張?zhí)煊?，?嘉，楊 凱，曾明月，董盼攀，曾慶琪

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2.江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，江蘇 南京 210029；3.張家港市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 張家港 215600；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；5.浙江省立同德醫(yī)院，浙江 杭州 310012）

前列腺1號方是曾慶琪教授治療慢性前列腺炎（chronic prostatitis,CP）的經(jīng)驗(yàn)方，動物實(shí)驗(yàn)表明可抗炎[1]，臨床研究也證明具有較高安全性和滿意的療效[2]。藥物組成包括綿萆薢、菟絲子、茯苓、石菖蒲、馬鞭草、威靈仙、白芷、延胡索，可益腎化濕、泄?jié)嵬ńj(luò)，但其藥理機(jī)制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠構(gòu)建“疾病?表型?基因?藥物”多層次網(wǎng)絡(luò)，打破了常規(guī)中藥方劑單一成分、通路研究思路，從整體角度探索藥物與疾病的作用機(jī)理，與中醫(yī)藥整體觀、辨證論治等原則吻合[3,4]。中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺（TCMIP）V 2.0，是一個(gè)智能化中醫(yī)藥數(shù)據(jù)挖掘平臺，信息來源于中醫(yī)藥百科全書（ETCM）[5]。本研究主要應(yīng)用整合藥理學(xué)預(yù)測前列腺1號方治療慢性前列腺炎的潛在作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 獲取化學(xué)成分

本研究應(yīng)用中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺（TC?MIP，http：//www.tcmip.cn/）中藥材數(shù)據(jù)庫，將前列腺1號方藥物組成的每味藥依次設(shè)定為關(guān)鍵詞，收集相應(yīng)化學(xué)成分。根據(jù)化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫基于體內(nèi)ADME過程提供的化學(xué)成分信息，以Druglike?ness Weight>0.46為標(biāo)準(zhǔn)篩選出中高度類藥性化學(xué)成分，建立前列腺1號方的有效化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。

1.2 篩選預(yù)測靶標(biāo)

利用中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫或中藥（含方劑）靶標(biāo)預(yù)測功能，將前列腺1號方的化學(xué)成分或方藥組成設(shè)定為關(guān)鍵詞，檢索出候選靶標(biāo)，以相似性分?jǐn)?shù)大于等于0.8（score≥0.8）為標(biāo)準(zhǔn)篩選出預(yù)測靶標(biāo)，建立前列腺1號方的潛在靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫。TCMIP平臺基于OpenBabel軟件的MACCS分子指紋提取功能，參考DrugBank比對分析化學(xué)成分的二維結(jié)構(gòu)，選取Tanimoto系數(shù)相似性分?jǐn)?shù)大于等于0.8的候選靶標(biāo)［6］。

1.3 查詢疾病靶標(biāo)

運(yùn)用疾病相關(guān)分子庫，將“前列腺炎”設(shè)定為關(guān)鍵詞查詢疾病靶標(biāo)，建立慢性前列腺炎的疾病靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫。疾病靶標(biāo)來源于Human Phenotype Ontol?ogy數(shù)據(jù)庫（HPO，http：//humanphenotypeontology.github.io/）。

1.4 建立蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

蛋白質(zhì)相互作用（PPI）是生物分子網(wǎng)絡(luò)的基本組成單位，也是連接方藥靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)之間紐帶，更是疾病發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。TCMIP平臺整合了以下8個(gè)數(shù)據(jù)庫的PPI數(shù)據(jù)信息：Half A Degree Additional Warming（HAPPI）、Reactome Pathway Database（Reactome）、IntAct Molecular Interaction Database（InAct）、Online Predicted Human Interac?tion Database（OPHID）、Molecular Interaction Data?base（MINT）、Human Protein Reference Database（HPRD）、Database of Interacting Protein（DIP）、PDZBase等。故本研究使用TCMIP平臺，直接獲取前列腺1號方的潛在靶標(biāo)與慢性前列腺炎疾病靶標(biāo)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。

1.5 挖掘中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)

通過TCMIP平臺的網(wǎng)絡(luò)分析模塊，構(gòu)建前列腺1號方的潛在靶標(biāo)與慢性前列腺炎疾病靶標(biāo)之間的PPI計(jì)算網(wǎng)絡(luò)特征值，將“節(jié)點(diǎn)連接度（degree）”的2倍中位數(shù)設(shè)為卡值，選取中藥靶標(biāo)?疾病?基因互作網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)（hubs）；再將“degree”、“節(jié)點(diǎn)緊密度（closeness）”和“節(jié)點(diǎn)介度（betweenness）”的中位數(shù)設(shè)為卡值，選取同時(shí)滿足3個(gè)卡值的節(jié)點(diǎn)為前列腺1號方治療慢性前列腺炎的關(guān)鍵靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)。通過對關(guān)鍵靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的基因功能和通路富集分析，構(gòu)建前列腺1號方調(diào)控機(jī)制的“方劑?中藥材?成分?核心靶標(biāo)?通路?疾病”可視化多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)及“方藥構(gòu)靶”核心網(wǎng)絡(luò)。

1.6 分析基因功能和富集通路

TCMIP平臺包括GO基因本體數(shù)據(jù)庫（http：//www.geneontology.org）和KEGG通路庫（http：//www.genome.jp/kegg/）資源，故可直接獲得生物學(xué)反應(yīng)、作用通路等信息。應(yīng)用富集計(jì)算，進(jìn)行基因功能和通路富集分析，繪制氣泡圖，預(yù)測前列腺1號方治療慢性前列腺炎的潛在作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 前列腺1號方的有效化學(xué)成分及預(yù)測靶標(biāo)

前列腺1號方在TCMIP平臺共有220個(gè)化學(xué)成分，根據(jù)類藥性篩選出103個(gè)有效化學(xué)成分（100種有效化學(xué)成分），其中綿萆薢3種、菟絲子3種、石菖蒲18種、茯苓9種、威靈仙5種、白芷33種、敗醬草2種、延胡索30種。根據(jù)相似性分?jǐn)?shù)篩選出1 314個(gè)預(yù)測靶標(biāo)（692種預(yù)測靶標(biāo)），其中重復(fù)頻次較高的有29種靶標(biāo)，AR出現(xiàn)7次，NR1I2、NCOA 1、GA?BRG3、GABRG2、GABRG1、GABRB3、GABRA 6、GABRA 5、GABRA 4、GABRA 3、GABRA 2、GA?BRA 1等13個(gè)靶標(biāo)均出現(xiàn)5次，VDR、SHBG、PIM 1、NR3C1、NFKB2、NFKB1、HSD11B2、HSD11B1、GLTP、ESR2、ESR1、cobT、ADK、AB?CB1等15個(gè)靶標(biāo)均出現(xiàn)4次。

通過對前列腺炎1號方潛在靶標(biāo)進(jìn)行基因功能分析和通路富集分析，取顯著性排名前20（圖1、2）。氣泡顏色代表P值，反映富集顯著性；氣泡大小代表基因數(shù)，反映富集到的基因數(shù)量大小。前列腺1號方藥理作用多集中在突觸傳遞、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢?、受體激活、受體轉(zhuǎn)錄等方面，參與生物學(xué)反應(yīng)主要是神經(jīng)系統(tǒng)過程、離子跨膜運(yùn)輸、化學(xué)突觸傳遞，參與通路多涉及核受體轉(zhuǎn)錄途徑、GABA A受體激活、GABA受體激活。

圖1 前列腺1號方預(yù)測靶標(biāo)基因生物學(xué)反應(yīng)氣泡圖Fig 1 Bubble diagram of biological process of target gene of prostate prescriptionⅠ

圖2 前列腺1號方預(yù)測靶標(biāo)基因參與通路氣泡圖Fig 2 Bubble diagram of reactome pathway of target gene of prostate prescriptionⅠ

2.2 前列腺1號方治療慢性前列腺炎的關(guān)鍵靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

借助TCMIP平臺的網(wǎng)絡(luò)分析模塊，建立前列腺1號方治療慢性前列腺炎的關(guān)鍵靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，篩選出關(guān)鍵靶標(biāo)89個(gè)，按照degree值大小顯示所有關(guān)鍵靶標(biāo)，圖3中節(jié)點(diǎn)大小與degree值成正比，包括33個(gè)核心節(jié)點(diǎn)、6個(gè)直接作用疾病靶標(biāo)的節(jié)點(diǎn)（其中LCK對4個(gè)疾病靶標(biāo)均有直接作用）。33個(gè)核心節(jié)點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系通過圖4顯示，6個(gè)直接作用疾病靶標(biāo)節(jié)點(diǎn)分別是LCK、PTK2B、AKT 1、INS、PIK3R1、ATP5C。

圖3 前列腺1號方治療慢性前列腺炎關(guān)鍵靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Core target network diagram of prostate prescriptionⅠin the treatment of chronic prostatitis

圖4 前列腺1號方治療慢性前列腺炎核心節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 4 Core node networ k diagram of pr ostate pr escriptionⅠin the treatment of chronic prostatitis

2.3 基因功能和通路富集分析結(jié)果

借助TCMIP平臺GO、KEGG數(shù)據(jù)庫，前列腺1號方治療CP的預(yù)測靶標(biāo)基因功能和通路富集結(jié)果顯示如下（前20，圖5、6）。前列腺1號方治療CP的藥理機(jī)制集中在神經(jīng)受體、受體信號通路、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面，參與生物學(xué)反應(yīng)主要是對藥物的應(yīng)答、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路，偶聯(lián)到環(huán)核苷酸第二信使、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與通路多涉及5?羥色胺受體、多巴胺受體、Gα（Ⅰ）信號事件。

圖5 前列腺1號方治療CP的預(yù)測靶標(biāo)基因生物學(xué)反應(yīng)氣泡圖Fig 5 Bubble diagram of biological process of target gene of prostate prescriptionⅠin the treatment of CP

2.4“中藥材?成分?核心靶標(biāo)?通路”可視化多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)

應(yīng)用TCMIP平臺中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘功能，在“自定義多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)可視化”中選擇“中藥材”、“成分”、“核心靶標(biāo)”、“通路”、“疾病”，構(gòu)建可視化多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。前列腺1號方通過8味中藥、79個(gè)有效化學(xué)成分、33個(gè)核心靶標(biāo)、11條通路發(fā)揮治療慢性前列腺炎的藥理作用。推測前列腺1號方對CP的干預(yù)作用主要與5?羥色胺受體、多巴胺受體、Gα（I）信號通路、Gα（Q）信號通路、TP53調(diào)節(jié)代謝基因、呼吸電子傳遞、PI3K/AKT信號的調(diào)節(jié)、CD28依賴性PI3K/AKT信號、Ik BA變異產(chǎn)生EDA?ID、PIP3激活A(yù)KT信號、下游TCR3信號等有關(guān)。見圖7。

圖6 前列腺1號方治療CP的預(yù)測靶標(biāo)基因參與通路氣泡圖Fig 6 Bubble diagram of reactome pathway of target gene of prostate prescriptionⅠin the treatment of CP

圖7“中藥材?成分?核心靶標(biāo)?通路”可視化多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 7 Visual multi?dimensional correlation network diagram of"herb?ingredient?core target?pathway"

3 討論

前列腺1號方含有豐富有效的化學(xué)成分，作用靶點(diǎn)多樣，參與通路各異，既平行又交叉地共同作用發(fā)揮實(shí)際功效。本研究采用整合藥理學(xué)研究方法挖掘前列腺1號方，預(yù)測其發(fā)揮治療作用的潛在藥理機(jī)制。

前列腺1號方是在經(jīng)驗(yàn)方基礎(chǔ)上增加延胡索而成。延胡索有抗菌抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用［7］。干預(yù)CP有效化學(xué)成分有79種，核心作用靶標(biāo)有LCK、PTK 2B、AKT 1、INS、PIK 3R1、HSP90AA 1、NR3C1、PIK 3CA、CREB1、ADCY 1、AR等33個(gè)。其中，LCK、PTK2B、AKT 1、INS、PIK 3R1、ATP5C等6個(gè)靶標(biāo)是直接作用疾病的。文獻(xiàn)研究表明，淋巴細(xì)胞特異性蛋白酪氨酸激酶（Lck）是調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能、參與T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、過敏性鼻炎及癌癥等多種炎癥和免疫性疾病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用［8，9］；PTK 2B、AKT 1參與神經(jīng)傳遞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)信號通路［10］；PIK 3R1是PI3K主要調(diào)控亞型，PI3K/Akt通路及其下游靶點(diǎn)成為巨噬細(xì)胞活化表型的中心調(diào)控因子，此通路的激活是限制促炎的關(guān)鍵，Akt調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞，包括促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生、吞噬、自噬并維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)［11］。

中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘發(fā)現(xiàn)前列腺1號干預(yù)CP的信號通路主要包括serotonin receptors、dopamine receptors、G alpha（i）signalling events、G alpha（q）signalling events、TP53 regulates metabolic genes、re?spiratory electron transport、PI5P，PP2A and IER3 regulate PI3K/AKT signaling、CD28 dependent PI3K/AKT signaling、IKBA variant leads to EDA?ID、PIP3 activates AKT signaling、down?stream TCR signaling等。文獻(xiàn)檢索各通路，整理分析如下：PI3K/AKT信號通路在細(xì)胞生長、血管生成、代謝調(diào)節(jié)、炎癥等方面發(fā)揮重要作用［12，13］，另外此通路還與結(jié)腸炎炎癥相關(guān)［14］，PI5P控制胰島素信號并通過調(diào)節(jié)磷酸酶來激活蛋白激酶B（AKT）［15］，激活PP2A可阻斷PI3K、Akt和ERK磷酸化［16］；早期反應(yīng)基因IER3與炎癥和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)［17］；T細(xì)胞共刺激分子（CD28）激活1A類磷酸肌醇激酶（PI3K）［18］，磷脂PIP3可調(diào)控Akt的生化和結(jié)構(gòu)［19］；5?羥色胺受體是一種神經(jīng)遞質(zhì)受體，在心血管、胃腸、內(nèi)分泌中樞神經(jīng)及行為功能發(fā)揮生理作用，在前列腺等組織中高水平表達(dá)［20］；神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的不平衡導(dǎo)致大腦到前列腺傳遞信號改變引起炎癥，多巴胺受體（D1/D2平衡）參與調(diào)節(jié)排尿反射［21，22］；G（i）是活性氧靶蛋白，通過氧化應(yīng)激參與細(xì)胞信號通路，G（q）參與免疫細(xì)胞信號通路［23，24］；TP53是腫瘤抑制基因，和前 列腺癌 有關(guān)。線粒體呼吸電子鏈參與前列腺組織的氧代謝［25］；T細(xì)胞受體參與炎癥和適應(yīng)性免疫［26］。故前列腺1號對CP的干預(yù)治療可能體現(xiàn)在抗炎抗腫瘤、細(xì)胞代謝、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)調(diào)節(jié)等方面。

綜上所述，本研究應(yīng)用中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究方法，對前列腺1號治療CP的潛在作用機(jī)制進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)研究，結(jié)果顯示前列腺1號方中79種有效化學(xué)成分可能通過11條信號通路作用于33個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)發(fā)揮抗炎抗腫瘤、細(xì)胞代謝、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)調(diào)節(jié)等作用，為經(jīng)驗(yàn)方治療CP提供理論依據(jù)和藥理闡釋。本研究填補(bǔ)了經(jīng)驗(yàn)方研究中除理論傳承、動物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)外空白，實(shí)現(xiàn)中醫(yī)藥研究現(xiàn)代化，以期指導(dǎo)臨床應(yīng)用。但因整合藥理學(xué)研究離不開數(shù)據(jù)庫完整性及實(shí)時(shí)性，中醫(yī)方劑并非單一中藥藥理簡單相加，故此類研究仍有局限性，亟待優(yōu)化和進(jìn)一步探索。