李司柱，肖士渝，薛 艷，周麗雅

北京大學(xué)第三醫(yī)院消化科，北京 100191

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是胃內(nèi)最常見的病原體之一，無論全球還是中國，感染人數(shù)占總?cè)丝诘囊话胍陨蟍1-2]。它參與胃內(nèi)外多種疾病的發(fā)生發(fā)展[3-4]。目前尚無有效疫苗，提倡抗生素為基礎(chǔ)的根除治療[4-5]。H.pylori根除治療能降低消化性潰瘍及胃癌發(fā)病率[6-7]。但H.pylori根除之后存在再感染可能且其相關(guān)疾病進(jìn)程涉及多種因素，胃內(nèi)菌群也可能參與其中[8]。

研究已經(jīng)表明，胃內(nèi)存在包括細(xì)菌在內(nèi)的微生物[9],它們能影響H.pylori，參與其定植、免疫及致病[10],它們也可能參與胃內(nèi)疾病的發(fā)生發(fā)展[11-12]。此外，H.pylori感染能顯著改變健康者胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)[13-14]。

H.pylori根除藥物包括抗生素和抑酸藥(如PPI)等，這些藥物單獨(dú)服用即能影響胃內(nèi)菌群[15-16]，是否H.pylori根除也能影響胃內(nèi)菌群呢？解決這些問題有助于探究H.pylori的致病機(jī)理及為H.pylori相關(guān)疾病的治療提供新思路。本研究根據(jù)H.pylori感染史不同，將研究對(duì)象分為三組，分別為H.pylori根除成功組(ER組)、H.pylori現(xiàn)癥感染組(HP組)和無H.pylori感染史組(HC組)。通過基于Illumina Miseq PE250測(cè)序平臺(tái)，對(duì)細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行高通量測(cè)序分析，比較三組菌群差異并進(jìn)行物種差異及關(guān)聯(lián)分析，探索H.pylori根除對(duì)胃內(nèi)菌群影響及CXCL17與差異菌群相關(guān)關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年7月至2019年9月北京大學(xué)第三醫(yī)院消化科收治的6例H.pylori根除成功者、12例H.pylori現(xiàn)癥感染者和13例無H.pylori感染史者。納入標(biāo)準(zhǔn):H.pylori根除成功者(ER 組)和無H.pylori感染史者(HC組)：快速尿素酶實(shí)驗(yàn)(RUT)陰性且Warthin-Starry染色(WS染色)陰性。H.pylori現(xiàn)癥感染者(HP組)：RUT陽性和(或)WS染色陽性。所有受試者均詳細(xì)問診既往H.pylori感染史、根除史，北京大學(xué)第三醫(yī)院病歷系統(tǒng)查詢既往胃鏡病理資料。所有受試者1個(gè)月內(nèi)未服用抗生素、微生態(tài)制劑、PPI、H2受體拮抗劑等影響胃內(nèi)菌群的藥物。ER組男4例，女2例，年齡(40.67±10.41)歲(30～57歲)；HP組男7例，女5例，年齡(46.00±10.21)歲(25～60歲)；HC組男7例，女6例，年齡(36.15±10.07)歲(23～55)歲。三組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 主要試劑及器材細(xì)菌基因組提取試劑盒(天根Cat.#DP302-02 Lot#Q5525)；KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR kit；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)；Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度計(jì)；Illumina Miseq PE250。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集：該研究遵循倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)(北京大學(xué)第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究倫理委員會(huì)2019醫(yī)倫審第031-02號(hào)，項(xiàng)目編號(hào)：M2018260)。受試者簽署知情同意書。胃鏡檢查時(shí)，鉗取胃內(nèi)黏膜組織2塊，大小約1 mm×2 mm。立即將黏膜分別置于無菌凍存管中并立即投入液氮內(nèi)凍存，2 h內(nèi)送至-80 ℃低溫冰柜凍存。后續(xù)測(cè)序送樣時(shí)干冰運(yùn)輸。

1.3.2 基因組DNA提取和16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序：組織研磨器內(nèi)對(duì)胃黏膜進(jìn)行組織勻漿，使用細(xì)菌基因組提取試劑盒(天根Cat.#DP302-02 Lot#Q5525)獲取樣本總DNA，具體操作步驟見說明書。利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行總DNA質(zhì)檢。以此為模板，采用帶 Barcode 的特異性引物對(duì)16S rDNA V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為：341F(CCTACGGGRSGCAGCAG)和806R(GGACTACVVGGGTATCTAATC)。純化、定量和均一化產(chǎn)物后，基于Illumina Miseq PE250測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙末端測(cè)序。

1.3.3 測(cè)序數(shù)據(jù)處理：對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控后，用Usearch軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行去嵌合體和聚類分析，Usearch聚類時(shí)，先將Read按照豐度從大到小排序，通過97%相似度進(jìn)行聚類，得到OTU(Operational Taxonomic Units)，每個(gè)OTU被認(rèn)為可代表一個(gè)物種。統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品匹配到OTU的Read數(shù)，為避免因樣品測(cè)序數(shù)據(jù)大小不同造成分析的偏差，在測(cè)序深度足夠的情況下，依據(jù)匹配到OTU的最小序列數(shù)進(jìn)行隨機(jī)抽平處理，進(jìn)行α多樣性分析。從每個(gè)OTU中分別提取一條Read作為代表序列，將該代表序列與RDP數(shù)據(jù)庫比對(duì)，對(duì)每個(gè)OTU進(jìn)行物種分類，得到物種豐度表，進(jìn)行后續(xù)α多樣性分析、β多樣性分析和物種差異及關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果

2.1 樣本測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及OTU分析采用Illumina Miseq PE250測(cè)序平臺(tái)對(duì)31例胃黏膜標(biāo)本微生物群落16S rRNA V3～V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)處理，以97%一致性將序列聚類成為OTU，共得到561個(gè)OTU。統(tǒng)計(jì)三組樣本共有OTU以及OTU所代表的物種，發(fā)現(xiàn)所有樣本均包含三種核心菌屬(Coremicrobiome)，分別是Veillonella、Actinomyces和Pseudomonas。Specaccum物種累積曲線提示抽樣量充分(見圖1)。

注：橫坐標(biāo)是樣品的數(shù)量，縱坐標(biāo)是OTU的數(shù)量。

2.2 物種組成展示分析每個(gè)OTU代表一個(gè)物種。通過物種注釋分析，將所有OTU注釋并歸類至界、門、綱、目、科、屬、種。結(jié)果生成物種相對(duì)豐度柱狀圖。門水平，ER組和HC組主要為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和梭桿菌門(Fusobacteria)；HP組則主要為變形菌門。屬水平，HP組主要為螺桿菌屬(Helicobacter)，而ER組和HC組主要為普氏菌屬(Prevotella)、韋永氏球菌屬(Veillonella)、羅爾斯通菌屬(Ralstonia)、鏈球菌屬(Streptococcus)、奈瑟菌屬(Neisseria)和梭桿菌屬(Fusobacterium)等(見圖2)。此外，通過物種熱圖分析，可知ER組和HC組樣品的物種組成及豐度相似，而HP組與二者有差異(見圖3)。

圖2 不同分類水平中不同組的物種相對(duì)豐度柱狀圖

注：橫向聚類表示該物種在各樣品的豐度相似情況，距離越近，枝長(zhǎng)越短，說明兩物種在各樣品間的組成越相似?？v向聚類表示所有物種在不同樣品間表達(dá)的相似情況，與橫向聚類一樣，距離越近，枝長(zhǎng)越短，說明兩樣品的物種組成及豐度越相似。

2.3 α多樣性分析Observed species、Shannon和Simpson等3個(gè)指數(shù)能夠比較分析群落豐富度指數(shù)(species richness)和群落多樣性指數(shù)(species diversity)，反映群落豐富度的Observed species指數(shù)在三組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而反映群落多樣性的Shannon和Simpson指數(shù)在ER組和HC組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而HP組指數(shù)值顯著低于ER組和HC組(P<0.01)(見圖4)。以上結(jié)果提示，三組間菌群群落豐富度無差異，但與ER組和HC組比較，HP組的胃黏膜菌群群落多樣性發(fā)生了顯著降低；而ER組則與HC組相似。表明H.pylori的感染會(huì)顯著降低胃黏膜菌群群落的多樣性，而H.pylori根除對(duì)菌群多樣性恢復(fù)有益。

注：橫坐標(biāo)表示樣品分組，縱坐標(biāo)表示不同分組下的α多樣性指數(shù)值。盒形圖顯示了5個(gè)統(tǒng)計(jì)量(即由下到上的5條線，依次是最小值、第一個(gè)四分位數(shù)、中位數(shù)、第三個(gè)四分位數(shù)和最大值)，異常值以“o”標(biāo)出。*P<0.05,**P<0.01,NS：差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 β多樣性分析β多樣性分析比較物種多樣性方面存在的差異大小?；赪eighted Unifrac非度量多維尺度分析(non-metricmulti-dimensional scaling，NMDS)能夠揭示各個(gè)樣品間菌群群落的相似性(同時(shí)考慮物種類別和物種相對(duì)豐度)。除個(gè)別離散點(diǎn)外，ER組和HC組樣品明顯聚集于同一區(qū)域，而HP組樣品單獨(dú)聚集于另一區(qū)域(見圖5A)。后續(xù)我們使用基于Weighted Unifrac的UPGMA法對(duì)所有樣品的細(xì)菌群落構(gòu)成的相似性進(jìn)行聚類分析，除樣本HP-4和HC-10外，所有樣本明顯劃分為兩大分類群，分別是ER組所在分類群和ER組及HC組所在分類群(見圖5B)。綜上所述，ER組和HC組各樣品細(xì)菌群落無論在物種類別還是相對(duì)豐度上均相同，而HP組與前兩組均顯著不同。

注：不同顏色樹枝代表不同的分組。

2.5 物種差異及關(guān)聯(lián)分析

2.5.1 組間群落標(biāo)志物：通過LDA EffectSize(LEfSe分析)估算每個(gè)組分(物種)豐度對(duì)差異效果影響的大小，找出對(duì)樣品劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的群落或物種。當(dāng)LDA閾值為4.5時(shí)，圖6A所示三組中各組具有顯著性差異的物種，圖6B為各組內(nèi)顯著差異物種進(jìn)化分支圖。由圖可知，HP組中對(duì)樣品劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的群落或物種是變形菌門-變形菌綱-彎曲菌目-螺桿菌科-螺桿菌屬(Proteobacteria-Epsilonproteobacteria-Campylobacterales-Helicobacteraceae-Helicobacter)；HC組中是擬桿菌門-卟啉單胞菌屬(Bacteroidetes-Porphyromonas)、丙型變形菌綱-假單胞菌屬(Gammaproteobacteria-Pseudomonas)、芽孢桿菌綱-葡萄球菌屬(Bacilli-Staphylococcus)等；ER組是擬桿菌綱-普氏菌屬(Bacteroidia-Prevotella)、厚壁菌門-韋永氏球菌屬(Firmicutes-Veillonella)、擬桿菌目-普雷沃氏菌科(Bacteroidales-Prevotellaceae)、β-變形菌綱-羅爾斯通菌屬(Betaproteobacteria-Ralstonia)等。

注：A：統(tǒng)計(jì)不同分組中有顯著作用的微生物類群通過LDA(線性回歸分析)后得到的LDA分值(LDA閥值2)。B：聚類樹，不同顏色表示不同分組，不同顏色的節(jié)點(diǎn)表示在該顏色所代表的分組中起到重要作用的微生物群。黃色節(jié)點(diǎn)表示的是在不同分組中未起到重要作用的微生物類群。圖中英文字母所表示的物種名稱在右側(cè)圖例中進(jìn)行展示。左邊物種前綴“k__”、“p__”、“c__”、“o__”、“f__”表示物種分別注釋到界、門、綱、目、科水平上。

2.5.2 組間差異分析：為了找出在不同組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的菌屬，使用秩和檢驗(yàn)的方法對(duì)不同分組之間進(jìn)行顯著性差異分析。結(jié)果顯示共有37個(gè)菌屬，顯著性篩選的閾值為P<0.05，同時(shí)對(duì)所有的P值進(jìn)行fdr校驗(yàn)(見圖7)。由圖可知，這些差異菌屬能顯著區(qū)分HP組和另外兩組，但對(duì)于ER組和HC組的區(qū)分度較低。

注：A：橫向聚類表示該物種在各樣品豐度相似情況，距離越近，枝長(zhǎng)越短，說明兩物種在各樣品間的組成越相似。縱向聚類表示所有物種在不同樣品間表達(dá)的相似情況，距離越近，枝長(zhǎng)越短，說明樣品的物種組成及豐度越相似。B：橫坐標(biāo)表示第一主成分，縱坐標(biāo)表示第二主成分，百分比則表示主成分對(duì)樣品差異的貢獻(xiàn)值；圖中的每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)樣品，同一個(gè)組的樣品使用同一種顏色表示。

2.5.3 差異物種Spearman相關(guān)系數(shù)分析：為了分析各差異物種間的相關(guān)性，我們將所有分類水平上豐度排前30的差異物種進(jìn)行Spearman相關(guān)系數(shù)分析。螺桿菌屬與其他屬均顯示呈負(fù)相關(guān)，其中與擬普雷沃菌屬、普氏菌屬、梭菌屬(Fusobacterium)和放線菌屬呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)，與消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)呈弱負(fù)相關(guān)；葡萄球菌屬(Staphylococcus)與消化鏈球菌屬呈負(fù)相關(guān)。此外，菌屬越是與螺桿菌屬呈負(fù)相關(guān)，則菌屬間正相關(guān)性越強(qiáng)，如普氏菌屬與梭菌屬(見圖8)。

注：在所有分類水平上，豐度Top30的差異物種之間的相關(guān)性系數(shù)，右邊藍(lán)色表示正相關(guān)，紅色表示負(fù)相關(guān)。顏色越深，表明物種之間的相關(guān)性越強(qiáng)。

2.5.4 CXCL17與差異物種之間Spearman相關(guān)性熱圖分析：胃黏膜表達(dá)抗菌趨化因子CXCL17。通過使用LEfSe 屬水平的差異物種和本課題所得的胃黏膜、胃液CXCL17趨化因子濃度(數(shù)據(jù)暫未發(fā)表)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)胃黏膜趨化因子CXCL17與棒狀桿菌屬(Corynebacterium)和微球菌屬(Micrococcus)呈負(fù)相關(guān)。胃液趨化因子CXCL17與普氏菌屬呈負(fù)相關(guān)。此外，螺桿菌屬與CXCL17不存在相關(guān)性(見圖9)。

注：圖中橫坐標(biāo)代表環(huán)境因子(Mu為胃黏膜趨化因子CXCL17；Gj為胃液趨化因子CXCL17)，縱坐標(biāo)代表物種，顏色的深淺直觀展示物種與環(huán)境因子的相關(guān)性大?。煌瑫r(shí)進(jìn)行相關(guān)性顯著檢驗(yàn)；+P<0.05,*P<0.01。

2.6 PICRUSt胃黏膜菌群功能預(yù)測(cè)分析使用LEfSe分析方法，發(fā)現(xiàn)對(duì)HC組樣品劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的代謝途徑有碳水化合物代謝(Carbohydrate Metabolism)、Poorly Characterized和轉(zhuǎn)錄(Transcription)等。HP組有細(xì)胞活性(Cell Motility)、遺傳信息處理(Genetic Information Processing)、能量代謝(Energy Metabolism)、復(fù)制和修復(fù)(Replication and Repair)、折疊分類及降解(Folding Sorting and Degradation)和糖的生物合成和代謝(Glycan Biosynthesis and Metabolism)等。ER組有膜運(yùn)輸(Membrane Transport)、生物降解及代謝(Xenobiotics Biodegradation and Metabolism)、氨基酸代謝(Amino Acid Metabolism)和新陳代謝(Metabolism)等(見圖10)?？傊鹘M間代謝途徑差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義并且HP組和ER組涉及更多疾病相關(guān)代謝途徑，尤其HP組在感染疾病、癌癥途徑中豐度較高，而在氨基酸、脂質(zhì)和碳水化合物代謝途徑中豐度較低，而HC組則無。推測(cè)這些菌群引起的代謝途徑的差異可能與H.pylori相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，且ER組和HC組盡管菌群組成相似，但功能上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注：橫坐標(biāo)為在不同分組中有顯著性作用的KEGG_pathway通過LDA(線性回歸分析)后得到的log值(只有兩組比較時(shí)，對(duì)稱顯示，LDA的分值為絕對(duì)值)，不同顏色代表該KEGG_pathway在不同組樣品中富集。

3 討論

胃黏膜存在獨(dú)特的微生物群落[9]。H.pylori、抗生素和抑酸藥物如PPI等影響它[15]。H.pylori是胃內(nèi)最重要的但并非唯一的病原體。胃內(nèi)菌群紊亂可能會(huì)引發(fā)或促進(jìn)慢性胃炎和胃癌等疾病的發(fā)生發(fā)展[9]。H.pylori根除不影響腸道菌群如大腸桿菌耐藥性[17]，為了探索H.pylori根除對(duì)胃黏膜菌群的影響，本研究基于Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)，采用Pair-end雙末端測(cè)序的方法，對(duì)細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行高通量測(cè)序分析，通過比較ER組、HP組和HC組的菌群差異，試圖探索H.pylori根除所引起的菌群變化情況。研究中，仍然將幽門桿菌歸類為變形菌門而非彎曲菌門[18]。本研究結(jié)果表明，H.pylori感染后，胃黏膜菌群α多樣性分析表明物種多樣性顯著下降，但菌群相對(duì)豐度不受影響；β多樣性分析結(jié)果表明，HP組和HC組組內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)相似性均較高，而兩組間的菌群結(jié)構(gòu)差異顯著，相似性低。當(dāng)根除H.pylori后，ER組胃黏膜菌群與HC組相似。這些結(jié)果提示H.pylori感染導(dǎo)致胃黏膜菌群發(fā)生紊亂，根除H.pylori能逆轉(zhuǎn)這種改變，使胃黏膜菌群恢復(fù)至與無感染H.pylori史者相似狀態(tài)。

然而，UPGMA層次聚類分析提示盡管HC組和ER組樣本間相似，但似乎ER組各樣本間相對(duì)更集中，提示ER組樣本間更相似，與HC組樣本間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究由于ER組樣本數(shù)少，需要后續(xù)擴(kuò)大樣本進(jìn)一步分析。這種差異可能與抗生素或PPI等藥物相關(guān)[15-16]，也可能類似腸道菌群，只是胃黏膜菌群可塑性的必然結(jié)果[19]，需要更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)年?duì)列研究分析探討。

如腸道菌群一樣，胃內(nèi)菌群密度盡管很低，但也是由一組具有個(gè)體特異性和代謝特點(diǎn)的多樣性物種組成，它們也可能是宿主新陳代謝和免疫系統(tǒng)強(qiáng)有力的調(diào)節(jié)因子[19]。CXCL17是最新發(fā)現(xiàn)的趨化因子，在胃黏膜表達(dá)，具有多種功能，如抗微生物活性[20-21]。研究結(jié)果顯示胃黏膜趨化因子CXCL17與棒狀桿菌屬(Corynebacterium)和微球菌屬(Micrococcus)呈負(fù)相關(guān)。胃液趨化因子CXCL17與普氏菌屬呈負(fù)相關(guān)。此外，螺桿菌屬與CXCL17不存在相關(guān)性。這些提示胃黏膜和胃液CXCL17可能影響胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)，對(duì)H.pylori可能無影響。但需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究確認(rèn)。

此外，16S功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)各組間代謝途徑差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且HP組和ER組涉及更多疾病相關(guān)代謝途徑，尤其HP組在感染疾病、癌癥途徑中豐度較高。而HC組則無。這些功能預(yù)測(cè)需要進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。而背后原因可能與放線菌屬、梭菌屬、普氏菌屬、鏈球菌屬、韋永氏球菌屬、擬普雷沃菌屬、嗜血桿菌屬、奈瑟氏菌屬和卟啉單胞菌屬等物種相對(duì)豐度的顯著變化有關(guān)。有研究[22-24]認(rèn)為，這些菌屬可能在胃炎、胃潰瘍和胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起作用。

本部分研究尚存在不足之處。首先，受胃黏膜取樣困難及時(shí)間限制，樣本例數(shù)較少；其次，黏膜取樣未進(jìn)行胃竇、胃體等的分類，但研究普遍認(rèn)為胃內(nèi)不同部位菌群無差異[11]；其次，局限于相關(guān)性研究而非因果性研究，需進(jìn)一步探討等。

綜上所述，H.pylori的定植會(huì)顯著改變胃黏膜的菌群結(jié)構(gòu)，而根除H.pylori能使菌群恢復(fù)至與無感染史者相似狀態(tài)(擬健康狀態(tài))。這可能也部分解釋根除H.pylori受益原因。因此，了解H.pylori根除對(duì)胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)的影響，為H.pylori根除治療進(jìn)一步提供了理論依據(jù)，并為胃內(nèi)疾病治療提供基于微生態(tài)的新思路。此外，抗菌趨化因子CXCL17與胃內(nèi)部分菌群具有相關(guān)性，提示胃內(nèi)菌群與機(jī)體局部免疫系統(tǒng)可能互相作用，這可能有助于胃內(nèi)菌群與免疫系統(tǒng)相互作用的深入探討。