任雯慶，張世亮

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014）

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ê喎Q冠心病，CHD）指由于動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）病變累及冠狀動(dòng)脈，使其結(jié)構(gòu)功能改變引發(fā)的心臟疾?。?］。目前，隨著年齡增長，我國人群肥胖、高血壓、高血脂、高血糖患病率逐年攀升等CHD危險(xiǎn)因素不斷增加，使其發(fā)病率與病死率呈上升趨勢。CHD屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”范疇，輕者僅感胸悶如窒、氣短喘息，重者心痛徹背、背痛徹心，多因氣虛血瘀所致。

有研究整理古今CHD相關(guān)中醫(yī)治療，其中“川芎”“丹參”為高頻次藥物、“川芎?丹參”藥對為高頻次藥物組合［2?4］。川芎乃血中氣藥，有補(bǔ)血清頭，活血止痛之功，丹參歸心經(jīng)，可破癥除痂、溫經(jīng)止痛，兩者合用可活血化瘀、行氣止痛?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，川芎具有抗AS作用，可能與降血脂、抗凝抗血小板等有關(guān)［5］；丹參有抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡功能，對心血管有保護(hù)作用［6］。但現(xiàn)代相關(guān)研究缺乏“川芎?丹參”藥對的整體中藥藥理及作用機(jī)制研究，“川芎?丹參”藥對作為參蛭通心膠囊重要組成，對其中藥藥理機(jī)制的進(jìn)一步探討，有利于更好地明確參蛭通心膠囊作用規(guī)律及機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)分析，從整體性、系統(tǒng)性出發(fā)，通過建立“活性成分?靶標(biāo)?通路?疾病”網(wǎng)絡(luò)，探索疾病與藥物之間的關(guān)系［7］。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討川芎?丹參藥對主要有效活性成分，構(gòu)建其治療CHD多靶點(diǎn)、多通路的藥理網(wǎng)絡(luò)，對其進(jìn)行整體性、系統(tǒng)性研究，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 有效活性成分收集與篩選

應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Tra?ditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），以“川芎”“丹參”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，根據(jù)基于口服生物利用度（OB）>30%、類藥性（DL）>0.18篩選出主要有效活性成分。OB反映口服藥物經(jīng)吸收進(jìn)入人體血液循環(huán)的藥量占總劑量的百分比，DL反映具有藥物相似性的化合物與已知藥物之間的相似性，兩者在中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的有效化合物評價(jià)中起到重要作用。

1.2 藥物與疾病靶標(biāo)的篩選

應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索川芎?丹參藥對有效活性成分靶標(biāo)信息，可產(chǎn)生靶標(biāo)基因全稱，再通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）將上一步產(chǎn)生的結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為相應(yīng)基因簡稱。應(yīng)用Gene?Cards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）以“cor?onary heart disease”為關(guān)鍵詞檢索CHD的靶標(biāo)基因。隨后將藥物靶標(biāo)基因與疾病靶標(biāo)基因進(jìn)行比對，篩選出共同的靶標(biāo)，得到川芎?丹參藥對治療CHD的靶標(biāo)。

1.3 有效活性成分?CHD靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將川芎?丹參藥對有效活性成分與CHD靶標(biāo)上傳于Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行可視化處理，繪制有效活性成分?CHD靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)反映關(guān)鍵化合物和靶標(biāo)，邊反映有效活性成分與CHD靶標(biāo)之間的互相作用。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將川芎?丹參藥對有效活性成分與CHD靶標(biāo)交集用于STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string?db.org/）進(jìn)行檢索，物種設(shè)置為“Homo sapiens”（人類），得到初步蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)，選擇最低蛋白相互作用閾值設(shè)置為“highest confidence”（最高置信度）0.9，默認(rèn)設(shè)置處理其余參數(shù)，隱藏游離蛋白或靶標(biāo)，得到最終需要的PPI網(wǎng)絡(luò)并下載。同時(shí)，以連接度（De?gree）篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中前30個(gè)核心基因，并運(yùn)用R語言繪制柱狀圖。Degree指PPI網(wǎng)絡(luò)中基因相連節(jié)點(diǎn)的數(shù)目，Degree值越大表示該節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)聯(lián)系越緊密，在網(wǎng)絡(luò)中作用的關(guān)鍵程度越大。

1.5 基因本體富集分析和京都基因與基因組百科全書通路富集分析

利用Bioconductor及R語言得到川芎?丹參藥對?CHD共同靶標(biāo)基因ID，并進(jìn)行基因本體（Gene ontology，GO）富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，過程中設(shè)置pvalueCutoff=0.5、qvalueCutoff=0.5，得出結(jié)果并繪制柱狀圖及氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 川芎?丹參藥對有效活性成分篩選

按照預(yù)先設(shè)定的篩選條件，共篩選出72個(gè)主要有效活性成分。其中川芎7個(gè)，包括β?谷甾醇（sitos?terol）、楊梅酮（Myricanone）等；丹參65個(gè)，包括丹參酮、丹酚、紫杉醇（Poriferasterol）、沒食子酸酯（digal?late）等。川芎?丹參藥對符合篩選條件的有效活性成分基本信息見表1。

表1 川芎-丹參藥對符合篩選條件有效活性成分基本信息Tab 1 Basic information of active ingredients in"Ligusticum Chuanxiong Hort.?Salvia miltiorrhiza"

2.2 川芎?丹參藥對與CHD靶標(biāo)篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫繼續(xù)查詢上述72個(gè)主要有效活性成分的靶標(biāo)信息，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫查對獲取基因簡稱。GeneCards數(shù)據(jù)庫共獲取到6 815個(gè)CHD靶標(biāo)基因。經(jīng)過相關(guān)數(shù)據(jù)處理后，得到川芎?丹參藥對與CHD共同靶標(biāo)96個(gè)，如PTGS1、PTGS2、NCOA 2、NOS2、KCNH 2等，運(yùn)用R語言繪制Venn圖。見圖1。

圖1 川芎?丹參藥對與CHD基因靶標(biāo)比對情況Fig 1 Comparison of"Ligusticum Chuanxiong Hort.?Sal?via miltiorrhiza"and CHD gene target

2.3 川芎?丹參藥對活性成分與CHD靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape3.7.2軟件對獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理，得到川芎?丹參藥對活性成分?CHD靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。網(wǎng)絡(luò)中包含160個(gè)節(jié)點(diǎn)、815個(gè)邊。節(jié)點(diǎn)分別表示川芎?丹參藥對有效活性成分及作用靶標(biāo)，二者之間多對單、單對多關(guān)系同時(shí)存在，即川芎?丹參藥對中多個(gè)靶標(biāo)可與相同有效活性成分相關(guān)，單一靶標(biāo)可與多個(gè)不同有效活性成分相關(guān)，由此可見，川芎?丹參藥對在治療CHD方面具有多成分、多靶標(biāo)的特點(diǎn)。

圖2 川芎?丹參藥對活性成分?CHD靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 "Ligusticum Chuanxiong Hort.?Salvia miltiorrhiza"?CHD?active ingr edient?target networ k diagram

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫，按照預(yù)先設(shè)定，建立川芎?丹參藥對治療CHD核心基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，網(wǎng)絡(luò)中包含96個(gè)節(jié)點(diǎn)、328個(gè)邊，見圖3。運(yùn)用R語言計(jì)算Degree值，取前30個(gè)核心基因繪制柱狀圖，結(jié)果顯示川芎?丹參藥對治療CHD的靶標(biāo)中Degree值排名前5的靶標(biāo)為信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT 3）、人RAC?α絲 氨 酸/蘇 氨 酸 蛋 白 激 酶（AKT 1）、JUN蛋白（JUN）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、淀粉樣前體蛋白（APP）。見圖4。

圖3 川芎?丹參藥對治療CHD核心基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 PPI network diagram of cove genes of"Ligusticum Chuanxiong Hort.?Salvia miltiorrhiza"in treating CHD

圖4 PPI核心基因Fig 4 Column char t of PPI cor e target

2.5 GO富集分析

根據(jù)預(yù)先設(shè)置進(jìn)行GO富集分析，運(yùn)用R語言繪制川芎?丹參藥對治療CHD的GO富集分析結(jié)果柱狀圖、氣泡圖，分別見圖5、6。綜合分析結(jié)果顯示142個(gè)生物過程，生物學(xué)功能有腎上腺素受體活性、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性?直接的配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA結(jié)合、類固醇激素受體活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、酰胺結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、肽結(jié)合等。說明川芎?丹參藥對可以通過調(diào)控多種生物功能及過程參與CHD的治療。

圖5 川芎?丹參藥對治療CHD的GO功能富集分析Fig 5 Column chart of GO enrichment analysis of"Ligusticum Chuanxiong Hort.?Salvia miltiorrhiza"in treating CHD

2.6 KEGG通路富集分析

根據(jù)預(yù)先設(shè)置進(jìn)行KEGG通路富集分析，運(yùn)用R語言繪制川芎?丹參藥對治療CHD的KEGG通路富集分析結(jié)果柱狀圖、氣泡圖，見圖7、8。綜合分析結(jié)果顯示131條通路，主要有PI3K?Akt信號通路、IL?17信號通路、HIF?1信號通路，并與內(nèi)分泌抵抗、前列腺癌、乙肝、膀胱癌、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、小細(xì)胞肺癌、人巨細(xì)胞病毒感染、大腸癌、弓形蟲病、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、胰腺癌等疾病相關(guān)。說明川芎?丹參藥對的有效活性成分靶標(biāo)可映射于多種通路，并可借助這些通路發(fā)揮治療CHD的作用，在此過程中也可對通路涉及的疾病起到輔助治療的作用。

圖6 川芎?丹參藥對治療CHD的GO功能富集分析氣泡圖Fig 6 Bubble chart of GO enrichment analysis of"Ligusticum Chuanxiong Hort.?Salvia miltiorrhiza"in treating CHD

圖7 川芎?丹參藥對治療CHD的KEGG通路富集分析Fig 7 Column chart of KEGG pathway enrichment analysis of"Ligusticum Chuanxiong Hort.?Salvia miltiorrhiza"in treat?ing CHD

圖8 川芎?丹參藥對治療CHD的KEGG通路富集分析氣泡圖Fig 8 Bubble chart of KEGG pathway enrichment analysis of"Ligusticum Chuanxiong Hort.?Salvia miltiorrhiza"in treat?ing CHD

3 討論

中醫(yī)學(xué)對于CHD的病因病機(jī)有深刻的認(rèn)識，治療上成效顯著。CHD屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”范疇，多是虛實(shí)夾雜病證，在本虛基礎(chǔ)上夾雜有瘀、痰、寒等實(shí)邪，構(gòu)成本虛標(biāo)實(shí)為主的基本病機(jī)，其中瘀最為常見，整個(gè)疾病病理過程均貫穿于其中。瘀血阻礙可致氣血不暢，氣血運(yùn)行不暢亦可致瘀。歷代醫(yī)家觀點(diǎn)均有證實(shí)，瘀血阻絡(luò)是胸痹發(fā)生的最主要的實(shí)邪所在，易致最終出現(xiàn)氣虛血瘀證。瘀血凝滯，阻滯心脈，久之心絡(luò)不暢，心脈失養(yǎng)發(fā)為“胸痹”之證。從中醫(yī)學(xué)辨證論治探討，CHD臨床上多見氣虛血瘀證，治療上先治其表、后顧其本，祛邪實(shí)以活血化瘀為主，川芎?丹參為體現(xiàn)該治法的常見有效藥對之一，川芎味辛而性溫，功善活血行氣、祛瘀止痛；丹參味苦而性微寒，功善活血祛瘀、養(yǎng)血安神。川芎與丹參同用，可助川芎活血行氣祛瘀之力，且行氣而不耗傷心氣，又可在祛瘀同時(shí)，使心脈得以溫養(yǎng)?，F(xiàn)代藥理學(xué)對川芎、丹參單味藥有研究，如川芎的有效成分阿魏酸對CHD治療有正面積極作用，其機(jī)制可能是下調(diào)血液中低密度脂蛋白及總膽固醇、抗脂質(zhì)氧化、糾正AS來實(shí)現(xiàn)［8］，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其在川芎水提物中與抗血小板聚集活性的關(guān)系最為密切［9］；川芎嗪可通過穩(wěn)定CHD缺血心肌線粒體中Ca2＋含量，進(jìn)而提高Ca2＋?ATP酶活性，維持線粒體結(jié)構(gòu)及功能常態(tài)，保護(hù)缺血損傷心肌的功能，Ca2＋?ATP酶活性在心肌缺血、缺氧時(shí)由于高能磷酸代謝障礙致其降低，進(jìn)而會引起心肌線粒體中Ca2＋異常增多［10］；丹參有效成分可抗AS及心肌缺血損傷，這可能與其抗炎、抗氧化、下調(diào)血脂等調(diào)節(jié)機(jī)制激活相關(guān)［11，12］。但是單味藥物研究結(jié)果疊加不能等同于川芎?丹參藥對的作用機(jī)理，對于川芎與丹參配伍用于CHD的藥理研究報(bào)道較少。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及現(xiàn)代藥理研究，對川芎?丹參藥對治療CHD作用機(jī)制進(jìn)行了較為全面及系統(tǒng)的探討。結(jié)果顯示，共收集到72種有效成分，如β?谷甾醇（sitosterol）屬植物甾醇，可通過抑制外源性吸收、內(nèi)源性合成、逆向轉(zhuǎn)運(yùn)及排泄三者中的一種或多種途徑來降低血脂，并有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有抗炎作用［13，14］。楊梅酮（Myricanone）具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗氧化、改善胰島素抵抗、降糖等作用［15，16］。丹 參 酮ⅡA可 促 進(jìn) 巨 噬 細(xì) 胞 自 噬，減 輕ox?LDL引起的炎癥損傷，調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素（IL）?6表達(dá)以實(shí)現(xiàn)抗炎、抗AS作用，并能通過激活PI3K?Akt等信號通路對CHD的治療產(chǎn)生積極影響［17?19］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示［20］，丹酚酸能夠縮小心肌梗死面積、上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和血管密度（BVD）表達(dá)，說明其可通過促進(jìn)心臟血管生成起到保護(hù)心臟的作用，另有研究發(fā)現(xiàn)［21］，其具有抗心肌細(xì)胞凋亡、抗炎、抗腫瘤等藥理作用。紫杉醇（Poriferasterol）被認(rèn)為是最成功的天然抗癌物質(zhì)之一，已用于治療膀胱癌、小細(xì)胞肺癌、大腸癌等，并對腫瘤細(xì)胞有免疫調(diào)節(jié)特性［22］，Zhang等［23］發(fā)現(xiàn)，以紫杉醇為涂層介質(zhì)的洗脫支架用于CHD介入治療，能有效預(yù)防支架內(nèi)再狹窄，療效不遜于或等同于生物可吸收冠狀動(dòng)脈雷帕霉素洗脫支架，且兩者在發(fā)生心臟不良事件方面具有等效性。符武島等［24］發(fā)現(xiàn)，沒食子酸酯（digallate）可通過抗氧化應(yīng)激、抑制PI3K?Akt信號通路、下調(diào)Bcl?2表達(dá)量，實(shí)現(xiàn)對小鼠缺血心肌的保護(hù)；沒食子酸酯抗氧化活性及降血脂作用有利于抗AS［25，26］。

由核心基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖可知，川芎?丹參藥對治療CHD涉及的主要靶標(biāo)有STAT 3、AKT 1、JUN、MAPK1、APP等。STAT 3可通過激活線粒體和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)對心肌細(xì)胞功能產(chǎn)生有益影響，且通過調(diào)節(jié)心臟微環(huán)境及心肌成纖維細(xì)胞活動(dòng)達(dá)到保護(hù)心臟的目的，其中可能涉及減少心肌細(xì)胞耗氧量、抑制心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)心肌分化、抗炎、抗腫瘤等作用聯(lián)合的結(jié)果［27，28］；Pipicz等［29］指出，CHD危險(xiǎn)因素在心肌缺血環(huán)境下會減弱心臟STAT 3的激活，導(dǎo)致心臟缺血耐受性的惡化。AKT 1調(diào)節(jié)血管細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡等基本功能，并對內(nèi)皮細(xì)胞功能及血管完整性至關(guān)重要，其機(jī)制可能與激活PI3K?Akt信號通路，上調(diào)VEGF表達(dá)有關(guān)，促進(jìn)血管新生可減少CHD造成的心肌缺血危害［30］。c?JUN蛋白與腫瘤細(xì)胞密切相關(guān)，有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，對細(xì)胞凋亡則產(chǎn)生雙向調(diào)節(jié)作用［31］。MAPK1被證實(shí)在AS病變過程中有重要作用，Zhu等［32］通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默MAPK1可促進(jìn)細(xì)胞自噬，抑制CHD進(jìn)一步發(fā)展。近期有研究表明，APP在β?分泌酶和γ?分泌酶作用下裂解產(chǎn)生Aβ肽，其中Aβ1?40（肽鏈長度為40個(gè)氨基酸）主要在血液、血管壁和心臟中沉積，其含量與CHD嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，機(jī)制涉及血管炎癥和動(dòng)脈血栓等；APP與Aβ 1?40參與炎癥反應(yīng)，可能充當(dāng)衰老、CHD、阿爾茨海默病之間的聯(lián)系［33］。

GO富集分析結(jié)果顯示，川芎?丹參藥對治療CHD與腎上腺素受體活性、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性等相關(guān)。腎上腺素受體是G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）的一種，與心血管疾病關(guān)系密切，其中β2腎上腺素能受體（β2?AR）在動(dòng)脈粥樣斑塊的巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，有證據(jù)表明，β2?AR在心肌表現(xiàn)為收縮和抗細(xì)胞凋亡效應(yīng)，而對血管平滑肌則表現(xiàn)為舒張效應(yīng)［34，35］。G蛋白偶聯(lián)受體激酶2（GPK2）是缺血心肌細(xì)胞死亡的效應(yīng)器，位于GPCR下游效，Huang等［36］通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，GPCR和GPK 2在缺血性心臟病的治療中具有重要意義。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，川芎?丹參藥對治療CHD主要涉及PI3K?Akt信號通路、IL?17信號通路、HIF?1信號通路等方面。研究表明，PI3K?Akt信號通路在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生成、細(xì)胞凋亡、代謝、炎癥反應(yīng)中起重要作用，影響其在CHD的表達(dá)［37］；IL?17信號通路在炎癥誘導(dǎo)中起核心作用，可能通過炎癥反應(yīng)誘發(fā)CHD患者心絞痛［38］；HIF?1信號通路通過影響VEGF表達(dá)、線粒體功能、細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激等來促進(jìn)心肌細(xì)胞適應(yīng)缺血缺氧，保護(hù)或恢復(fù)其功能［39］。綜上所述，這些生物過程與川芎?丹參藥對抗炎、降脂、抗AS、保護(hù)缺血心肌等藥理作用相吻合。

本研究探討川芎?丹參藥對多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療CHD的作用機(jī)制，并與現(xiàn)有研究結(jié)果基本符合。以期為以川芎、丹參為重要組成的參蛭通心膠囊藥理作用的研究提供參考，為臨床應(yīng)用提供理論支持。不足之處在于，本研究僅是借助于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺進(jìn)行的預(yù)測性探討，有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究對相關(guān)靶標(biāo)和信號通路進(jìn)行驗(yàn)證。