張澤鋒，劉婉薇，張曉光

廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)消化內(nèi)鏡中心，廣東 廣州 510080

B細(xì)胞特異性MLV整合位點(diǎn)-1(B cell-specific MLV integration site-1，Bmi-1)基因于1991年由荷蘭癌癥中心在鼠淋巴瘤中首次發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已證實(shí)其廣泛參與血液系統(tǒng)及多種實(shí)體瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[1-3]。少數(shù)具有自我更新、分化、轉(zhuǎn)移、放化療抵抗性等特征，具有特定表面標(biāo)志物的腫瘤細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)，認(rèn)為其在腫瘤的轉(zhuǎn)移中起重要作用[4]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)指上皮細(xì)胞失去極性，經(jīng)過(guò)細(xì)胞骨架重塑，轉(zhuǎn)變成具有遷移能力的間充質(zhì)表型過(guò)程，參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展；而E-cadherin的下調(diào)或缺失和/或Vimentin的上調(diào)認(rèn)為是EMT的標(biāo)志性事件[5]。

前期研究中，我們通過(guò)收集35例結(jié)腸癌新鮮標(biāo)本證實(shí)Bmi-1在結(jié)腸癌組織的表達(dá)明顯高于癌旁組織及正常組織，且其表達(dá)水平與侵犯深度呈正相關(guān)；同時(shí)我們已初步篩選出CD133+CD44+HCT116結(jié)腸癌干細(xì)胞模型[6]，因此，本研究旨在進(jìn)一步探討B(tài)mi-1促進(jìn)結(jié)腸癌干細(xì)胞發(fā)生遷移、侵襲的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)(The Cell Bank of the Committee on Type Culture Collection of the Chinese Academic of Science，CCTCC，China)；HCT116細(xì)胞在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2條件下，于含質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清(Gibco-BRL，USA)的RPMI-1640培養(yǎng)基(Corning，USA)中培養(yǎng)。成球培養(yǎng)基法(sphere formation media，SFM)的配置為20 ng/ml的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)(PeproTech，USA)、20 ng/ml的表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)(PeproTech，USA)、2%的B27(按1∶50稀釋，Gibco-BRL，USA)和0.4%的BSA(Invitrogen Life Technologies，USA)溶液加入RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 流式細(xì)胞學(xué)細(xì)胞稀釋為1×107/100 μl濃度并重懸于PBS溶液后，低溫保存送往中山大學(xué)附屬孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室測(cè)定CD133和CD44表達(dá)比例。

1.3 磁珠分選法(magnetic-activated cell sorting, MACS)SFM培養(yǎng)后HCT116細(xì)胞調(diào)整濃度為1×107ml-1后，按EasySep(STEMCELL Technologies，Inc.)說(shuō)明書逐步加入100 μl人特異性的FCR阻滯抗體、50 μl PE-CD133抗體、100 μl EasysepTMPE細(xì)胞分選抗體混合物、緩沖液等分選結(jié)腸癌干細(xì)胞，最后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)基流式細(xì)胞學(xué)鑒定。

1.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)分別各取50個(gè)、100個(gè)和200個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)至肉眼可見白色克隆球時(shí)，PBS溶液洗滌、甲醇固定后，加入10% Giemsa溶液染色30 min，顯微鏡下計(jì)算>50個(gè)細(xì)胞的克隆球數(shù)，同時(shí)計(jì)算細(xì)胞平板克隆率。

1.5 CCK8法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)取相同細(xì)胞數(shù)的不同細(xì)胞懸液100 μl接種于96孔板中，同時(shí)設(shè)RPMI-1640組為空白對(duì)照組，孵育至細(xì)胞全部貼壁后，加入10 μl CCK溶液(Dojindo，Japan)繼續(xù)孵育4 h至溶液變?yōu)辄S色，酶標(biāo)儀450 nm下測(cè)量96孔板各孔的吸光度值(OD值)。

1.6 裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)4～6周雄性BALB/C-nu/nu裸鼠(11～15 g)購(gòu)自中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[生產(chǎn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(粵)2011-0029]，于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)別屏障設(shè)施中飼養(yǎng)4周；HCT116細(xì)胞按不同分組不同濃度于裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射200 μl懸液，飼養(yǎng)期間觀察裸鼠的一般情況及繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線圖；4周后所有裸鼠(實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)死亡)經(jīng)水合氯醛腹腔麻醉后手術(shù)取出瘤體，瘤體取出后均固定于10%的中性福爾馬林溶液中，立即送廣州谷歌生物有限公司制作組織切片。最后，采用頸椎脫臼法處死所有裸鼠，判斷死亡后送動(dòng)物中心統(tǒng)一無(wú)害化處理。實(shí)驗(yàn)倫理審查批準(zhǔn)同意書編號(hào)：粵醫(yī)科倫理KY2020-252-02號(hào)(GDRECKY-2020-252-02)。

1.7 Bmi-1質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染Bmi-1的編碼序列為：5′-CTAGCTAGCTAGCATCGAACAACGAGAATCA-3′，3′-CCGCTCGAGTCAACCAGAAGAAGTTGCTGATG-5′(NM_005180.8)，過(guò)表達(dá)Bmi-1的質(zhì)粒Bmi-1/pcDNA3.1(+)外購(gòu)自Geneseed生物科技公司(中國(guó)，廣州)，測(cè)序驗(yàn)證外送IGE生物科技公司(中國(guó)，廣州)；細(xì)胞分為質(zhì)粒組、空載體對(duì)照組和普通組，按說(shuō)明書使用2 μg Bmi-1/pcDNA3.1(+)或空載體轉(zhuǎn)染CD133+CD44+HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞，Lipofectamine 2000(Invitrogen，Inc)轉(zhuǎn)染24 h。

1.8 Western blotting實(shí)驗(yàn)細(xì)胞裂解離心后收集蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，依次進(jìn)行蛋白變性、電泳、一抗(Bmi-1、E-cadherin、Vimentin；Cell Signaling Technology，America)二抗(GAPDH，上?？党桑袊?guó))孵育后化學(xué)發(fā)光后，置于ImageQuant LAS 500中曝光；最后用Imagepro Plus 6.0處理目標(biāo)條帶的光密度值。

1.9 平板劃痕實(shí)驗(yàn)6孔板背后提前化橫線，每孔確保5條橫線穿過(guò)；6孔板各孔加入不同分組相應(yīng)濃度細(xì)胞(5×105個(gè))進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后用100 μl槍頭垂直各孔中線劃1條橫線，顯微鏡下拍照；培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h后再拍照，Imagepro Plus 6.0軟件分別測(cè)量劃痕區(qū)域的像素定量，計(jì)算各組細(xì)胞24 h的平均遷移速度。

1.10 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)Transwell小室置于24孔板中，每個(gè)小室上室加入100 μl Matrigel matrix(BD，USA)，孵育至凝固成薄膜狀。各個(gè)小室上方及下方分別加入RPMI-1640溶液和含20% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，各孔加入相同濃度(1×105ml-1)的細(xì)胞懸液100 μl，培養(yǎng)24 h后PBS洗滌、甲醛固定、10% Giemsa溶液染色干燥后，顯微鏡下計(jì)算下室細(xì)胞數(shù)及侵襲率。

2 結(jié)果

2.1 CD133+CD44+HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞可作為結(jié)腸癌干細(xì)胞研究模型結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞經(jīng)SFM及MACS篩選后，流式細(xì)胞學(xué)鑒定CD133+CD44+HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞比例明顯升高(見圖1A～1B)；體外平板克隆實(shí)驗(yàn)及CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)CD133+CD44+HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞較對(duì)照組具有更高的克隆率及生長(zhǎng)增殖能力(見圖1C～1F)，裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)CD133+CD44+HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞較對(duì)照組具有更高的成瘤率(見圖1G～1H)，因而CD133+CD44+HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞可作為結(jié)腸癌干細(xì)胞研究模型。

注：A：HCT116細(xì)胞中CD133+CD44+HCT116細(xì)胞的表達(dá)比例<1.00%；B：經(jīng)SFM及MACS后，CD133+CD44+HCT116細(xì)胞的表達(dá)比例高達(dá)(82.91±1.60)%；C～E：CD133+CD44+HCT116細(xì)胞和CD133-CD44-HCT116細(xì)胞的體外平板克隆率分別為(78.44±6.54)%和(8.22±2.68)%；F：不同細(xì)胞數(shù)的CD133+CD44+HCT116細(xì)胞和CD133-CD44-HCT116細(xì)胞的體外生長(zhǎng)增殖曲線；G：分別注射200 μl生理鹽水、CD133+CD44+HCT116細(xì)胞和CD133-CD44-HCT116細(xì)胞后裸鼠4周內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)曲線；H：注射不同濃度(1×106 ml-1、1×105 ml-1、1×104 ml-1)的CD133+CD44+HCT116細(xì)胞4周后瘤體大小，CD133+CD44+HCT116細(xì)胞組100%成瘤。*P<0.05。

2.2 過(guò)表達(dá)Bmi-1的CD133+CD44+HCT116結(jié)腸癌干細(xì)胞發(fā)生EMT在CD133+CD44+HCT116結(jié)腸癌干細(xì)胞中，Western blotting結(jié)果提示，質(zhì)粒組Bmi-1/pcDNA3.1(+)較空載體對(duì)照組(pcDNA3.1)及普通組(Normal)Bmi-1表達(dá)明顯升高，同時(shí)細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)與Bmi-1呈負(fù)相關(guān)，而Vimentin的表達(dá)與Bmi-1呈正相關(guān)，提示CD133+CD44+HCT116結(jié)腸癌干細(xì)胞在過(guò)表達(dá)Bmi-1后發(fā)生EMT(見圖2)。

注：*P<0.05。

2.3 過(guò)表達(dá)Bmi-1的CD133+CD44+HCT116結(jié)腸癌干細(xì)胞遷移和侵襲能力更強(qiáng)過(guò)表達(dá)Bmi-1的CD133+CD44+HCT116結(jié)腸癌干細(xì)胞的24 h遷移速度為(18.44±0.59)μm/h，明顯高于空質(zhì)粒對(duì)照組(1.88±0.21)μm/h和普通組(1.92±0.36)μm/h(P<0.05，見圖3A～3D)；過(guò)表達(dá)Bmi-1的CD133+CD44+HCT116結(jié)腸癌干細(xì)胞的24 h侵襲細(xì)胞數(shù)(37.67±2.51)明顯高于空質(zhì)粒對(duì)照組(9.33±0.58)和普通組(7.67±0.58)(P<0.05，見圖3E～3G)。

注：A：CD133+CD44+HCT116細(xì)胞劃痕開始結(jié)果；B：普通組24 h劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果；C：空質(zhì)粒對(duì)照組24 h劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果；D：Bmi-1質(zhì)粒組24 h劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果；E：普通組24 h Transwell結(jié)果；F：空質(zhì)粒對(duì)照組24 h Transwell結(jié)果；G：Bmi-1質(zhì)粒組24 h Transwell結(jié)果。

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率分別位居全球惡性腫瘤第3位和第2位，在消化系統(tǒng)中位居首位，嚴(yán)重威脅人民群眾的生命健康[7]。2018年我國(guó)新發(fā)結(jié)直腸癌病例超過(guò)52.1萬(wàn)，死亡病例達(dá)24.8萬(wàn)，新發(fā)和死亡病例均接近全世界同期結(jié)直腸癌病例的30%[8]。早期結(jié)直腸癌治療后的5年生存率可超過(guò)95%，然而現(xiàn)階段我國(guó)的早期結(jié)直腸癌診斷率低于10%，85%以上的結(jié)直腸癌發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬晚期，即經(jīng)過(guò)手術(shù)、放化療及靶向治療等綜合治療后5年生存率仍低于40%[9]；我國(guó)的結(jié)直腸癌5年生存率遠(yuǎn)低于歐美和日韓等發(fā)達(dá)國(guó)家[10]。因而，探討結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制及尋找新的治療靶點(diǎn)，對(duì)于判斷預(yù)后、指導(dǎo)綜合治療的實(shí)施以及發(fā)展新的治療措施具有重要的社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義。

腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)多階段、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，其最先出現(xiàn)局部浸潤(rùn)，即腫瘤細(xì)胞失去細(xì)胞間的粘附而出現(xiàn)遷移，從而向臨近組織浸潤(rùn)；緊接著內(nèi)滲進(jìn)入血液循環(huán)，繼而外滲遷移出血管，在遠(yuǎn)處器官建立微小轉(zhuǎn)移灶。在新的微環(huán)境中，只有少部分轉(zhuǎn)移來(lái)的腫瘤細(xì)胞可以克隆生長(zhǎng)并形成轉(zhuǎn)移癌，而這少部分腫瘤細(xì)胞通常被認(rèn)為CSCs，具有自我更新、分化、轉(zhuǎn)移、放化療抵抗性等特征[11]。CSCs標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)為研究腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了新的視角。結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物包括CD133、CD44、CD166、CD24、CD26、CD29、EpCAM等粘附分子，ALDH1胞質(zhì)酶、Oct4、Sox2、Ascl2、Hes1等轉(zhuǎn)錄因子，Wnt信號(hào)通路及其傳導(dǎo)目標(biāo)基因Lgr5，Notch信號(hào)通路等[12]。在前期研究中，我們采用CD133及CD44兩種表面標(biāo)志物篩選結(jié)腸癌干細(xì)胞，我們推測(cè)CD133可能與細(xì)胞的克隆增殖能力相關(guān)，而CD44可能與細(xì)胞轉(zhuǎn)移和生存預(yù)測(cè)相關(guān)，兩種標(biāo)志物聯(lián)合更有助于篩選出真正意義上的結(jié)腸癌干細(xì)胞；同時(shí)證實(shí)了CD133+CD44+HCT116細(xì)胞較CD133-CD44-HCT116細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞活性/增殖能力和更高的體外平板克隆率和裸鼠體內(nèi)致瘤率。因而，我們提出了CD133+CD44+HCT116細(xì)胞可作為后續(xù)研究中結(jié)腸癌干細(xì)胞模型[6]。

我們的前期研究表明，Bmi-1在人結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，Bmi-1在結(jié)腸癌組織的表達(dá)率明顯高于癌旁組織及正常組織，且其表達(dá)水平與浸潤(rùn)深度呈正相關(guān)，與腫瘤惡性及分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、部位等有明顯相關(guān)性。在結(jié)腸癌細(xì)胞株LOVO中，靶向阻斷Bmi-1的表達(dá)可有效抑制LOVO細(xì)胞的增殖、侵襲能力，并出現(xiàn)EMT的表型改變；而在結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116中，siRNA阻斷Bmi-1后，E-cadherin呈上調(diào)趨勢(shì)。E-cadherin是一種對(duì)細(xì)胞連接起重要作用的跨膜蛋白，能抑制腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移；細(xì)胞表面E-cadherin的下調(diào)或丟失可導(dǎo)致細(xì)胞從瘤體上脫落，從而引起腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移[13]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Bmi-1后，CD133+CD44+HCT116結(jié)腸癌干細(xì)胞出現(xiàn)E-cadherin的下調(diào)和Vimentin的上調(diào)，同時(shí)細(xì)胞的遷移、侵襲能力增強(qiáng)。因而我們提出Bmi-1通過(guò)介導(dǎo)EMT來(lái)促進(jìn)結(jié)腸癌干細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲，這與先前的研究結(jié)果一致[14]。

現(xiàn)有研究表明，在鼻咽癌[15]、乳腺癌[16]、肺癌[17]、胃癌[18]等多種腫瘤中，Bmi-1通過(guò)PTEN-PI3K/AKT促進(jìn)腫瘤發(fā)生EMT而發(fā)生轉(zhuǎn)移。因而，我們推測(cè)Bmi-1也很可能通過(guò)PI3K/AKT分子機(jī)制介導(dǎo)結(jié)腸癌發(fā)生EMT從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生遷移和侵襲。然而，由于EMT涉及復(fù)雜的分子信號(hào)通路，包括TGF-β、Wnt、Notch、Hedgehog、PI3K/AKT、NF-κB、MAPK等[19]，且各信號(hào)通路還存在串流，明確Bmi-1促進(jìn)結(jié)腸癌中轉(zhuǎn)移的具體信號(hào)通路需要后續(xù)更全面的機(jī)制研究。我們期望本研究能為結(jié)腸癌新的治療靶點(diǎn)提供相關(guān)理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)提高結(jié)腸癌患者的臨床預(yù)后和5年生存率。