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mir-375調(diào)節(jié)notch通路對高氧誘導(dǎo)新生鼠肺上皮細(xì)胞凋亡的影響研究

2021-09-09 07:29黃潤英范智利肖吉群鄭巍蔡強(qiáng)
河北醫(yī)藥 2021年17期
關(guān)鍵詞:拮抗劑肺泡氧化應(yīng)激

黃潤英 范智利 肖吉群 鄭巍 蔡強(qiáng)

支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulm onary dysplasi,BPD)是早產(chǎn)兒常見并發(fā)癥之一,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,其中高氧致肺損傷是主要原因,患兒肺發(fā)育不全且長時(shí)間處于高氧環(huán)境中易出現(xiàn)損傷[1]。而目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為氧化應(yīng)激是肺損傷的主要原因,而細(xì)胞凋亡成為氧化應(yīng)激引起肺損傷的主要機(jī)制之一[2]。微小RNA(microRNA,miRNA)在疾病發(fā)生發(fā)展中參與氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等過程,其中mir-375與氧化應(yīng)激關(guān)系密切,其水平變化與疾病關(guān)系密切[3];在腫瘤疾病中mir-375是凋亡腫瘤細(xì)胞衍生出的miRNA,高表達(dá)的mir-375可在凋亡過程中以非外泌體形式釋放出來,亦是吞噬細(xì)胞浸潤以及促進(jìn)腫瘤微環(huán)境發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[4],但在BPD中筆者尚未發(fā)現(xiàn)研究。notch通路可決定肺泡上皮細(xì)胞的分化方向,參與高氧肺損傷修復(fù)過程,是一種保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)[5]。且mir-375與notch1在細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、分化中都關(guān)系密切[6],但未發(fā)現(xiàn)二者在細(xì)胞凋亡中的相關(guān)研究。本研究構(gòu)建BPD模型,觀察mir-375對BPD大鼠肺上皮細(xì)胞凋亡的影響并探討其機(jī)制,為靶位點(diǎn)治療提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康SD孕鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號:SYXK(京)-2017-0033,清潔級,足月順產(chǎn)同一批新生SD大鼠作為研究對象,雄雌不限。所有實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑與儀器:mir-375拮抗劑陰性對照、mir-375拮抗劑均購自廣州銳博生物科技有限公司。mir-375、U6引物由上海生工生物工程股份有限公司合成;蘇木素-伊紅(hematoxylin-easine,HE)染色試劑盒、一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒均購自碧云天生物科技有限公司,貨號:C0105、C1088、S0131S、S0060;一抗兔抗notch1、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl2)、Bcl2相關(guān)X蛋白(Bcl2 associated X protein,Bax)、GAPDH均購自英國abcam公司,貨號:ab52627、ab216985、ab59348、ab181602。氧箱購自美國Shellab公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)儀購自美國ABI公司,型號:ABI Veriti 96孔;蛋白凝膠成像儀購自上海Tanon公司,型號:Tanon-4800。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模:參照文獻(xiàn)中方法[7]建立BPD模型。將80只出生后3 d大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、mir-375陰性對照組和mir-375拮抗劑組,每組20只。除對照組外,其他3組置于氧箱中,氧濃度維持在(70±5)%,同時(shí)吸收氧箱二氧化碳和水蒸氣保持氧箱中壓力恒定,對照組置于空氣中正常飼養(yǎng),24 h后mir-375陰性對照組注射2 μl(濃度為0.5 μg/μl)mir-375拮抗劑陰性對照和納米轉(zhuǎn)染復(fù)合物的混合物;mir-375拮抗劑組注射2 μl(濃度為0.5 μg/μl)mir-375拮抗劑和納米轉(zhuǎn)染復(fù)合物的混合物;對照組和模型組注射2 μl無菌0.9%氯化鈉溶液,大鼠建模7 d和14 d分別每組取10只進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 體重變化:腹腔注射麻醉大鼠稱量體重。

1.2.3 qRT-PCR檢測大鼠肺組織中mir-375水平:稱重結(jié)束后立即處死大鼠,打開腹腔,部分肺組織置于4%多聚甲醛中做HE染色和免疫組化實(shí)驗(yàn),部分肺組織置于-80℃冰箱做qRT-PCR和蛋白免疫印跡(western blot,WB)實(shí)驗(yàn)。-80℃冰箱取50 mg肺組織,RNA提取試劑盒提取肺組織總RNA,cDNA合成第一條鏈試劑盒合成cDNA,qRT-PCR儀對mir-375、內(nèi)參U6擴(kuò)增。引物序列:mir-375 F:5’-GGGTTTGTTCGTTCGGCTC-3’、R :5’-CAGTGCGTGTAGTGGAG-3’;U6 F:5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’、R:5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。上樣體系20 μl:cDNA 1 μl(50 ng/μl),F(xiàn)/R(10 μm)(0.5/0.5)μl,2×Mix 10 μl,ddH2O 8.0 μl。反應(yīng)條件:95℃、10 min;95℃、15 s,62℃、60 s,40個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCT法計(jì)算肺組織中mir-375表達(dá)水平。

1.2.4 HE染色觀察肺組織形態(tài)學(xué):固定于4%多聚甲醛中的肺組織24 h后經(jīng)不同濃度乙醇中脫水,二甲苯中透明,石蠟中包埋、冷凍凝固后切片。切片制作完成后經(jīng)脫蠟、復(fù)水、染色,再脫水、透明、封片完成HE染色,光學(xué)顯微鏡拍照。

1.2.5 TUNEL檢測肺組織凋亡情況:1.2.4切片按TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒方法檢測凋亡情況,顯微鏡下TUNEL染色可見凋亡肺泡上皮細(xì)胞顯示綠色,正常肺泡上皮細(xì)胞細(xì)胞核DAPI染色顯示藍(lán)色,顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。TUNEL染色陽性細(xì)胞百分比作為凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 免疫組化檢測大鼠肺組織中notch1表達(dá)水平:1.2.4切片并HE染色相同方法脫蠟、復(fù)水,滴加過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化氫酶,熱修復(fù)抗原并加磷酸緩沖液沖洗,5%脫脂奶粉封閉20 min,滴加一抗notch1(1∶100)(陰性對照用同型同種鼠IgG代替一抗)2 h,滴加二抗20 min后DAB顯色,蘇木素復(fù)染核,鹽酸酒精分色,脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡拍照。Image軟件分析肺組織中面積積分光密度值,光密度值越大,則notch1陽性越強(qiáng)。

1.2.7 肺組織中MDA、SOD水平檢測:-80℃中取部分肺組織,制備勻漿,硫代巴比妥酸法測定MDA水平、氮藍(lán)四唑光還原法測定SOD水平。

1.2.8 WB檢測肺組織Bax、Bcl2蛋白情況:-80℃冰箱取100 mg肺組織,手術(shù)剪剪碎后于冰上研磨,每管加1 ml蛋白裂解液冰上裂解30 min,組織勻漿液4℃、10 000 g離心20 min,上清液即為肺組織總蛋白。蛋白定量后經(jīng)PAGE膠分離、PVDF膜轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉,對應(yīng)加入一抗Bax、Bcl2、GADPH,4℃孵育過夜;對應(yīng)加入二抗,室溫孵育1 h。DAB顯色試劑顯色,蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

2 結(jié)果

2.1 抑制mir-375對大鼠體重的影響 建模7、14 d,與對照組相比,模型組、mir-375陰性對照組體重降低(P<0.05);與模型組、mir-375陰性對照組相比,mir-375拮抗劑組體重升高(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠7、14 d體重變化

2.2 抑制mir-375對肺組織形態(tài)學(xué)的影響 建模7、14 d,對照組大鼠肺組織支氣管完整且排列整齊,肺泡排列整齊;模型組與mir-375陰性對照組肺組織結(jié)構(gòu)不完整,肺泡數(shù)量減少、體積增大,結(jié)構(gòu)簡單化;mir-375拮抗劑組肺組織結(jié)構(gòu)有所改善,與模型組相比肺泡數(shù)量升高、體積減少。見圖1。

2.3 抑制mir-375對肺組織中mir-375的影響 建模7、14 d,與對照組相比,模型組、mir-375陰性對照組肺組織中mir-375水平升高(P<0.05);與模型組、mir-375陰性對照組相比,mir-375拮抗劑組肺組織中mir-375水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠肺組織中mir-375水平比較

2.4 抑制mir-375對肺組織細(xì)胞凋亡的影響 建模7、14 d,與對照組相比,模型組、mir-375陰性對照組肺組織肺泡上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)升高(P<0.05);與模型組、mir-375陰性對照組相比,mir-375拮抗劑組肺組織肺泡上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)降低(P<0.05)。見表3,圖2。

表3 4組大鼠肺組織肺泡上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

2.5 抑制mir-375對肺組織中notch1水平的影響 建模 7、14 d,與對照組相比,模型組、mir-375陰性對照組肺組織中notch1水平降低(P<0.05);與模型組、mir-375陰性對照組相比,mir-375拮抗劑組肺組織中notch1水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3,表4。

表4 4組大鼠肺組織中notch1染色光密度值比較

2.6 抑制mir-375對肺組織中MDA、SOD水平的影響 建模7、14 d,與對照組相比,模型組、mir-375陰性對照組肺組織中MDA水平升高,SOD水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組、mir-375陰性對照組相比,mir-375拮抗劑組肺組織中MDA水平降低,SOD水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 4組大鼠肺組織中MDA、SOD水平比較

2.7 抑制mir-375對肺組織中Bax、Bcl2蛋白的影響 建模(7、14)d,與對照組相比,模型組、mir-375陰性對照組肺組織中Bax水平升高、Bcl2水平降低(P<0.05);分別與模型組、mir-375陰性對照組相比,mir-375拮抗劑組肺組織中Bax水平降低、Bcl2水平升高(P<0.05)。見表6,圖4。

表6 4組大鼠肺組織中Bax、Bcl2蛋白水平比較

圖4 4組大鼠肺組織中Bcl2、Bax蛋白表達(dá)情況;A 對照組;B 模型組;C mir-375陰性對照組;D mir-375拮抗劑組

3 討論

早產(chǎn)兒出生時(shí)肺發(fā)育不成熟,需氧氣支持和機(jī)械治療,對氧依賴性強(qiáng),但長期暴露在高氧環(huán)境中極易出現(xiàn)氧化應(yīng)激現(xiàn)象,導(dǎo)致肺發(fā)育遲緩[8]。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,模型組體重降低,肺組織結(jié)構(gòu)不完整,肺泡數(shù)量減少、體積增大,簡單化,提示BPD導(dǎo)致大鼠體重減輕、肺組織破壞。損害肺上皮細(xì)胞可增加氧化應(yīng)激損傷,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并與肺損傷程度、肺纖維化關(guān)系密切[9]。因此,抗氧化應(yīng)激被認(rèn)為是目前減少BPD的重要原因,減少氧化應(yīng)激改善疾病。

miRNA作為真核生物中參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的非編碼單鏈小分子RNA,參與基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá),從而參與病理生理過程,在血液循環(huán)中可作為生物標(biāo)志物,應(yīng)用于各種癌癥、自身免疫缺陷疾病等疾病中,疾病發(fā)生早期即可檢測到,對于預(yù)測疾病及對應(yīng)治療都存在極大優(yōu)勢[10,11]。mir-375在進(jìn)化上高度保守,屬胰腺轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)鍵作用靶點(diǎn),可參與胰腺的發(fā)育調(diào)控過程,升高mir-375與胰島β細(xì)胞的凋亡相關(guān)[12];在Sertoli細(xì)胞中mir-375過表達(dá)增加活性氧水平并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13];在血管損傷細(xì)胞中mir-375過表達(dá)可靶向調(diào)控導(dǎo)致炎癥小體水平下降,導(dǎo)致血管病變基因、細(xì)胞粘附因子下降,從而減少細(xì)胞凋亡[14]。推測mir-375影響細(xì)胞凋亡從而影響疾病,但具體機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,模型組肺組織中mir-375水平升高,提示BPD中mir-375水平升高與肺結(jié)構(gòu)不完整關(guān)系密切。與模型組相比,mir-375拮抗劑組肺組織結(jié)構(gòu)有所改善,肺泡數(shù)量升高,提示減少mir-375水平可改善肺組織結(jié)構(gòu),實(shí)現(xiàn)對BPD的保護(hù)。

氧化和抗氧化失衡是BPD發(fā)病的機(jī)制之一,MDA作為常見的細(xì)胞氧化損傷指標(biāo),反映氧化損傷程度;SOD是機(jī)體內(nèi)抗氧化酶,其清除自由基,反映機(jī)體抗氧化應(yīng)激水平[15]。Bax、Bcl2是目前研究細(xì)胞凋亡常用基因,Bcl2包括多個(gè)同源物,其蛋白主要調(diào)控凋亡途徑的阻斷,可阻斷、抑制細(xì)胞凋亡信息傳輸過程;Bax可拮抗Bcl2,發(fā)揮促凋亡作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,模型組肺組織中MDA、Bax水平升高,Bcl2、SOD水平降低,提示BPD中肺組織氧化損傷嚴(yán)重,抗氧化水平減弱,導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激處于失衡狀態(tài),促進(jìn)凋亡途徑,減弱抑制凋亡信號傳輸過程,細(xì)胞凋亡嚴(yán)重,且TUNEL染色中細(xì)胞凋亡指數(shù)升高可直觀觀察到BPD肺組織肺上皮細(xì)胞凋亡嚴(yán)重。與模型組相比,mir-375拮抗劑組減弱上述情況,可能是降低mir-375水平使氧化應(yīng)激向正常方向發(fā)展,從而減少細(xì)胞凋亡,實(shí)現(xiàn)對疾病的保護(hù)。

Notch通路屬進(jìn)化保守信號通路,可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、侵襲、遷移等過程[17]。notch1在發(fā)育不成熟的高氧肺損傷中表達(dá)水平顯著降低,促進(jìn)肺的發(fā)展、再生和重建,從而對肺組織起保護(hù)和修復(fù)作用,恢復(fù)其正常形態(tài)和生理功能[18]。且研究發(fā)現(xiàn)notch1在高氧誘導(dǎo)的肺損傷中調(diào)控氧化應(yīng)激從而影響肺損傷[19]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)miRNA調(diào)控notch1影響凋亡,mir-34a可調(diào)節(jié)notch1信號傳導(dǎo)參與神經(jīng)元中的神經(jīng)元凋亡過程,miRNA-34a抑制劑治療可降低動(dòng)作電位的頻率,激活notch1信號傳導(dǎo)并防止無Mg2+處理的神經(jīng)元中的神經(jīng)元凋亡,來抑制癲癇樣放電,從而改善認(rèn)知功能[20]。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,模型組肺組織中notch1水平降低,提示在BPD中notch1水平較低,促使肺細(xì)胞再生能力較弱,導(dǎo)致疾病加重。與模型組相比,mir-375拮抗劑組肺組織中notch1水平升高,提示BPD中減少mir-375表達(dá)可升高肺組織中notch1水平,從而加速肺再生;同時(shí)減弱氧化應(yīng)激損傷,減少肺上皮細(xì)胞凋亡,減輕肺組織損傷,實(shí)現(xiàn)對疾病的保護(hù)。

綜上所述,mir-375可調(diào)節(jié)notch通路從而減緩氧化應(yīng)激損傷,減輕肺上皮細(xì)胞凋亡,實(shí)現(xiàn)對BPD肺組織的保護(hù)。但mir-375與notch通路之間的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究,是本文接下來研究重點(diǎn)。

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