinata子囊8 個(gè)孢子，子囊孢子橫隔型，50~54μm×5~7μm;P.argena子囊盤較為稀少，子囊單孢，子囊孢子100~150μm×25~50μm[2,5,10,24-25]。

中國皰衣屬分種檢索表

1a. 子囊孢子磚壁型 ····································································································································· 2

1b. 子囊孢子橫隔型 ···································································································································· 5

2a. 地衣體含地衣次生代謝產(chǎn)物······················································································································ 3

2b. 地衣體未檢測到地衣次生代謝產(chǎn)物，子囊孢子73~85μm×25~37μm ··································· 裂皰皰衣P. schizospora

3a. 地衣體表面具有豐富的粉芽······················································································································ 4

3b. 地衣體表面無粉芽 ·········································································································· 灰色皰衣P. speirea

4a.子囊含2 個(gè)孢子，子囊孢子42~78μm×30~42μm ······························································· 亞亮皰衣P. subargena

4b.子囊含單孢子，子囊孢子100~150μm×25~50μm ······································································ 亮皰衣P. argena

5a. 子囊層I+紫紅色，子囊孢子100~120μm×10~15μm ······················································· 卡納皰衣P. karnatakana

5b. 子囊層I-，子囊孢子60~73μm×12~16μm ······················································類喜馬拉雅皰衣P. subhimalayensis

致謝感謝中國科學(xué)院微生物研究所菌物標(biāo)本館的鄧紅高級(jí)實(shí)驗(yàn)師在借閱標(biāo)本方面提供幫助；中國科學(xué)院微生物研究所魏江春課題組的任強(qiáng)研究員提供樣品，魏鑫麗研究員對(duì)本文提出了寶貴建議。