陳志健 繆祿聲 袁浩南 張旺發(fā) 孔連廣 魏宜勝

【關(guān)鍵詞】結(jié)直腸癌;增殖;遷移;長鏈非編碼RNA;癌基因SEI1;

結(jié)直腸癌是常見的消化道腫瘤之一，其發(fā)病率、病死率高且逐年上升，預(yù)后較差[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因，因而探究結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為結(jié)直腸癌靶向治療提供科學(xué)基礎(chǔ)，對于提高結(jié)直腸癌的治愈率至關(guān)重要。然而，目前仍未完全清楚結(jié)直腸癌腫瘤進(jìn)展的具體機(jī)制。據(jù)相關(guān)研究，已知在這一過程中涉及到多基因的異常表達(dá)，如PIK3CA的基因突變、癌基因Ras的激活、抑癌基因p53的失活等，這些都是編碼蛋白的基因[2-4]。此外，尚有不編碼蛋白質(zhì)的RNA，稱為非編碼RNA（ncRNA），在結(jié)直腸癌進(jìn)展過程中起重要的調(diào)控作用[2]。

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類位于胞漿或細(xì)胞核部分、長度大于200個核苷酸的RNA，lncRNA基本不參與編碼蛋白，也屬于ncRNA，可通過參與遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多個層面調(diào)節(jié)疾病的發(fā)生、發(fā)展[5]。相關(guān)研究表明，lncRNA廣泛參與生理和病理各個過程，特別在癌癥中具有重要的調(diào)節(jié)作用[6]。癌基因SEI1（又名SERTAD1或TRIP-Br1）是一個位于19q13.1至19q13.2的細(xì)胞周期調(diào)控基因，在許多癌癥中該基因均有異常表達(dá)。SEI1基因產(chǎn)物p34SEI1是Sertad家族的一部分，它是一種周期蛋白依賴激酶4（CDK4）結(jié)合蛋白，通過促進(jìn)CDK4–CCND復(fù)合物的締合和刺激CDK4的活性來對抗p16對細(xì)胞周期進(jìn)程的抑制活性[7-8]。相關(guān)研究顯示SERTAD1的過表達(dá)與頭頸癌有關(guān)[9]。此外，SERTAD1差異表達(dá)還與多種癌癥類型相關(guān)，例如肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、白血病和淋巴瘤[10]。通過生物信息學(xué)分析序列對比，查找SERTAD1，發(fā)現(xiàn)該編碼基因附近存在lncRNA，即lnc-SERTAD1-1，其染色體位置非?？拷黃ERTAD1，作為上游因子的一個反式作用因子與順式作用元件結(jié)合，參與基因表達(dá)的調(diào)控。目前，關(guān)于lnc-SERTAD1-1在結(jié)直腸癌中的功能和作用機(jī)制報道較少。本研究組旨在分析lnc-SERTAD1-1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平及對預(yù)后的影響，探究lnc-SERTAD1-1對結(jié)直腸癌增殖及轉(zhuǎn)移的影響，以期為結(jié)直腸癌治療提供新的靶標(biāo)。

材料與方法

一、材料

1.標(biāo)本

收集2009年3月至2012年2月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胃腸外科的125例結(jié)直腸癌患者的標(biāo)本（手術(shù)切除），標(biāo)本為配對的癌組織和癌旁正常組織（距癌組織≥5cm的邊緣）。本組結(jié)直腸癌患者的入選標(biāo)準(zhǔn)：①接受切除術(shù)且術(shù)后病理活組織檢查（活檢）明確診斷為結(jié)直腸癌;②術(shù)前均未進(jìn)行放射治療、化學(xué)治療或其他抗癌治療;③術(shù)后隨訪結(jié)果完整，生存、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等情況明確。排除標(biāo)準(zhǔn)：①非原發(fā)性結(jié)直腸癌者;②家族性息肉病惡變者。所有結(jié)直腸癌患者的腸癌及癌旁正常組織標(biāo)本采集以RNA保護(hù)液處理并以液氮保存。術(shù)后隨訪以首次診斷之日為起點(diǎn)，總生存以術(shù)后死亡為隨訪終點(diǎn)。術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移作為無病生存的隨訪終點(diǎn)。術(shù)后第1年每3個月隨訪1次，之后每6個月門診隨訪1次。隨訪方式以電話、微信和門診復(fù)查相結(jié)合。隨訪截止時間為2018年2月，隨訪時間中位數(shù)為83個月，所有患者均簽署知情同意書，且本研究經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

2.細(xì)胞株

人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT15及人源胚胎細(xì)胞293T均由廣州醫(yī)科大學(xué)分子流行病學(xué)實(shí)驗(yàn)室呂嘉春教授惠贈。正常人結(jié)腸組織細(xì)胞CCD-18Co購自杭州美森細(xì)胞生物有限公司。HCT15用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，CCD-18Co、293T用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞生長的融合度為70%～80%時，取生長狀態(tài)好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

二、試劑與儀器

BiooPureTMRNAIsolationReagent購自BiooScientific，DEPC處理水購自北京萊索寶科技有限公司，PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser購自Takara，TE緩沖液購自北京萊索寶科技有限公司，SYBRGreen實(shí)時定量PCR試劑盒購自DBIBioscience;lnc-SERTAD1-1引物委托廣州復(fù)能基因有限公司合成，7900T熒光定量PCR儀購自cABI，-80℃超低溫冰箱購自ThermoScientific，ND-1000自動紫外分光光度計購自ThermoScientific，SM-F123制冰機(jī)購自SANYO;Multiskan全自動酶標(biāo)儀購自ThermoFisher;低速離心機(jī)購自中佳;FRESCO17高速低溫離心機(jī)購自Thermo。

三、研究方法

1.RNA的提取

采用BiooPureTMRNAIsolationReagent法提取總RNA，紫外分光光度計測定波長260～280nm處的吸光度，計算OD260/280，鑒定RNA純度。并隨機(jī)抽取幾對樣品的癌組織及癌旁正常組織RNA進(jìn)行核酸電泳，結(jié)果顯示RNA的量是相對準(zhǔn)確可信的。

2.實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）檢測lnc-SERTAD1-1的表達(dá)

提取總RNA后定量，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。lnc-SERTAD1-1引物，上游5-TTTGGGACTTTCGGAGCAG-3，下游5-GACTTCAGGGCAATAGGA-3;β-actin引物，上游5-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3，下游5-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3。qRTPCR結(jié)束后用2-△Ct法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，其中，中位數(shù)及以上（≥0.000970）為高表達(dá)，中位數(shù)以下（<0.000970）則為低表達(dá)。

3.細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及慢病毒感染靶細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞系

應(yīng)用GeneCopoeiaLentiPacHIV慢病毒表達(dá)系統(tǒng)按實(shí)際說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，將含有目的基因lnc-SERTAD1-1過表達(dá)的質(zhì)粒及含有空白載體質(zhì)粒分別與轉(zhuǎn)染試劑混合，得到2種試劑混合液，通過轉(zhuǎn)染，制備并收集對應(yīng)的病毒液。采取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法將2種病毒液分別感染靶細(xì)胞HCT15，構(gòu)建含有目的基因lnc-SERTAD1-1過表達(dá)的HCT15（HO）及含有空載體質(zhì)粒的HCT15（HOC），最后通過藥物篩選去除未穩(wěn)定轉(zhuǎn)染成功的HCT15，最終得到實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，得到HOC及HO繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞并提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA行qRT-PCR驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，明確HO過表達(dá)lnc-SERTAD1-1。

4.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

將穩(wěn)轉(zhuǎn)成功并經(jīng)藥物篩查的2種細(xì)胞HO及HOC以200個/孔接種于6孔板中，每種細(xì)胞3個副孔，置于37℃、5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)14d后，去上清，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，4%多聚甲醛溶液固定15min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色20min，染色后對肉眼可見的克隆團(tuán)進(jìn)行計數(shù)，計算克隆形成率（克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%），實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

5.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（Transwell）

將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染成功并經(jīng)藥物篩查的2種細(xì)胞HO及HOC消化并適度稀釋，用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞密度。將200μl（5×104個）細(xì)胞懸液接種于小室上層，將600μl含20%血清的RPMI1640培養(yǎng)基加至小室下層。置于37℃、5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，取出小室，用PBS洗2～3次，用棉簽擦除小室膜上層未穿過膜的細(xì)胞，用4%多聚甲醛溶液固定20min，室溫干燥小室，0.1%結(jié)晶紫染色30min，用干凈棉簽再次擦除未穿過小室的小室上層細(xì)胞，用流動水沖洗小室上多余的結(jié)晶紫，室溫干燥小室。使用100倍倒置顯微鏡，隨機(jī)選擇5個視野拍照，然后計算細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

6.蛋白免疫印跡法

將穩(wěn)轉(zhuǎn)成功并經(jīng)藥物篩查后的2種細(xì)胞HO及HOC傳代于6孔板中，每種細(xì)胞3個復(fù)孔，置于37℃、5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞生存狀態(tài)良好，融合度達(dá)70%～80%時，分別提取這2種細(xì)胞的蛋白，按蛋白免疫印跡法常規(guī)操作步驟驗(yàn)證下游蛋白SERTAD1在HOC和HO的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

運(yùn)用SPSS19.0、GraphPadPrism8.0處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并進(jìn)行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的定量資料用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，方差不齊采用校正t檢驗(yàn);非正態(tài)分布的定量資料用M（P25，P75）表示，組間比較采用MannWhitneyU檢驗(yàn)。lnc-SERTAD1-1在癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)水平比較采用符號秩和檢驗(yàn);lnc-SERTAD1-1表達(dá)水平與患者臨床病理特征之間的相關(guān)性用χ2檢驗(yàn)。根據(jù)lnc-SERTAD1-1的表達(dá)水平中位數(shù)分為lnc-SERTAD1-1低表達(dá)和lnc-SERTAD1-1高表達(dá)，<0.000970為低表達(dá)組，≥0.000970為高表達(dá)組。計算結(jié)直腸癌患者總生存期（OS）及無病生存期（DFS），采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，logrank檢驗(yàn)對比生存曲線，分析lnc-SERTAD1-1表達(dá)對結(jié)直腸癌患者生存率的影響。采用多因素Cox比例風(fēng)險模型（進(jìn)入法）評估lnc-SERTAD1-1的表達(dá)水平及不同臨床病理特征與患者預(yù)后的關(guān)系，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、lnc-SERTAD1-1在癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)水平

采用qRT-PCR檢測lnc-SERTAD1-1的表達(dá)水平。lnc-SERTAD1-1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平低于癌旁正常組織，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-5.188，P<0.001），見圖1。73.6%（92/125）的樣品檢測到lnc-SERTAD1-1在癌組織中的表達(dá)低于配對的癌旁正常組織，見圖2。

二、lnc-SERTAD1-1在CCD-18Co與HCT15中的表達(dá)

采用qRT-PCR檢測lnc-SERTAD1-1在CCD-18Co與HCT15中的表達(dá)水平，結(jié)果提示lnc-SERTAD1-1在CCD-18Co中的表達(dá)高于HCT15（n=4，t=4.565，P=0.004），見圖3。

低表達(dá)為lnc-SERTAD1-1在癌組織中的表達(dá)比配對的癌旁正常組織低的例數(shù);高表達(dá)為lnc-SERTAD1-1在癌組織中的表達(dá)比配對的癌旁正常組織高的例數(shù)

三、lnc-SERTAD1-1的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

125例結(jié)直腸癌患者中l(wèi)nc-SERTAD1-1低表達(dá)樣本（2-△Ct<0.000970）62例（49.6%）。直腸癌患者、腫瘤直徑<5cm者及大體分型為腫塊型者，其lnc-SERTAD1-1的表達(dá)水平越低，見表1。

四、結(jié)直腸癌患者不同臨床病理特征與生存率的多因素分析

采用Cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行多因素預(yù)后分析，結(jié)果顯示，腫瘤大體分型為環(huán)窄型、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期是結(jié)直腸癌患者術(shù)后OS和DFS的獨(dú)立危險因素;年齡>60歲是結(jié)直腸癌患者術(shù)后OS的獨(dú)立危險因素，但不是結(jié)直腸癌DFS的獨(dú)立危險因素;lnc-SERTAD1-1高表達(dá)則是結(jié)直腸癌患者OS及DFS的獨(dú)立保護(hù)因素，見表2。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，125例結(jié)直腸癌患者的1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為96.0%、82.4%、67.2%，見圖4A。lnc-SERTAD1-1低表達(dá)組與高表達(dá)組1年生存率分別為93.5%、98.4%，3年生存率為69.4%、95.2%，5年生存率為50.0%、82.5%，log-rank檢驗(yàn)提示，lnc-SERTAD1-1低表達(dá)組的生存率比lnc-SERTAD1-1高表達(dá)組低（P<0.001），見圖4B。

五、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后lnc-SERTAD1-1在HOC與HO中的表達(dá)

采用qRT-PCR驗(yàn)證穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的HOC和HO中l(wèi)nc-SERTAD1-1的表達(dá)，結(jié)果提示lnc-SERTAD1-1在HO中的表達(dá)高于HOC（n=4，t'=-12.019，P<0.05），見圖5。

六、lnc-SERTAD1-1對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的作用

平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測lnc-SERTAD1-1對結(jié)直腸癌細(xì)胞克隆形成的影響。在HO中，細(xì)胞克隆形成數(shù)低于HOC（n=6，t'=-2.569，P=0.039），見圖6。結(jié)果提示lnc-SERTAD1-1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞克隆形成。

七、lnc-SERTAD1-1對結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移作用

使用Transwell小室檢測HO體外遷移能力。對lnc-SERTAD1-1過表達(dá)后，觀察到HO穿過Transwell小室的數(shù)量較HOC少（n=5，t=7.120，P<0.001），見圖7。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，lnc-SERTAD1-1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外遷移。

八、蛋白免疫印跡法檢測下游蛋白SERTAD1在HOC與HO中的表達(dá)

多次行蛋白免疫印跡法檢測下游蛋白SERTAD1在HOC與HO中的表達(dá)水平，結(jié)果提示，SERTAD1在HO中的表達(dá)高于HOC（n=4，t=-108.530，P<0.001），見圖8。

討論

lncRNA可參與腫瘤的增殖、分化、浸潤及轉(zhuǎn)移等過程，可發(fā)揮促癌或抑癌作用。相關(guān)研究表明，SERTAD1是一種癌基因，在營養(yǎng)不良和饑餓條件下可促進(jìn)腫瘤發(fā)生和程序性細(xì)胞死亡（PCD）[11]。Mongre等[12]報道SERTAD1在大多數(shù)癌癥（例如浸潤性乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、畸胎瘤、骨髓瘤和胰腺導(dǎo)管癌）中起著潛在的致癌作用。雖然上述研究表明SERTAD1發(fā)揮癌基因作用，但也有其他研究表明其在不同類型的癌癥中發(fā)揮相反的作用。Xi等[13]發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中SERTAD1的表達(dá)是降低的，與SERTAD1作為潛在的腫瘤抑制因子的功能一致。

本研究顯示，結(jié)直腸癌組織中l(wèi)nc-SERTAD1-1的表達(dá)量較相應(yīng)的癌旁正常組織低，lnc-SERTAD1-1在腸癌細(xì)胞中的表達(dá)亦低于正常腸黏膜細(xì)胞。這與Xi等[13]研究結(jié)果一致，提示lnc-SERTAD1-1與SERTAD1可能存在正相關(guān)關(guān)系，調(diào)控該基因的表達(dá)。分析該組病例中l(wèi)nc-SERTAD1-1與其臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腫瘤部位、直徑及腫瘤的大體分型與結(jié)直腸癌中l(wèi)nc-SERTAD1-1的表達(dá)相關(guān)，結(jié)直腸癌中l(wèi)nc-SERTAD1-1的低表達(dá)以直腸癌、腫瘤直徑<5cm、腫瘤大體分型為腫塊型者更為多見，并且lnc-SERTAD1-1的高表達(dá)是結(jié)直腸癌OS的獨(dú)立保護(hù)因素，也是結(jié)直腸癌患者術(shù)后DFS的獨(dú)立保護(hù)因素。隨后的人群預(yù)后關(guān)聯(lián)分析提示lnc-SERTAD1-1高表達(dá)是結(jié)直腸癌患者OS、DFS的獨(dú)立保護(hù)因素，明確了lnc-SERTAD1-1對結(jié)直腸癌預(yù)后的意義。鑒于此，我們進(jìn)一步行體外實(shí)驗(yàn)，平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在HCT15中，HOC的細(xì)胞克隆形成率低于HOC;細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HOC的遷移能力弱于HOC。以上體外功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，lnc-SERTAD1-1過表達(dá)抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移，提示lnc-SERTAD1-1可能對結(jié)直腸癌起抑癌作用。

本研究為了驗(yàn)證lnc-SERTAD1-1與SERTAD1之間可能存在正相關(guān)的關(guān)系，對HOC及HO進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平的檢測，結(jié)果提示，lnc-SERTAD1-1和下游蛋白SERTAD1在HO中的表達(dá)量均高于HOC，提示質(zhì)粒成功導(dǎo)入HCT15中，且lnc-SERTAD1-1與SERTAD1存在正相關(guān)關(guān)系。目前，有關(guān)lnc-SERTAD1-1與結(jié)直腸癌關(guān)系的研究極少，lnc-SERTAD1-1在結(jié)直腸癌中的分子作用機(jī)制的研究更為罕見。本研究結(jié)果提示了lnc-SERTAD1-1可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖與遷移，其在結(jié)直腸癌中作為一種抑癌分子參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移是有可能的。

本研究尚存在一些不足，lnc-SERTAD1-1與臨床病理特征的相關(guān)分析數(shù)據(jù)僅來源于單中心，應(yīng)增加樣本量，尋求多中心多地區(qū)合作，進(jìn)行更具代表性的調(diào)查研究。本研究初步驗(yàn)證了lnc-SERTAD1-1對結(jié)直腸癌的抑癌作用，為深入研究結(jié)直腸癌發(fā)病及進(jìn)展機(jī)制提供了理論依據(jù)，有望用于指導(dǎo)臨床治療及術(shù)后隨訪，但更深入的作用機(jī)制及臨床應(yīng)用尚待進(jìn)一步研究。