帕成周，鄔善敏

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院肝膽外科，湖北武漢 430060）

原發(fā)性肝癌是全球第4位常見的癌癥死亡原因，發(fā)病率位居第6位；是我國是第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因［1，2］。其中肝細(xì)胞癌（hepa?tocellular carcinoma，HCC）占所有原發(fā)性肝癌病例的90%，該病早期檢測困難，進(jìn)展為晚期后惡性程度高，發(fā)展迅速，預(yù)后差。目前，我國肝硬化主要病因是病毒性肝炎，但酒精性肝硬化的比例有所升高［3］。長期大量飲酒與肝臟脂肪變性和肝纖維化有關(guān)，最終可以進(jìn)展為肝硬化，這是發(fā)展為HCC的主要危險(xiǎn)因素［4］。乙醇脫氫酶（alcoholic dehydroge?nase，ADH）分為5大類，包括7種基因型，其編碼基因（ADH 7、ADH 1C、ADH 1B、ADH 1A、ADH 6、ADH 4和ADH 5）位于四號(hào)染色體長臂（4q21?24）的區(qū)域內(nèi)，長度約為365 kb，基因按上述排列順序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄［5］。ADH在乙醇、視黃醇等物質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要的作用，將乙醇氧化為乙醛，若此酶表達(dá)異?；蚴д{(diào)，會(huì)導(dǎo)致酒精代謝異常［6］。近年研究發(fā)現(xiàn)ADH家族在胃癌、乳腺癌、鼻咽癌中可以用于評(píng)估患病風(fēng)險(xiǎn)及評(píng)價(jià)疾病預(yù)后［7?9］。本研究利用生物信息學(xué)方法探究ADH家族在HCC中的表達(dá)情況及其預(yù)后評(píng)價(jià)作用，旨在為ADH家族的實(shí)際臨床應(yīng)用提供新思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及整理

癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）收錄了超過20 000個(gè)原發(fā)性腫瘤及與之匹配的正常樣本，涵蓋了33種癌癥類型，共有2.5 P的基因組、表觀基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)。本研究自TCGA數(shù)據(jù)庫下載肝細(xì)胞癌和正常肝組織經(jīng)校正后的RNA?Seq基因表達(dá)譜，提取并整理數(shù)據(jù)集，此數(shù)據(jù)集中包含肝細(xì)胞癌374例，正常肝組織50例。TCGA數(shù)據(jù)庫下載的臨床信息數(shù)據(jù)集包含377例臨床資料，其中240例資料較為完整。

1.2 ADH家庭成員的差異表達(dá)分析和預(yù)后評(píng)價(jià)

本研究利用在線資源Metabolic gEne RApid Visualizer數(shù)據(jù)庫（http：//merav.wi.mit.edu/）在線識(shí)別ADH家族基因，并逐個(gè)分析其在正常肝組織及HCC中的表達(dá)水平；同時(shí)，自TCGA下載的數(shù)據(jù)集利用R軟件（v.3.6.0）通過limma包提取基因庫表達(dá)數(shù)據(jù)，采用非參數(shù)t檢驗(yàn)比較ADH家族基因在正常肝組織和HCC中的表達(dá)情況。將在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中表達(dá)具有差異的ADH家族成員取交集，運(yùn)算并截?cái)鄊RNA表達(dá)量的中位值，以此值分為高、低表達(dá)兩組，篩除1例隨訪時(shí)間缺失的臨床資料后，使用survival包采用Kaplan?Meier法進(jìn)行生存分析。使用240例臨床資料及ADH家族基因表達(dá)量進(jìn)行Cox分析，采用單因素Cox分析選擇可能影響HCC預(yù)后的因素，采用多因素Cox分析逐一驗(yàn)證HCC患者生存時(shí)間與ADH家族基因表達(dá)情況、臨床特征（年齡、性別、病理分級(jí)、臨床分期等）的相關(guān)性。本研究以P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 ADH家族成員的相互作用和功能富集分析

GeneMAMIA（https：//genemania.org/）常 用于 預(yù) 測 基 因/基 因 集 的 功 能，STRING（https：//string?db.org/）常用于分析蛋白的相互作用。利用GeneMAMIA、STRING在基因?qū)用婕暗鞍妆磉_(dá)水平分析ADH家族的相互關(guān)系。最后，通過DAVID生物信息學(xué)資源6.8版（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）進(jìn)行ADH家族基因功能富集分析，包括基因本體（GeneOntology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路分析，并采用ImageGP（http：//www.ehbio.com/ImageGP/）繪制氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 ADH家族在正常肝組織和肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)差異

在Metabolic gEne RApid Visualizer數(shù)據(jù)庫中，ADH家族中的ADH1A、ADH1B、ADH1C、ADH4、ADH 7在HCC組織中低表達(dá)（P<0.05）；在TCGA數(shù)據(jù)庫中，ADH家族中的ADH1A、ADH1B、ADH 1C、ADH 4、ADH 6、ADH 7在HCC組織中低表達(dá)（P<0.05）。兩者交集包括ADH1A、ADH1B、ADH 1C、ADH 4、ADH 7，表明上述差異表達(dá)的基因可能與抑制肝組織癌變有關(guān)，見圖1。

圖1 正常肝組織和肝細(xì)胞癌組織中ADH家族的表達(dá)差異比較Fig 1 The expression differences of ADH family in normal liver tissues and HCC

2.2 肝細(xì)胞癌中ADH家族成員不同表達(dá)水平間的預(yù)后評(píng)價(jià)

通過選取在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中均存在表達(dá)差異的ADH家族成員進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示在HCC患者 中 除ADH7外，ADH 1A、ADH1B、ADH1C、ADH4高表達(dá)組的生存率優(yōu)于低表達(dá)組，且生存差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示ADH 1A、ADH1B、ADH1C、ADH4低表達(dá)可能與HCC患者不良預(yù)后相關(guān)，見圖2。單因素Cox回歸分析表明ADH 1A、ADH 1C、ADH 4表達(dá)水平、腫瘤臨床分期、T分期、M分期與患者總體生存率密切相關(guān)，見表1；多因素Cox回歸分析則進(jìn)一步提示ADH1A（HR=0.997 9，95%CI：0.996?1.000，P=0.039 3）、ADH 1C（HR=0.998 6，95%CI：0.998?1.000，P=0.009 4）、ADH4（HR=0.997 9，95%CI：0.997?0.999，P=0.001）低表達(dá)是影響HCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表1 單因素Cox回歸分析HHC患者臨床特征、ADH家族表達(dá)量和總體生存率的相關(guān)性Tab 1 univariate Cox regression analysis of the correlation between clinical characteristics，the expression of ADH fami?ly and overall survival rate

圖2 肝細(xì)胞癌患者中ADH家族成員不同表達(dá)水平的生存分析Fig 2 Survival analysis of ADH family with different expression levels in patients with HCC

2.3 ADH家族基因互作與蛋白互作分析

GeneMANIA在基因?qū)用嫔戏治隽薃DH家族的關(guān)系，結(jié)果顯示所有的ADH家族均存在共享的蛋白結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)ADH 7在ADH家族基因互 作 關(guān) 系 中 較 為 獨(dú) 立，ADH 1A?ADH 1B、ADH 1B?ADH 1C、ADH 1A?ADH 1C之間存在通路，ADH1B?ADH1C存在物理相互作用，除ADH 1A?ADH 5以及ADH 1C?ADH 5以外均存在共表達(dá)關(guān)系，ADH 4?ADH 5以及ADH 6分別與ADH1B、ADH1C之間不存在共定位的關(guān)系，見圖3A。在蛋白表達(dá)水平上，STRING結(jié)果顯示ADH家族中的所有成員均可通過與酯酶D（Esterase D，ESD）關(guān)聯(lián)實(shí)現(xiàn)基因共現(xiàn)，ADH1A與ADH1B顯示出共表達(dá)的關(guān)系。乙醛脫氫酶（aldehyde dehydroge?nase，ALDH）在文本挖掘方面與各個(gè)ADH家族成員之間存在相互作用，見圖3B。

圖3 ADH家族基因互作與蛋白互作分析Fig 3 Gene interactions and protein interactions of the ADH family

2.4 ADH家族的功能富集分析

本研究中GO富集分析顯示ADH家族具有鋅離子結(jié)合、乙醇結(jié)合、視黃醇結(jié)合、氧化還原酶活性、乙醇脫氫酶活性、視黃醇脫氫酶活性等分子功能，主要參與乙醇氧化及視黃醇代謝等生物過程。KEGG分析顯示ADH家族通過糖酵解/糖異生、化學(xué)致癌作用、酪氨酸代謝、脂肪酸降解、視黃醇代謝、細(xì)胞色素P450對(duì)藥物的代謝等通路發(fā)揮生物學(xué)作用，見圖4。

圖4 ADH家族基因的GO富集分析及KEGG分析Fig 4 GO enrichment analysis and KEGG analysis of ADH family

3 討論

長期大量酒精攝入引起脂代謝紊亂，同時(shí)增加腸道通透性，促進(jìn)革蘭氏陰性菌釋放的內(nèi)毒素進(jìn)入血液循環(huán)，單核細(xì)胞產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子，通過門靜脈血流到達(dá)肝臟激活Kupffer細(xì)胞釋放趨化因子，引起肝細(xì)胞損傷，激活的肝星狀細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的過量細(xì)胞外基質(zhì)取代肝實(shí)質(zhì)，促進(jìn)肝硬化，最終可發(fā)展為肝癌［10］。此外，氧化應(yīng)激、DNA損傷、p53基因突變、端?？s短及功能障礙引發(fā)染色體不穩(wěn)定，也會(huì)導(dǎo)致肝癌的發(fā)生［11］。

本研究中利用兩個(gè)數(shù)據(jù)庫資料進(jìn)行ADH家族基因的表達(dá)差異分析發(fā)現(xiàn)，HCC組織中ADH 1A、ADH 1B、ADH 1C、ADH 4、ADH 7 mRNA表達(dá)水平顯著降低，表明這些基因可能在肝癌中具有抑癌作用。為此，研究進(jìn)行了生存分析驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADH 1A、ADH 1B、ADH 1C、ADH 4低表達(dá)的HCC患者生存率較差，進(jìn)一步提示差異表達(dá)的ADH家族低表達(dá)可能與HCC患者不良預(yù)后相關(guān)。在多因素Cox分析中，ADH1A、ADH 1C、ADH4低表達(dá)是影響HCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，未來可能可以利用ADH 1A、ADH 1B、ADH 1C、ADH 4等指標(biāo)進(jìn)行HCC患者的預(yù)后預(yù)測。

在基因?qū)用娴姆治鲋校珹DH 7基因在ADH家族基因互作關(guān)系中較為獨(dú)立。ADH7基因編碼Ⅳ類ADHσ或μ亞基，此酶在胃和食管中表達(dá)豐富，乙醇氧化過程中效率低下，而在視黃醇代謝中的活性最高，因此與其他ADH家族成員有所不同［12，13］。ADH 1A?ADH 1B、ADH 1B?ADH 1C、ADH 1A?ADH 1C之間存在通路，主要由于它們編碼的蛋白均屬于I類ADH。I類ADH由α、β和γ亞基自由組合后形成同型二聚體/異型二聚體，并且不同亞基形成的二聚體具有高度相似性。ESD又名S?甲酰基谷胱甘肽水解酶，在蛋白互作分析中與ADH家族實(shí)現(xiàn)基因共現(xiàn)，它是一種廣泛表達(dá)的非特異性酯酶，存在于所有生物體的細(xì)胞質(zhì)囊泡中，參與谷胱甘肽的再生，降解甲醛，目前它在腫瘤生長過程中的分子作用機(jī)制尚不明確［14］。本研究中ALDH與各個(gè)ADH家族成員之間存在相互作用，ADH、ALDH均作為酒精代謝過程中的關(guān)鍵酶，酒精通過ADH氧化生成致癌物質(zhì)乙醛，經(jīng)ALDH氧化為無害的乙酸，乙酸易形成乙酰CoA進(jìn)入三羧酸循環(huán)或參與脂肪酸合成［15］。ADH、ALDH家族基因中部分存在基因多態(tài)性。ADH 1B和ADH 1C基因的等位基因存在會(huì)導(dǎo)致其編碼的ADH的活性不同，影響乙醇被氧化為乙醛的速率；對(duì)于ALDH來說，純合突變型ALDH 2*2具有極低的ALDH活性，飲酒后乙醛會(huì)積累，易出現(xiàn)臉紅表現(xiàn)，降低酗酒率進(jìn)而避免了肝臟損傷［16］。ADH、ALDH家族基因多態(tài)性與HCC發(fā)生的機(jī)制聯(lián)系需要進(jìn)一步進(jìn)行探究。

盡管一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)部分ADH家族基因多態(tài)性與酒精依賴之間存在聯(lián)系，但ADH家族通過何種方式及調(diào)控通路來影響HCC細(xì)胞的生物學(xué)行為，需要進(jìn)一步解析其作用機(jī)制。值得注意的是，ADH 1A、ADH1C、ADH4可能是HCC患者預(yù)后評(píng)判的有效生物標(biāo)志物，為HCC的防治提供了一定的理論依據(jù)和應(yīng)用價(jià)值。