劉燕翔，李 明，趙東暉，趙海峰，杜秀鑾，戴 欣，張 錦，顧棟樺

1.南京醫(yī)科大學附屬蘇州科技城醫(yī)院病理科，江蘇 蘇州 215153；2.蘇州市第五人民醫(yī)院傳染科

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，是位于世界第5位的常見癌癥，同時也是位居全球第3位的腫瘤相關(guān)致死原因，每年全球發(fā)病率超過70萬新病例[1]。HCC的病因與多種因素有關(guān)，在我國慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染嚴重威脅著人類的健康，約有9 300萬HBV攜帶者，約3 000萬慢性乙型肝炎患者, HBV是誘發(fā)HCC最危險的因素之一[2]。SIRT3是細胞內(nèi)一類重要的能量代謝調(diào)控因子，廣泛參與線粒體內(nèi)復雜的代謝反應(yīng)并行使重要的調(diào)節(jié)功能[3]。PGC-1α是一個已知的調(diào)控SIRT3轉(zhuǎn)錄的因子，細胞內(nèi)SIRT3的表達主要受到PGC-1α的調(diào)控[4]。本研究旨在通過檢測HCC中SIRT3的表達水平，進一步在細胞水平上探討PGC-1α對SIRT3的調(diào)控，以及該調(diào)控對HCC的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2012年1月至2019年12月HCC患者手術(shù)切除標本22例，其中南京醫(yī)科大學附屬蘇州科技城醫(yī)院10例，蘇州市第五人民醫(yī)院12例，男17例，女5例，年齡(60.07±10.21)歲(46～92歲)，術(shù)前均未行化學治療及放射治療。所有患者的HE切片均經(jīng)兩位資深病理醫(yī)師進行分級及組織學類型再確認，以22例手術(shù)標本的距腫瘤邊界>2 cm(遠癌旁組織或切緣)為正常對照組。

1.2 細胞培養(yǎng)肝癌細胞株HepG2細胞(購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)在含質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃，體積分數(shù)為5%的CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當生長濃度為60%～80%融合時用于后續(xù)實驗。

1.3 主要試劑DAB染色液(GTVisionTM+Detection System/Mo&Rb，貨號：GK600705A)購自基因科技(上海)有限公司；兔抗人SIRT3(C73E3)單克隆抗體(貨號：2627S)購自美國CST公司；PGC-1α單克隆抗體(貨號：ab8413)購自美國Abcam公司；β-actin單克隆抗體(貨號：sc-47778)購自Santa Curuz公司；PGC-1α siRNA和對照siRNA(貨號：HEP001)購自湖州河馬生物技術(shù)有限公司；凝膠阻滯分析(EMSA)試劑盒(化學發(fā)光法)(貨號：KGS133)，高純度質(zhì)粒大提取試劑盒(貨號：GA1710)，完全RPMI-1640培養(yǎng)基(含胎牛血清，雙抗)(貨號：KGM31800)均購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 免疫組化染色：HCC手術(shù)切除標本經(jīng)10%的中性甲醛固定，脫水機處理，石蠟包埋，HE染色后病理診斷確診。將石蠟標本依次脫蠟、梯度水化、高壓加熱抗原修復，滴加3%的過氧化氫于組織上，PBS沖洗3次；滴加一抗(SIRT3抗體1∶200稀釋)37 ℃ 1 h，PBS沖洗3次；滴加二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗兔Ig)，PBS沖洗3次；滴加顯色劑DAB工作液顯色；顯色完全后用蒸餾水沖洗終止顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知表達陽性的乳腺癌組織作為陽性對照。參照Formwitz評分方法[5]：按照陽性細胞百分比和染色強度評分：(1)根據(jù)陽性細胞百分比：<5%或無陽性細胞為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。(2)根據(jù)顯色強度：無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。(3)以上兩方面乘積將最終評分<5分定義為陰性，≥5分定義為陽性。

1.4.2 細胞分組及si-PGC-1α轉(zhuǎn)染：實驗分為空白對照組(Mock)、siRNA陰性對照組(NC)、轉(zhuǎn)染處理siRNA-1組、轉(zhuǎn)染處理siRNA-2組、轉(zhuǎn)染處理siRNA-3組。按照Lipofectamine2000說明書步驟，選擇合適的混合比例(5 μl lipo2000，50 nm PGC-1α基因干擾序列siRNA-1正義：5′-GCAAUAAAGCGAAGAGUAUTT-3′，反義：5′-AUACUCUUCGCUUUAUUGCTT-3′；siRNA-2正義：5′-GCACGCAAUCCUAUUCAUUTT-3′，反義：5′-AAUGAAUAGGAUUGCGUGCTT-3′；siRNA-3正義：5′-CCGAAAUUCUCCCUUGUAUTT-3′，反義5′-AUACAA-GGGAGAAUUUCGGTT-3′來轉(zhuǎn)染細胞HepG2。加入混合液，將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，到時間后，根據(jù)細胞情況決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h。實驗重復3遍。

1.4.3 qRT-PCR檢測細胞中PGC-1α mRNA的表達水平：HepG2細胞轉(zhuǎn)染后48 h，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，對于PGC-1α蛋白基因mRNA用oligo(dT)法進行逆轉(zhuǎn)為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄完成后，使用基因特異性的正反向引物，結(jié)合SYBR染料進行qRT-PCR，結(jié)束后，設(shè)定閾值，得到相應(yīng)的Ct值，每個mRNA相對于內(nèi)參的表達量用2-△CT表示，其中△CT=C樣品-C內(nèi)參，擴增mRNA時，內(nèi)參是GAPDH。引物序列：PGC-1α正義：5′-AGCCTCTTTGCCCAGATCTT-3′，反義：5′-GGCA-ATCCGTCTTCATCCAC-3′，GAPDH正義：5′-CACATCG-CTCAGACACCATG-3′，反義：5′-TGACGGTGCCATGGA-ATTTG-3′。實驗重復3遍。

1.4.4 Western blotting分析：先用質(zhì)量濃度為2.5 g/L的胰酶消化細胞，將懸浮細胞用PBS沖洗2次，收集細胞，用RIPA裂解細胞，提取各組細胞中的總蛋白，測蛋白濃度，使用10% PAGE進行Western blotting驗證，加入PGC-1α抗體，檢測PGC-1α的蛋白水平變化。篩選有效PGC-1α的siRNA轉(zhuǎn)染的細胞株，檢測SIRT3的蛋白水平變化。以β-actin抗體為內(nèi)參對照，采用Image J軟件對條帶進行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測HCC組織SIRT3的定位與表達SIRT3主要表達在肝細胞胞質(zhì)中(見圖1～2)，HCC組織的表達量顯著低于癌旁組織，HCC組織的陽性表達率為40.9%(9/22)，顯著低于癌旁組織的77.3%(17/22)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.185,P=0.013)。

圖1 SIRT3在HCC組織中的表達(IHC，放大100倍)；圖2 SIRT3在癌旁組織中的表達(IHC，放大100倍)

2.2 轉(zhuǎn)染后各組HepG2細胞中PGC-1α的表達水平qRT-PCR、Western blotting檢測結(jié)果表明，Mock組、NC組、轉(zhuǎn)染處理siRNA-1組、轉(zhuǎn)染處理siRNA-2組、轉(zhuǎn)染處理siRNA-3組細胞中PGC-1α mRNA的表達水平分別為1.01±0.16、1.08±0.16、0.42±0.05、0.15±0.04、0.93±0.11，PGC-1α蛋白的表達水平分別為1.28±0.14、0.92±0.09、0.44±0.04、0.41±0.04、0.65±0.07，與Mock組和NC組比較，轉(zhuǎn)染處理siRNA-1組、轉(zhuǎn)染處理siRNA-2組細胞中PGC-1α mRNA和PGC-1α蛋白的表達水平均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。轉(zhuǎn)染處理siRNA-3組細胞中PGC-1α mRNA和PGC-1α蛋白的表達水平與Mock組和NC組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)(見圖3～4)。提示在肝癌HepG2細胞中轉(zhuǎn)染處理siRNA-1組、轉(zhuǎn)染處理siRNA-2組PGC-1α蛋白表達量下降，PGC-1α敲低成功。

注：與Mock組比較，*P<0.05; 與NC組比較，ΔP<0.05。

2.3 敲低PGC-1α后檢測HepG2細胞中SIRT3蛋白的表達水平Western blotting檢測結(jié)果表明，Mock組、NC組、轉(zhuǎn)染處理siRNA-1組、轉(zhuǎn)染處理siRNA-2組細胞中SIRT3蛋白的表達水平分別為0.99±0.07、0.96±0.08、0.81±0.04、0.56±0.07，與Mock組和NC組比較，轉(zhuǎn)染處理siRNA-2組細胞中SIRT3蛋白的表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。轉(zhuǎn)染處理siRNA-1組細胞中SIRT3蛋白的表達水平與Mock組和NC組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)(見圖5)。提示轉(zhuǎn)染處理組siRNA-2組SIRT3蛋白表達水平明顯下降，實驗結(jié)果證明，在敲低PGC-1α的表達后會進一步抑制SIRT3蛋白的表達。

圖5 Western blotting 檢測siRNA-2組肝癌細胞HepG2中SIRT3蛋白的表達降低

3 討論

SIRT3 是一種重要的去乙?；福哂斜Ｗo線粒體的作用[6-7]。據(jù)文獻報道，SIRT3通過不同的信號通路對腫瘤細胞的增殖有著不同的調(diào)節(jié)作用，在口腔癌和黑色素瘤中，SIRT3通過下調(diào)ROS對細胞凋亡的影響，進而促進腫瘤細胞的增殖[8]；在胰腺腫瘤發(fā)生中，SIRT3通過調(diào)節(jié)谷草轉(zhuǎn)氨酶2(glutamate oxaloacetate transaminases 2,GOT2)的乙酰化狀態(tài)，抑制了細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進了胰腺腫瘤細胞的增殖[9]。在胃癌進展中，SIRT3通過下調(diào)NotCh1的表達來抑制胃癌細胞增殖[10]；而在乳腺癌、卵巢癌和HCC中已經(jīng)被確定為一種腫瘤抑制因子[11]。Zeng等[1，12]通過免疫組織化學、Western blotting及聚合酶鏈反應(yīng)從蛋白和基因水平檢測SIRT3在肝癌中的表達，結(jié)果顯示，無論從蛋白水平還是基因水平，肝癌組織SIRT3的表達均低于正常肝組織。

我們通過免疫組織化學的方法對22例HCC組織和癌旁組織進行分析，發(fā)現(xiàn)SIRT3在HCC組織中低表達或者缺失，遠低于癌旁組織，與文獻報道[1，12]一致；初步認為SIRT3在HCC的發(fā)生、發(fā)展中起抑癌基因的作用。SIRT3在HCC細胞中的低表達或缺失會激發(fā)腫瘤細胞的惡性潛能已經(jīng)成為共識，但其低表達的分子機制還有待深入研究。

PGC-1α是與過氧化物酶體增殖物激活受體相互作用的輔轉(zhuǎn)錄激活因子，對線粒體的生物合成、內(nèi)環(huán)境平衡、能量代謝起重要的調(diào)節(jié)作用[13]。PGC-1α也是結(jié)合在SIRT3基因的啟動子上，是一個已知的調(diào)控SIRT3轉(zhuǎn)錄的因子[14]。SIRT3是線粒體對氧化應(yīng)激反應(yīng)的一個重要調(diào)節(jié)因子，也是線粒體介導細胞死亡的一個重要調(diào)節(jié)因子。SIRT3對線粒體蛋白有重要的去乙?；饔?，線粒體損傷和功能障礙會增加細胞內(nèi)ROS的生成，升高的ROS可以激活相關(guān)信號通路來調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、分化、存活、炎癥反應(yīng)、代謝等。ROS 還會對蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA造成氧化損傷，并導致突變，進而誘發(fā)腫瘤產(chǎn)生[3]。據(jù)文獻[15]報道，PGC-1α可通過介導抗氧化酶、過氧化氫酶、SOD等的表達調(diào)節(jié)ROS的代謝。過表達的PCG-1α通過激活雌激素相關(guān)受體α(ERRα)與位于SIRT3啟動子區(qū)的雌激素相關(guān)受體結(jié)合元件(ERRE)的結(jié)合，增加SIRT3的表達[4]。而過表達的SIRT3通過磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(pCREB)來刺激PGC-1α的表達，從而形成正反饋調(diào)節(jié)循環(huán)，誘導氧化應(yīng)激反應(yīng)。上調(diào)的SIRT3同時能使線粒體內(nèi)相關(guān)的乙酰化蛋白脫乙?；€(wěn)定線粒體的功能[15]。

進而我們在細胞水平上探討PGC-1α對SIRT3表達的影響，在肝癌細胞HepG2中敲低PGC-1α的表達后，可顯著下調(diào)SIRT3蛋白的表達。提示PGC-1α基因表達功能障礙可能引起SIRT3蛋白表達下調(diào)，而該信號通路功能的紊亂，可能是SIRT3在肝癌細胞中作為抑癌基因功能減弱或喪失的原因之一。

綜上所述，該研究提示SIRT3在HCC組織中低表達或者缺失，SIRT3可能是HCC的重要抑癌基因之一。通過siRNA敲低肝癌細胞HepG2中PGC-1α基因的表達后，能誘導SIRT3蛋白的表達下調(diào)，表明PGC-1α/SIRT3通路可能在調(diào)節(jié)肝癌細胞增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用，設(shè)計相應(yīng)的藥物上調(diào)PGC-1α/SIRT3通路，可能成為肝癌治療的新靶點，但具體的作用機制尚需要進一步研究。