宋立曉 侯忠樂 任一鳴 嚴繼勇 曾愛松 許園園 張昌偉

摘要：CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)是作物分子設計育種的重要手段，sgRNA設計對于提高基因編輯效率具有重要作用。為了提高sgRNA設計的準確度，構(gòu)建了聚乙烯亞胺修飾的單壁碳納米管（PEI-SWNT）介導的瞬時轉(zhuǎn)化體系，并用于檢測青花菜CRISPR/Cas9基因編輯效率。結(jié)果表明，CRISPR/Cas9編輯體系可以誘導青花菜特定基因位點發(fā)生突變，編輯效率為8.3%。研究結(jié)果為利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)創(chuàng)制青花菜新種質(zhì)提供了基礎。

關鍵詞：青花菜;基因編輯;單壁碳納米管;瞬時轉(zhuǎn)化

中圖分類號：S635.301 ? 文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）13-0056-03

青花菜（Brassica oleracea L .var. italica Planch）又名西蘭花，是十字花科蕓薹屬甘藍種中以綠色花球為產(chǎn)品的一、二年生草本植物。營養(yǎng)價值較高，含有豐富的維生素，并含抗癌物質(zhì)，受到消費者的青睞。青花菜栽培歷史較短，但發(fā)展很快，在我國已成為一些地區(qū)出口創(chuàng)匯的重要優(yōu)質(zhì)蔬菜種類之一。通過現(xiàn)代育種技術，提高青花菜種質(zhì)資源的抗性和品質(zhì)，對于青花菜品種選育工作非常重要。

近年來CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)作為一種新型生物學研究手段被開發(fā)利用，該系統(tǒng)憑借其技術優(yōu)越性被廣泛應用于擬南芥、煙草、玉米等多種作物的基因組定點編輯[1-3]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效率受多種因素影響，Cas9核酸酶啟動子、sgRNA啟動子的類型、sgRNA與目標位點的結(jié)合效率，目標靶點的數(shù)目、載體的類型、轉(zhuǎn)化的方式以及宿主植株的同源重組修復能力等;優(yōu)化Cas9基因的密碼子可以提高編輯效率[4-5]。熊興鵬對甘藍型油菜的研究結(jié)果表明，利用不同的sgRNA，其編輯效率從20%到56%不等[6-7]。

不同的sgRNA序列對于目標基因的結(jié)合效率具有很大的差異，在依靠特定軟件對sgRNA序列進行設計時，各個軟件會依據(jù)sgRNA序列的堿基種類對其編輯效率進行估算，不同軟件的算法差異以及作物種類的影響會造成估算結(jié)果常與實際的編輯效率有較大的差異[8]，為了排除干擾因素的影響，通過瞬時表達對CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)化載體的編輯效率進行檢測就尤為重要。

青花菜的再生體系建立比較困難，轉(zhuǎn)化的效率也較低，在實際的操作中往往是經(jīng)過復雜的步驟實現(xiàn)了遺傳轉(zhuǎn)化卻由于基因編輯載體的效率較低而無法實現(xiàn)基因編輯，為了避免這種情況，有必要在遺傳轉(zhuǎn)化前對基因編輯載體的編輯效率進行檢測。

近年來納米材料漸漸應用到植物的遺傳轉(zhuǎn)化中[9]。碳納米管和聚乙烯亞胺復合體介導的遺傳轉(zhuǎn)化是利用聚乙烯亞胺帶正電的特性吸附帶負電的質(zhì)粒載體，利用碳納米管長徑比很大的特性，刺破植物細胞壁，將外源載體導入到植物細胞內(nèi)[10]。利用聚乙烯亞胺修飾的碳納米管介導的瞬時轉(zhuǎn)化在煙草、小麥、棉花上都已成功實現(xiàn)，在青花菜上還未有先例，本研究參照煙草試驗方法，探索該體系在檢測青花菜基因編輯效率上應用的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用青花菜品種是蘇青3號，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所選育而成，由筆者所在課題組保存;碳納米管購自于先豐納米材料科技有限公司，聚乙烯亞胺購自于Sigma-Aldrich。相關試驗于2019年10—12月在江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室進行。

1.2 sgRNA的設計與基因編輯載體的構(gòu)建

用CRISPR-p2.0（http：//crispr.hzau.edu.cn）在線軟件對青花菜紫色相關基因BEE1（Bol030777）基因序列進行靶位點分析，選擇位于外顯子上、GC含量不低于50%、靠近基因編碼區(qū)5'端的序列作為靶位點[11];將候選的sgRNA與青花菜的基因組序列進行比對，淘汰脫靶率較高的sgRNA，設計的sgRNA序列如表1所示，并將人工合成的sgRNA序列連接到北京唯尚立德公司VK005-14質(zhì)粒載體上[12]。選擇測序結(jié)果一致的質(zhì)粒進行搖菌擴繁，質(zhì)粒提取步驟按照天根生化科技（北京）有限公司質(zhì)粒提取試劑盒說明書進行，提取的質(zhì)粒濃度需達到1 000 ng/μL，濃度不夠則利用濃縮儀進行濃縮。

1.3 PEI-SWNT的制備

按照文獻[13-14]的方法制備PEI-SWNT。將1.3 mg干燥COOH-SWNTs加入50 mL錐形底離心管中，加入30 mL蒸餾水，超聲波浴處理獲得COOH-SWNT懸濁液，PEI與COOH-SWNTs共反應獲得PEI-SWNT復合體。PEI與COOH-SWNTs按照1 ∶ 20的比例共反應獲得PEI-SWNT復合體，將PEI-SWNT復合體轉(zhuǎn)移到100000-MWCO過濾器中。用無核酸酶的水洗滌PEI-SWNT溶液6次，將過量的PEI洗去。

1.4 基因編輯載體瞬時轉(zhuǎn)化青花菜葉片

準備MES輸送緩沖液（pH值=4.5～5.0）用于稀釋PEI-SWNT，以PEI-SWNT ∶ DNA（3 ∶ 1）的質(zhì)量比將500 ng PEI-SWNTs與167 ng質(zhì)粒DNA復合在一起，室溫下孵育30 min以形成DNA-PEI-SWNT復合物。將DNA-PEI-SWNT溶液吸入 1 mL 的無針注射器。在青花菜葉子背面用針尖刺穿，將注射器緩慢注射到青花菜的葉片中。在葉片上輕輕地標記入滲區(qū)域，1 d后質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA，2～3 d將mRNA翻譯為蛋白。

1.5 青花菜子葉中瞬時表達熒光蛋白檢測

將注射后的植株轉(zhuǎn)移到光培箱（光周期為白天16 h，27 ℃;夜晚8 h，22 ℃）進行培養(yǎng)。于注射后第3天（72 h）在激光共聚焦顯微鏡下觀察葉片是否有GFP熒光蛋白表達。

1.6 候選sgRNA基因編輯效率檢測

取青花菜葉片有GFP熒光表達部位的葉片，用CTAB法提取葉片的基因組DNA，根據(jù)編輯的基因序列設計包含編輯位點的引物進行PCR擴增（表2）。純化回收擴增后的PCR片段，連接T載體后進行大腸桿菌轉(zhuǎn)化，每個樣品挑取8個單克隆搖菌后PCR擴增測序。將測序結(jié)果與青花菜的基因序列進行比較，檢測基因位點是否被編輯，并計算編輯效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 SWNT水分散液濃度和PEI-SWNT分散液濃度分析

通過對SWNT和PEI-SWNT濃度的測量表明SWNT水懸濁液的濃度為90.11 mg/L（建議濃度在100 mg/L左右），PEI-SWNT的濃度可以達到41.72 mg/L（表3），回收效率為46.3%。PEI-SWNT的濃度達到試驗要求。

2.2 青花菜葉片GFP熒光表達分析

利用熒光共聚焦顯微鏡觀察熒光標簽的表達情況，由圖1可見，注射碳納米管和質(zhì)粒的復合體的青花菜葉片可在共聚焦顯微鏡下觀察到綠色的熒光，說明GFP蛋白在注射后第3天已經(jīng)在葉片表達，通過此方法可以將外源基因?qū)氲角嗷ú说娜~面細胞中并完成外源基因的表達。本試驗成功注射32個葉片中有7個可以在熒光共聚焦下觀察到綠色熒光，占注射總數(shù)的21.9%。

2.3 青花菜CRISPR/Cas9系統(tǒng)候選sgRNA基因編輯結(jié)果

提取有GFP熒光蛋白表達的葉片DNA，用表2的引物擴增檢測有GFP熒光表達的青花菜基因組的序列，膠回收PCR產(chǎn)物，然后連接到T載體上并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，將挑取的24個單克隆樣品搖菌后進行測序。測序的結(jié)果中有2個編號樣品的序列在基因編輯位點附近發(fā)生了基因突變，第5號樣品在B1編輯位點PAM附近檢測到3個堿基的缺失，第10號樣品檢測到B1編輯位點單堿基的突變（圖2），B2和B3編輯位點沒有檢測到基因突變。sgRNA在青花菜中的編輯效率為8.3%。

3 討論

基因編輯技術已經(jīng)被廣泛應用于各類蔬菜的種質(zhì)資源創(chuàng)新中，sgRNA的編輯效率是影響基因編輯技術成敗的關鍵因素之一[15]，通過常規(guī)遺傳轉(zhuǎn)化方法對sgRNA有效性進行驗證比較耗時，且成本較高[12]。瞬時表達體系作為一種簡便高效的方法可用于快速驗證sgRNA的編輯效率，徐璇等利用柑橘的原生質(zhì)體成功實現(xiàn)了柑橘的瞬時轉(zhuǎn)化[16]，鄭天慧等利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法在擬南芥上實現(xiàn)了基因編輯并篩選出高效率的sgRNA序列。但通過原生質(zhì)體實現(xiàn)瞬時轉(zhuǎn)化的方法存在許多局限性，如試驗過程中材料容易被污染，對編輯效率的檢測難度大等。已有研究表明，PEI-SWNT介導的瞬時轉(zhuǎn)化方法具有操作簡便、檢測周期短等優(yōu)點，能夠被用于驗證sgRNA的編輯效率。本研究探索了在青花菜上建立切實可行的瞬時轉(zhuǎn)化方法，該方法操作簡便、快速，可以方便快捷地驗證sgRNA的編輯效率。

本研究在已有研究的基礎上優(yōu)化了試驗步驟，較大幅度提高了碳納米管分散液的濃度，利用PEI-SWNT介導的瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在青花菜上實現(xiàn)了更加高效的瞬時轉(zhuǎn)化。試驗結(jié)果表明，SWNT水懸濁液的濃度可以達到90 mg/L以上，PEI-SWNT溶液的濃度可以達到41.72 mg/L，SWNT結(jié)合PEI后的回收率為46.3%，可以滿足試驗的需求;PEI-SWNT介導的瞬時轉(zhuǎn)化體系可以將外源載體通過葉面注射的方法導入到青花菜的葉面細胞中。提取青花菜瞬時轉(zhuǎn)化部位葉片的基因組DNA，對編輯位點進行測序后發(fā)現(xiàn)有單堿基的突變和缺失，說明構(gòu)建的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在青花菜上具有編輯能力。本試驗結(jié)果顯示由PEI-SWNT介導的瞬時轉(zhuǎn)化體系可以完成對青花菜更加高效的瞬時轉(zhuǎn)化，本方法相較于其他瞬時轉(zhuǎn)化方法更簡單高效，且單次轉(zhuǎn)化成本可以降低到3美元。該方法為利用基因編輯技術創(chuàng)制青花菜的新種質(zhì)奠定了良好的基礎。

參考文獻：

[1]Liu W，Zhu X，Lei M，et al. A detailed procedure for CRISPR/Cas9-mediated gene editing in Arabidopsis thaliana[J]. Science Bulletin，2015，60（15）：1332-1347.

[2]Liang Z，Zhang K，Chen K，et al. Targeted mutagenesis in Zea mays using TALENs and the CRISPR/Cas system [J]. Journal of Genetics and Genomics，2014，41（2）：63-68.

[3]Gao J，Wang G，Ma S，et al. CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Nicotiana tabacum [J]. Plant Molecular Biology，2015，87（1）：99-110.

[4]張玉苗，李 蓉，魯 瑤，等. 基于提高CRISPR/Cas基因編輯效率的研究進展[J]. 熱帶作物學報，2019，40（10）：2006-2015.

[5]時 歡，林玉玲，賴鐘雄，等. CRISPR/Cas9介導的植物基因編輯技術研究進展 [J]. 應用與環(huán)境生物學報，2018，24（3）：640-650.

[6]Xiong X，Liu W，Jiang J，et al. Efficient genome editing of Brassica campestris based on the CRISPR/Cas9 system [J]. Mol Genet Genomics，2019，294（5）：1251-1261.

[7]陳 凱. CRISPR技術的優(yōu)化及Cas9酶PAM識別位點的改造[D]. 中國農(nóng)業(yè)科學院，2017：43.

[8]Zhu Q，Liu Y G，Ma X，et al. A protocol for CRISPR/Cas9-based multi-gene editing and sequence decoding of mutant sites in plants [J]. Scientia Sinica Vitae，2018，48（7）：783-794.

[9]孔倩倩，李志輝，王 瓊，等. 納米基因載體在植物遺傳轉(zhuǎn)化中的應用[J]. 生物技術通報. 2010，6：6-12.

[10]袁剛強. 單壁碳納米管材料（SWCNTs）對水稻的植物毒性效應的研究[D]. 湖南大學，2015：50-51.

[11]王瑋瑋，劉瑞琪，吳勇延，等. CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)研究進展及其在動物基因編輯研究中的應用 [J]. 畜牧獸醫(yī)學報.2019，7：1299-1305.

[12]Demirer G S，Zhang H，Matos J L，et al. High aspect ratio nanomaterials enable delivery of functional genetic material without DNA integration in mature plants [J]. Nat Nanotechnol，2019，14（5）：456-464.

[13]Demirer G S，Zhang H ，Goh N S，et al. Carbon nanotube-mediated DNA delivery without transgene integration in intact plants[J]. Nature Protocol，2019，14（10）：1-24.

[14]丁莉萍，張杰偉，馬 艷，等. CRISPR/Cas基因組編輯技術研究進展及其在植物中的應用[J]. 植物生理學報，2019，55（4）：411-424.

[15]馬興亮，劉耀光.植物CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)與突變分析[J]. 遺傳，2016，38（2）：118-125.

[16]徐 旋. 柑橘原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化及利用CRISPR/Cas9技術定點突變山金柑基因[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2018：43-46.