王 妍，萬 瑩，馮士春，任玨輝，蔡 明，翟曉璐，潘劉翃

南通市第一人民醫(yī)院 1.老年病科；2.普外科；3.腫瘤科；4.消化內(nèi)科，江蘇 南通 226000

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)嚴重影響人類生命健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居前三位[1]。近年來，隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展、城鄉(xiāng)居民生活方式的改變、飲食結(jié)構(gòu)的西方化、環(huán)境的改變和人口的老齡化，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率正逐步升高，成為影響人民健康最常見的惡性腫瘤之一[2]。目前臨床上治療結(jié)直腸癌的首選方法為手術(shù)切除并輔以化療。早期結(jié)直腸癌患者預后尚可，晚期患者治療效果與預后極差。如何判斷結(jié)直腸癌患者的預后及其治療靶點是當前研究的熱點。

結(jié)直腸癌的發(fā)生往往源于腫瘤基因的表達異常，因此尋找腫瘤相關(guān)基因?qū)榻Y(jié)直腸癌治療新手段的開發(fā)提供理論依據(jù)。鋅-α2-糖蛋白1(Zinc-α2-glycoprotein 1，AZGP1)是一種分子量為41 kDa的分泌蛋白，最早從人類血液中被鑒定出來，被認為是一種脂肪因子進而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[3-4]。隨后越來越多的研究顯示，AZGP1是一個重要的調(diào)控腫瘤生長的分子，其在肺癌、前列腺癌、肝癌等腫瘤中表達異常，并且與腫瘤的預后相關(guān)[5-7]。在結(jié)直腸癌組織和血清中，AZGP1異常高表達，同時有研究顯示血清中高表達AZGP1有望成為結(jié)直腸癌一個診斷標志物[8]。然而，AZGP1在結(jié)直腸癌組織中高表達是否與其促進結(jié)直腸癌細胞的惡性增殖相關(guān)，仍需要進一步明確。本研究運用免疫組化方法，檢測結(jié)直腸癌組織中AZGP1蛋白表達，分析其與結(jié)直腸癌臨床病理特征間的關(guān)系，并進行生存分析。通過慢病毒載體，下調(diào)結(jié)直腸癌細胞中AZGP1的表達，觀察其對結(jié)直腸癌細胞增殖的影響，旨在明確AZGP1調(diào)控結(jié)直腸癌惡性增殖的作用，為結(jié)直腸癌的早期診斷和靶向治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2015年1月至2015年6月于我院行手術(shù)切除的結(jié)直腸癌存檔蠟塊和癌旁正常組織(距病變部位>5 cm處，且證實為無癌浸潤)蠟塊各70例，均為老年結(jié)直腸患者，男36例，女34例；年齡(66.3±3.04)歲(60～75歲)。納入標準：經(jīng)細胞學及組織學病理確診為結(jié)直腸癌，可以明確腫瘤大小、部位、浸潤程度。術(shù)前無放療、化療治療史。排除標準：術(shù)前經(jīng)影像學檢查無法確定TNM分期；合并嚴重肝腎疾?。换加醒合到y(tǒng)疾病或傳染病等。隨訪情況：采用門診和電話的方式隨訪5年，第1年每3個月隨訪1次，第2～3年每6個月隨訪1次，第4～5年每年隨訪1次，末次隨訪時間為2020年6月。隨訪主要通過體格檢查、腹部CT或結(jié)腸鏡檢查確定患者腫瘤的復發(fā)、轉(zhuǎn)移情況。

1.2 主要試劑人結(jié)直腸癌細胞系HCT116購自美國ATCC細胞庫，人結(jié)直腸癌細胞系SW480、LoVo和RKO購自中國科學院細胞庫。細胞培養(yǎng)試劑(DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、鏈霉素青霉素、胰酶)購自美國Gibco公司。細胞增殖活性檢測試劑MTT(貨號11465007001MSDS)購自Sigma公司；細胞周期檢測PI試劑盒(貨號04511MSDS)購自Sigma公司；ECL發(fā)光試劑(貨號P0018M)，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒(貨號P0009)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Advantage RT-for-PCR Kit(貨號639505)購自Clontech公司；One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit(貨號RR066A)購自Takara公司；shAZGP1、shcon慢病毒載體由上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司設(shè)計合成。cyclin D1抗體(A-12)(貨號sc-8396)購自圣克魯斯生物技術(shù)公司；active-caspase-3抗體(E83-77)(貨號ab32042)購自abcam公司；caspase-3抗體(E-8)(貨號sc-7272)購自圣克魯斯生物技術(shù)公司；GAPDH抗體(0411)(貨號sc-47724)、Akt1抗體(B-1)(貨號sc-5298)、p-Akt抗體(B-12)(貨號sc-377556)、PI3K抗體(C-1)(貨號sc-376112)均購自圣克魯斯生物技術(shù)公司。

1.3 AZGP1干擾細胞模型的建立將處于對數(shù)生長期的結(jié)直腸癌細胞HCT116及SW480用胰酶消化并制成細胞懸液，接種于6孔板中，37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2恒溫箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達到70%后，分別加入對照慢病毒(shcon)、干擾RNA慢病毒(shAZGP1)，病毒加入量根據(jù)感染系數(shù)(MOI)計算，HCT116細胞株為15，SW480細胞株為30，48 h后即可觀察熒光表達情況和細胞的形態(tài)學變化，并進行后續(xù)實驗。

1.4 RT-PCR檢測收集慢病毒感染細胞，采用Trizol裂解液裂解細胞，加入氯仿靜置10 min，離心后吸取上層，加入異丙醇靜置后離心去上清，75%乙醇洗滌沉淀獲得總mRNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入引物(AZGP1上游引物:GCAGGGAAGGTTTGGTTG；下游引物:CAGGCTGGGATTTCTTTGT)、SYBR試劑進行RT-PCR反應，計算后以-ΔΔCt反映各樣品相對對照組樣品目的基因的相對表達水平。

1.5 MTT檢測將陰性對照組(con)、慢病毒對照組(shcon)、AZGP1敲低組(shAZGP1)細胞分別接種于96孔板，每孔2 000個細胞，每組設(shè)立3個復孔，分別于種板后的第1、2、3、4、5天檢測，檢測時每孔加入10 μl(5 g/L)的MTT溶液，37 ℃孵育4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入200 μl DMSO進行震蕩待充分溶解，酶標儀490 nm波長下檢測密度值(OD)。

1.6 細胞克隆形成實驗感染后并處于生長對數(shù)期的各組細胞胰酶消化后重懸制成細胞懸液，計數(shù)板計數(shù)，于6孔板中接種，各組細胞500個/孔，每組設(shè)3個復孔，置于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至大多數(shù)單個克隆細胞>50，4%多聚甲醛固定30 min后Giemsa染液染色后拍照計數(shù)。

1.7 細胞周期檢測感染后的細胞生長至融合度80%時，胰酶消化制成細胞懸液，4 ℃ 75%乙醇固定細胞1 h后采用D-Hanks洗滌細胞2次，采用細胞周期染液(碘化吡啶PI/RNase/D-Hanks液)進行染色，采用流式細胞儀檢測PI各時相熒光強度。

1.8 Western blotting檢測蛋白表達加入蛋白裂解液提取細胞中總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白上樣，進行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，質(zhì)量濃度為50 g/L脫脂牛奶封閉1 h。加入一抗，4 ℃孵育過夜。洗膜后，加入辣根過氧化酶標記的二抗，室溫孵育2 h。洗膜后，ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，Iamge J軟件分析蛋白條帶的灰度值。以GADPH為內(nèi)參，目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值表示目的蛋白的相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1 AZGP1蛋白在結(jié)直腸癌及癌旁正常組織中的表達情況本研究分析了70例結(jié)直腸癌組織及70例癌旁正常組織中AZGP1蛋白的表達。在結(jié)直腸癌組織中，AZGP1蛋白表達定位在胞漿、胞膜。癌旁正常組織染色為陰性；低表達組織染色為淡黃色；高表達組織染色為棕褐色(見圖1)。AZGP1蛋白在結(jié)直腸癌組織的高表達陽性率為65.71%，而癌旁正常組織為27.14%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，見表1)。

注：A、D為結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織陰性對照，B、E為AZGP1蛋白在結(jié)直腸癌組織中低表達典型圖像，C、F為AZGP1蛋白在結(jié)直腸癌組織中高表達典型圖像。

表1 AZGP1蛋白在結(jié)直腸癌組織、癌旁正常組織中的表達

2.2 AZGP1在結(jié)直腸癌細胞系中的表達情況為了評價AZGP1在結(jié)直腸癌中的作用，我們檢測了AZGP1在4種結(jié)直腸癌細胞(LoVo、HCT116、SW480和RKO)中的表達水平，結(jié)果顯示，與RKO和LoVo細胞相比，HCT116和SW480的AZGP1蛋白和mRNA表達水平高(見圖2)。隨后，HCT116和SW480細胞被選作進一步的實驗。

注：A～B：Western blotting檢測AZGP1蛋白在四種結(jié)直腸癌細胞系(LoVo、HCT116、SW480、RKO)中的表達情況；C：RT-PCR檢測AZGP1 mRNA在四種結(jié)直腸癌細胞系(LoVo、HCT116、SW480、RKO)中的表達情況。

2.3 AZGP1蛋白與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系進一步分析AZGP1蛋白的表達與老年結(jié)直腸癌患者各項臨床病理特征間的關(guān)系, 發(fā)現(xiàn)AZGP1蛋白的表達與結(jié)直腸癌患者臨床Dukes分期、腫瘤浸潤程度、腫瘤大小、肝臟轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，而與患者性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度無關(guān)(P>0.05，見表2)。

表2 AZGP1蛋白與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

2.4 AZGP1蛋白表達對結(jié)直腸癌患者術(shù)后生存時間的影響Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示：AZGP1高表達患者的5年生存率為47.72%；而AZGP1低表達患者的5年生存率為69.38%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=3.063，P<0.05，見圖3)。

圖3 AZGP1低表達和高表達患者的生存曲線

2.5 慢病毒感染可有效敲低AZGP1在結(jié)直腸癌細胞中的表達通過慢病毒感染建立敲低AZGP1的細胞模型，結(jié)果顯示，慢病毒在SW480及HCT116細胞中感染效率良好，RT-PCR實驗顯示其能有效降低細胞中AZGP1 mRNA表達(見圖4)。

圖4 慢病毒感染可有效敲低AZGP1在結(jié)直腸癌細胞中的表達 A：慢病毒感染后熒光顯微鏡下觀察熒光情況；B：RT-PCR檢測感染后AZGP1 mRNA表達水平

2.6 敲低AZGP1可抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖為了進一步探討敲低AZGP1后對細胞生長的影響，MTT實驗檢測發(fā)現(xiàn)，AZGP1敲低后較con組及shcon組的細胞存活率在第3天開始出現(xiàn)較明顯的降低，第4天、第5天可觀察到差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。con組與shcon組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖5)。

注：*P<0.05, **P<0.01。

2.7 敲低AZGP1可抑制結(jié)直腸癌細胞的克隆形成shAZGP1敲低組的細胞克隆形成能力較con組及shcon組顯著下降，以上結(jié)果說明敲低AZGP1可顯著降低結(jié)直腸癌細胞的增殖能力(見圖6)。

注：**P<0.01。

2.8 敲低AZGP1可促進結(jié)直腸癌細胞G1/S期的阻滯為了進一步探討敲低AZGP1抑制結(jié)直腸癌細胞增殖的原因，我們通過流式細胞術(shù)檢測細胞周期情況，結(jié)果顯示，敲低AZGP1后，HCT116、SW480細胞G1期細胞數(shù)增加，而S期細胞數(shù)下降，G2/M期細胞數(shù)無差異，因此，敲低AZGP1可阻滯G1/S期(見圖7)。

注：*P<0.05，**P<0.01。

2.9 敲低AZGP1可下調(diào)cyclin D1表達，促進結(jié)直腸癌細胞凋亡為了進一步探討敲低AZGP1促進結(jié)直腸癌細胞G1/S期阻滯的結(jié)果，我們通過Western blotting檢測SW480細胞周期相關(guān)分子和凋亡標志分子caspase-3的表達情況，結(jié)果顯示，敲低AZGP1后，SW480結(jié)直腸癌細胞中cyclin D1表達下降，而活化的caspase-3表達增加，因此,敲低AZGP1可促進結(jié)直腸癌細胞的凋亡(見圖8)。

注：*P<0.05。

2.10 敲低AZGP1抑制PI3K/AKT信號通路蛋白的表達水平在SW480細胞系中，敲低AZGP1后，shAZGP1組PI3K/AKT信號蛋白的表達水平受到抑制，低于shcon組和con組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖9)。

3 討論

全球社會人口年齡結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)老年化，隨著年齡的增長，惡性腫瘤的發(fā)病率也將呈現(xiàn)增高趨勢。根據(jù)聯(lián)合國人口基金調(diào)查顯示，在過去20年中，全世界的預期壽命從64.8歲提升到70歲，據(jù)統(tǒng)計，到2050年，60歲以上的人口將占世界人口的22%，達到20億，預計老年癌癥患者人數(shù)將顯著增加[9]。根據(jù)結(jié)直腸癌流行病學研究可知，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率總體仍呈上升趨勢[2]。結(jié)直腸癌常見于老年人，約90%的新結(jié)直腸癌被診斷為50歲以上的患者，診斷的中位年齡為69歲。此外，無論性別和種族背景，結(jié)直腸癌的發(fā)病率隨著年齡的增長而急劇上升；在40～80歲之間，結(jié)直腸癌的發(fā)病率幾乎翻倍[10]。2018年中國癌癥統(tǒng)計報告顯示：我國結(jié)直腸癌發(fā)病率、死亡率在全部惡性腫瘤中分別位居第3及第5位[11]。早診早治工作策略在結(jié)直腸癌防控中尤為重要。因此，開發(fā)新的更加有效的檢測和治療手段仍刻不容緩。

結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展往往伴隨著腫瘤基因的異常表達或突變，而惡性增殖是腫瘤細胞最突出的特點。因此發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌的驅(qū)動基因，并深入研究其調(diào)控增殖的具體生物學功能及機制將為開發(fā)新型結(jié)直腸癌治療手段提供重要的依據(jù)。AZGP1是一種分泌型蛋白質(zhì)，它通過刺激脂肪細胞中的脂質(zhì)降解而與癌癥惡病質(zhì)相關(guān)，參與抑制腫瘤生長和增殖，目前認為是各種惡性腫瘤預后的預測指標[12]。在前列腺癌中，早期進展伴隨著血清中AZGP1表達水平的升高，這意味著AZGP1是潛在的早期診斷指標[13]。在結(jié)直腸癌中也有類似的結(jié)論，一項入組868例結(jié)直腸癌患者的研究顯示，血清中高表達AZGP1與較差的總體生存及無病生存顯著相關(guān)，提示其可能是結(jié)直腸癌有效的預后標志物[8]。本研究分析了老年結(jié)直腸癌患者組織中的AZGP1的表達水平及其與預后的關(guān)系，結(jié)果提示AZGP1蛋白的表達與結(jié)直腸癌臨床Dukes分期、腫瘤浸潤程度、腫瘤大小、肝臟轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，而與患者性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度無關(guān)。因此，我們認為AZGP1在結(jié)直腸癌中是一個不利的預后指標。

為進一步明確AZGP1在結(jié)直腸癌中的調(diào)控作用，本研究從細胞水平敲低AZGP1，探討結(jié)直腸癌細胞增殖情況的改變。研究結(jié)果顯示，在HCT116細胞及SW480細胞中敲低AZGP1均可抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和克隆形成能力。為了進一步明確其抑制增殖的機制，通過流式細胞術(shù)檢測細胞周期，結(jié)果顯示HCT116細胞及SW480細胞發(fā)生G1/S期阻滯。因此，我們認為敲低AZGP1可促進結(jié)直腸癌細胞G1/S期的阻滯，從而調(diào)控結(jié)直腸癌細胞的惡性增殖。cyclin D1由位于人類11號染色體的原癌基因CCND1編碼。cyclin D1在腫瘤細胞中的異常表現(xiàn)主要為表達上調(diào)，其主要功能是促進細胞增殖。cyclin D1通過結(jié)合并激活G1期特有的周期蛋白依賴性激酶CDK4，G1期周期抑制蛋白(Rb)被磷酸化，磷酸化的Rb蛋白從其所結(jié)合的E2F轉(zhuǎn)錄因子上解離，E2F轉(zhuǎn)錄因子起始轉(zhuǎn)錄激活細胞周期的基因，從而推動細胞周期由G1期進入到S期[14]。本實驗在SW480細胞系中，敲低AZGP1后，SW480細胞中cyclin D1表達下降。因此，我們認為AZGP1可能是通過調(diào)節(jié)cyclin D1而參與調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細胞G1/S期阻滯。

G1/S期的調(diào)控通過細胞內(nèi)外信號的整合與傳遞，決定著細胞是否進入S期繼續(xù)增生或觸發(fā)細胞凋亡信號。細胞凋亡是一種受多基因調(diào)控的主動性自我消亡過程，確保了多細胞生物體內(nèi)的正常發(fā)育，是維護機體組織平衡、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵，同時它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和退化密切相關(guān)[15]。caspase蛋白家族廣泛存在于細胞質(zhì)中，參與調(diào)控細胞凋亡過程，其中caspase-3的激活標志著細胞凋亡進入不可逆階段。本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)在SW480細胞系中，敲低AZGP1后增加了活化caspase-3表達，提示G1/S期的阻滯導致了結(jié)直腸癌細胞凋亡。

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)家族屬于原癌基因，可參與多種信號通路，調(diào)節(jié)細胞功能；Akt又稱為蛋白激酶B(PKB)，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。Akt是PI3K下游最主要的靶分子，PI3K通過激活Akt發(fā)揮其生物學功能，可以認為活化Akt(即磷酸化Akt，pAkt)是代表該通路活性的重要指標。Akt 是細胞存活的主要調(diào)節(jié)因子，通過直接抑制促凋亡蛋白(如Bad)或抑制由轉(zhuǎn)錄因子(如FoxO)產(chǎn)生促凋亡信號實現(xiàn)調(diào)節(jié)。既往研究認為，PI3K/Akt 信號通路參與腫瘤細胞增殖、抑制細胞凋亡、調(diào)節(jié)細胞周期[16]。本實驗通過Western blotting檢測PI3K、Akt和p-AKT的表達，發(fā)現(xiàn)敲低AZGP1后，SW480細胞中PI3K和p-AKT表達下降，結(jié)果表明敲低AZGP1后可能干擾了PI3K/Akt信號通路活性。然而，對于AZGP1精細調(diào)控細胞周期機制及促進結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機制，還有待更多的研究來完善。

綜上所述，我們實驗結(jié)果提示AZGP1是調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細胞惡性增殖的重要分子，敲低AZGP1可顯著降低結(jié)直腸癌細胞的存活率，降低結(jié)直腸癌細胞的增殖能力。敲低AZGP1對增殖能力的抑制作用主要與細胞周期G1/S期的阻滯有關(guān)，并且干擾了PI3K/Akt信號通路的活性。本研究提示AZGP1可以作為結(jié)直腸癌預后的指標之一；靶向作用于AZGP1，抑制AZGP1的表達可能成為治療結(jié)直腸癌的一個新靶點。