馬炳存 崔學(xué)文 李琰歆 王燦 賀巧玲 曹乾超 劉陽 劉崢 李增婷 陳學(xué)強(qiáng)

摘 要：實(shí)時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）技術(shù)靈敏度高、特異性強(qiáng)，廣泛用于肉制品中動物源性成分的定性、定量分析。已有多種基于RT-PCR技術(shù)的分析策略用于實(shí)現(xiàn)肉制品中動物源性成分的定量檢測，已報(bào)道的定量分析策略各有優(yōu)勢及缺陷，目前尚無可推廣的國家標(biāo)準(zhǔn)方法發(fā)布。本文針對采用RT-PCR技術(shù)對肉制品中動物源性成分定量檢測的分析策略及其中的關(guān)鍵因素（結(jié)果表示形式、靶基因、DNA提取效率、DNA降解、擴(kuò)增效率、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、物種基因組大?。┻M(jìn)行綜述分析，為建立最優(yōu)定量分析模型提供思路，期望找到操作簡便、成本較低、可推廣實(shí)施的定量分析策略，實(shí)現(xiàn)對肉制品中動物源性成分進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測，促進(jìn)國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法的制定。

關(guān)鍵詞：肉制品;動物源性成分;實(shí)時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);定量分析策略;單拷貝基因

Abstract： Real-time polymerase chain reaction （RT-PCR） has been widely used in species identification and quantification in meat products with high sensitivity and specificity. There are now several RT-PCR-based quantification strategies for animal-derived ingredients in meat products. Each has its own advantages and disadvantages. However， China does not currently have a national standard for this. In order to provide new ideas for developing an optimal quantitative model， this paper reviews and analyzes the RT-PCR-based quantification strategies and the key factors affecting them such as the form of expression of results， target genes， DNA extractability， DNA degradation， amplification efficiency， reference materials and genome size. This review will be useful for the development of an easy-to-operate， low-cost， widely applicable quantification strategy to help formulate a national standard based on RT-PCR assay.

Keywords： meat products; animal-derived ingredients; real-time polymerase chain reaction; quantification analysis strategy; signal-copy gene

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210220-041

中圖分類號：TS251.5 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2021）07-0044-06

引文格式：

馬炳存， 崔學(xué)文， 李琰歆， 等. 基于實(shí)時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)定量檢測肉制品中動物源性成分研究進(jìn)展[J]. 肉類研究， 2021， 35（7）： 44-49. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210220-041. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

MA Bingcun， CUI Xuewen， LI Yanxin， et al. A review of the application of real-time polymerase chain reaction for quantitative detection of animal-derived ingredients in meat products[J]. Meat Research， 2021， 35（7）： 44-49. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210220-041. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

我國[1]及歐盟[2]食品標(biāo)準(zhǔn)均要求肉制品包裝標(biāo)簽上應(yīng)明確標(biāo)識產(chǎn)品中動物源性成分組成及含量，但市場上肉制品中動物源性成分含量虛標(biāo)、摻假事件屢禁不止[3]。

肉制品摻假給消費(fèi)者身體健康（過敏反應(yīng)）、宗教信仰等方面帶來風(fēng)險(xiǎn)，同時嚴(yán)重影響社會誠信體系[4]。在肉制品摻假形式層出不窮的情勢下，對動物源性成分定性、定量鑒別技術(shù)的研究成為食品安全領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[5-8]。

目前，動物源性成分鑒定分析方法主要基于蛋白質(zhì)和DNA分析?；诘鞍踪|(zhì)的分析技術(shù)包括免疫[9-10]、色譜[11]和質(zhì)譜[12]。肉制品加工過程中的熱處理工藝、酸堿鹽環(huán)境變化使蛋白質(zhì)變性，蛋白質(zhì)生物活性喪失?；诘鞍踪|(zhì)分析的肉制品動物源性成分鑒別技術(shù)很難滿足實(shí)際檢測的需要，且親緣關(guān)系較近的物種蛋白質(zhì)分析易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，限制了蛋白質(zhì)分析技術(shù)在這一領(lǐng)域的應(yīng)用。基于DNA分析的鑒別技術(shù)可以克服這些困難，DNA的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性優(yōu)于蛋白質(zhì)，并且DNA有更豐富的種間多態(tài)性，高溫處理過的食品中仍能提取出片段化的DNA[13]，在深加工肉制品的鑒別檢測中DNA分析方法具有靈敏度高和特異性強(qiáng)的明顯優(yōu)勢[14]?；贒NA的定量分析技術(shù)主要包括數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)和實(shí)時熒光PCR技術(shù)。數(shù)字PCR技術(shù)不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線、不受擴(kuò)增效率影響、PCR抑制較小，可以對動物源性成分靶標(biāo)進(jìn)行絕對定量分析，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，是實(shí)現(xiàn)肉制品中動物源性成分定量檢測的理想工具。但該技術(shù)設(shè)備投入大、運(yùn)行成本高、應(yīng)用范圍窄、技術(shù)人員不足，大量基層實(shí)驗(yàn)室未裝備數(shù)字PCR技術(shù)平臺?；跀?shù)字PCR的動物源性成分定量檢測方法，短期內(nèi)在肉制品國家監(jiān)督抽檢任務(wù)中很難大范圍推廣，不能為肉制品市場監(jiān)管提供技術(shù)支撐。實(shí)時熒光PCR技術(shù)成熟穩(wěn)定、成本低、應(yīng)用范圍廣，幾乎所有檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室都具備相應(yīng)的技術(shù)平臺和人員。開發(fā)基于實(shí)時熒光PCR技術(shù)的定量檢測方法，有利于大范圍推廣實(shí)施，是當(dāng)前技術(shù)背景下在肉制品監(jiān)督抽檢中發(fā)揮重要作用的最優(yōu)解決方案。

目前，我國對動物源性成分的鑒定已有定性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)51 項(xiàng)，其中國家標(biāo)準(zhǔn)10 項(xiàng)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)34 項(xiàng)、地方標(biāo)準(zhǔn)6 項(xiàng)、農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)1 項(xiàng)，主要采用實(shí)時熒光PCR技術(shù)對DNA進(jìn)行定性檢測?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的檢測方法主要存在以下局限性：第一，只能進(jìn)行定性檢測，無法完成定量分析;第二，檢測靈敏度過高，在檢測過程中，無法排除生產(chǎn)、貯藏、運(yùn)輸、銷售等過程中樣品交叉污染或原料帶入造成的陽性結(jié)果[15-16]，很難為市場監(jiān)管提供有力的技術(shù)支撐。

現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)方法主要以線粒體基因作檢測靶標(biāo)，線粒體基因進(jìn)化速度快，對物種的區(qū)分度較高，常用于物種的細(xì)致分類，研究生物的進(jìn)化過程。但線粒體基因在不同物種或同一物種不同組織細(xì)胞中拷貝數(shù)差異顯著[17-18]，針對線粒體DNA的檢測方法多用于定性檢測，很難完成定量分析。線粒體的拷貝數(shù)普遍較高，以線粒體基因?yàn)闄z測靶標(biāo)導(dǎo)致檢測靈敏度過高，無法區(qū)分產(chǎn)品交叉污染、原料帶入和生產(chǎn)者惡意摻假造成的陽性檢測結(jié)果。以細(xì)胞核中單拷貝基因作為檢測靶標(biāo)設(shè)計(jì)引物和探針，建立動物源性成分定量分析方法，可以克服現(xiàn)有定性檢測方法的缺點(diǎn)。目前已報(bào)道的細(xì)胞核單拷貝基因定量檢測靶標(biāo)主要包括豬源性β-actin基因[19]、綿羊源性催乳素受體基因[20]、雞源性TGF-BETA3基因[21]以及在哺乳動物和禽類中廣泛存在的肌肉生長抑制素（Myostatin）基因[22]、F2基因[18]和LcoR基因[23]等。因此，建立基于實(shí)時熒光PCR技術(shù)對肉制品中動物源性成分進(jìn)行定量檢測的分析策略，準(zhǔn)確鑒別肉制品摻假，為市場監(jiān)管、執(zhí)法檢驗(yàn)提供可靠的技術(shù)支撐已迫在眉睫。

1 已報(bào)道的動物源性成分定量分析策略

1.1 基于線粒體DNA的定量策略

線粒體DNA具有較高的種間多樣性和較低的種內(nèi)變異，在細(xì)胞中拷貝數(shù)多，常用作肉制品中動物源性成分定量分析的檢測靶標(biāo)[24-25]。Hossain等[26]利用細(xì)胞色素b基因作為檢測靶標(biāo)，將純豬肉樣品的DNA作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，梯度稀釋后構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，對樣品中豬源性DNA進(jìn)行絕對定量檢測，通過計(jì)算樣品中豬源性DNA相對含量表示豬源性成分含量，其定量分析模型為p/%=a/t×100，其中p為肉制品豬源性成分含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）/%，a為樣品中豬源性DNA絕對含量/ng，t為樣品總DNA含量/ng。這一定量模型用DNA相對含量表示樣品中動物源性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，利用實(shí)時熒光PCR技術(shù)對豬源性DNA進(jìn)行定量檢測，通過吸光度（A260 nm）法對樣品總DNA進(jìn)行定量測定，定量模型簡單。豬源性DNA與樣品總DNA的定量方法不同，引入的系統(tǒng)誤差較大，導(dǎo)致定量結(jié)果不準(zhǔn)確。Kim等[27]利用線粒體D-環(huán)區(qū)基因作為豬肉檢測靶標(biāo)，以18S rRNA作為內(nèi)參基因檢測靶標(biāo)，對該定量模型進(jìn)行了優(yōu)化。以人工制備的不同豬肉含量（100%、50%、25%、5%、1%、0.1%）的標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別對豬肉靶基因和內(nèi)參基因進(jìn)行相對定量分析，通過計(jì)算二者的相對比例表示豬源性成分含量，其定量分析模型與Hossain等[26]的模型（p/%=a/t×100）相同，該定量策略采用靶基因和內(nèi)參基因2 套標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別對豬肉DNA和總DNA進(jìn)行定量分析，降低了總DNA測量的誤差，提高了定量結(jié)果準(zhǔn)確度。

以線粒體DNA作為檢測靶標(biāo)進(jìn)行定量分析，面臨的最大挑戰(zhàn)是線粒體DNA拷貝數(shù)的巨大差異[28]。Floren等[18]報(bào)道，同一組織中線粒體DNA和單拷貝DNA的拷貝數(shù)差距為100～1 000 倍，不同組織中線粒體DNA拷貝數(shù)差距達(dá)6 倍以上。在檢測之前研究人員無法得知樣品中具體的物種及組織細(xì)胞成分，無法對定量結(jié)果進(jìn)行校正，導(dǎo)致基于線粒體DNA的定量策略定量結(jié)果不可靠，利用單拷貝基因作檢測靶標(biāo)可以消除線粒體DNA拷貝數(shù)變異引入的系統(tǒng)誤差。

1.2 基于細(xì)胞核單拷貝基因的定量策略

細(xì)胞核單拷貝基因在每個細(xì)胞中拷貝數(shù)固定，可以消除因樣品組分不同導(dǎo)致檢測靶標(biāo)拷貝數(shù)變化帶來的誤差，為準(zhǔn)確定量分析動物源性成分奠定了基礎(chǔ)。Laube等[29]2003年報(bào)道了基于牛細(xì)胞核單拷貝磷酸二酯酶基因（bosPDE）、豬細(xì)胞核單拷貝鈣通道受體基因（susRY）及哺乳動物和禽類細(xì)胞核單拷貝內(nèi)參基因（Myostatin）為靶標(biāo)的動物源性成分檢測方法。2007年，Laube等[13，30]利用前期開發(fā)的細(xì)胞核單拷貝基因，建立了以靶基因拷貝數(shù)占內(nèi)參基因拷貝數(shù)的比例表示定量結(jié)果的分析模型：p/%=a/t×100，其中p為肉制品目標(biāo)源性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%，a為樣品中靶基因拷貝數(shù)，t為樣品內(nèi)參基因拷貝數(shù)。該模型校正了線粒體多拷貝基因拷貝數(shù)變化帶來的系統(tǒng)誤差，為動物源性成分準(zhǔn)確定量提供了理論依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。該模型用梯度稀釋的DNA（ng/μL）作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量測定靶基因的拷貝數(shù)，但需要引入被檢測物種的基因組大小這一參數(shù)完成DNA質(zhì)量濃度向拷貝數(shù)的換算。由于不同物種基因組大小差異較大，導(dǎo)致定量結(jié)果差異較大。另外，該模型中基因拷貝數(shù)與樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間未經(jīng)過換算，直接以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示定量結(jié)果，進(jìn)一步放大了結(jié)果誤差。采用參考基質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠避免DNA質(zhì)量濃度向拷貝數(shù)的換算，校正物種基因組大小差異引入的系統(tǒng)誤差。

1.3 基于參考基質(zhì)的定量策略

不同動物組織中細(xì)胞的含水量、體積等參數(shù)并不相同，相同質(zhì)量的樣品中DNA含量（拷貝數(shù)或濃度）差異較大。肉制品加工過程會造成DNA的大量降解，導(dǎo)致深加工肉制品與粗加工肉制品動物源性成分定量結(jié)果差異可達(dá)10 倍[13]。因此，以DNA含量構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行動物源性成分定量分析帶來的問題是樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與DNA含量之間無法準(zhǔn)確換算[17]。為解決這一問題，Eugster等[31]建立了基于參考基質(zhì)的定量分析模型：p/%=a/t×100，其中p為肉制品目標(biāo)源性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%，a為樣品中目標(biāo)源性成分質(zhì)量/g，t為樣品總質(zhì)量/g，該模型利用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的系列樣品作參考基質(zhì)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，以特異性單拷貝靶基因和單拷貝內(nèi)參基因作檢測靶標(biāo)，對目標(biāo)源性成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行定量檢測。該定量模型避免了DNA質(zhì)量濃度向質(zhì)量分?jǐn)?shù)的轉(zhuǎn)換計(jì)算，校正了因基質(zhì)變化帶來的系統(tǒng)誤差，定量結(jié)果更準(zhǔn)確，是近年來應(yīng)用最廣泛的定量分析策略[32-35]。然而，基于參考基質(zhì)的定量策略需要制備市場上所有肉制品品種的標(biāo)準(zhǔn)參考基質(zhì)，而且制備過程需要模擬待檢樣品的加工工藝，以保證標(biāo)準(zhǔn)參考基質(zhì)的DNA含量和提取效率與待檢樣品一致，面對大量抽檢樣品時，可行性極差。在開發(fā)定量分析方法、確認(rèn)方法學(xué)性能時，引入固定的校正系數(shù)可以解決參考基質(zhì)變化引入的系統(tǒng)誤差。

1.4 基于校正系數(shù)的定量策略

利用單拷貝特異性靶基因和內(nèi)參基因進(jìn)行動物源性成分定量檢測時，含量為100%的純陽性樣品，特異性靶基因和內(nèi)參基因的DNA理論含量相同。由于擴(kuò)增引物、探針的不同以及擴(kuò)增體系的差別，特異性靶基因和內(nèi)參基因的定量結(jié)果并不總是完全一致，導(dǎo)致產(chǎn)生系統(tǒng)誤差。Wang Wenjun等[23]通過引入校正系數(shù)來修正這一系統(tǒng)誤差，使二者協(xié)調(diào)一致，建立了基于校正系數(shù)的定量分析模型：p/%=k×a/t×100，其中p為肉制品目標(biāo)源性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%，a為樣品中目標(biāo)源性靶基因拷貝數(shù)，t為內(nèi)參基因拷貝數(shù)，k為校正系數(shù)，k=1+（t100%-a100%）/a100%。

該模型利用含量為100%的純陽性樣品計(jì)算校正系數(shù)，將校正系數(shù)引入定量分析模型，校正了靶標(biāo)擴(kuò)增體系不同帶來的系統(tǒng)誤差。該模型測定的是DNA拷貝數(shù)，當(dāng)以樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示定量結(jié)果時，需要完成DNA拷貝數(shù)與質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的換算，這一換算過程需要研究人員明確知道待檢樣品中所有物種成分，這顯然與定量檢測目的相悖。通過人工合成單拷貝靶基因和內(nèi)參基因，制備靶基因和內(nèi)參基因含量相同的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，能夠有效解決標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不宜獲取的難題，同時保障了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)批間穩(wěn)定性，大幅提高定量檢測可行性。

2 定量分析策略的影響因素

2.1 結(jié)果表示形式

基于DNA分析的動物源性成分定量分析策略面臨的首要問題是市場上肉制品種類復(fù)雜，不同品種肉制品在動物源性成分組成、加工方式、處理過程等方面各不相同，研究人員不可能獲得肉制品原輔料組成及加工處理過程的全部信息，從而建立清晰、準(zhǔn)確的定量分析模型。實(shí)時熒光PCR技術(shù)本質(zhì)是對目標(biāo)DNA含量（拷貝數(shù)或濃度）進(jìn)行定量分析，若以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示最終定量結(jié)果，需要將DNA含量換算為樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)，換算過程會引入樣品動物源性成分組成、加工方式、處理過程等參數(shù)信息，很難準(zhǔn)確換算，導(dǎo)致定量結(jié)果不準(zhǔn)確。Ballin等[4]建議直接采用基因組當(dāng)量（g/g）表示動物源性成分定量結(jié)果。但目前國內(nèi)外法規(guī)均要求以質(zhì)量分?jǐn)?shù)標(biāo)識肉制品動物源性成分含量，若以基因組當(dāng)量表示定量結(jié)果具有較大阻力，肉制品生產(chǎn)企業(yè)也很難對產(chǎn)品中動物源性成分含量進(jìn)行準(zhǔn)確標(biāo)識。

2.2 靶基因

定量靶基因的選擇直接影響基于實(shí)時熒光PCR技術(shù)的動物源性成分定量分析結(jié)果準(zhǔn)確性。固定拷貝數(shù)或單拷貝的靶基因比線粒體DNA等多拷貝基因更適合定量分析。Floren等[18]的研究數(shù)據(jù)表明，同一組織中線粒體DNA和單拷貝DNA的拷貝數(shù)差距為100～1 000 倍，不同組織中線粒體DNA拷貝數(shù)差距也高達(dá)6 倍以上。因此，采用細(xì)胞核單拷貝基因作為檢測靶標(biāo)可以建立更加準(zhǔn)確的定量分析模型。

2.3 DNA提取效率

DNA提取效率不同物種的動物源性成分，其組織中脂肪、肌肉、筋膜含量不同。樣品DNA提取過程中，不同的樣品組分和DNA提取方法造成DNA提取效率差異較大。研究表明，雞肝臟中DNA的提取效率是雞胸肉的25 倍[36]，脂肪含量較低的豬內(nèi)臟中DNA的提取效率明顯高于高脂肪含量的其他組織[13]。Kang[37]分析實(shí)驗(yàn)室常用DNA提取方法對不同樣品DNA提取效率的差異，認(rèn)為商業(yè)化試劑盒提取樣品DNA更加高效、方便。

2.4 DNA降解

肉制品的熱加工工藝會導(dǎo)致樣品中DNA大量降解，嚴(yán)重影響實(shí)時熒光PCR的定量分析結(jié)果。研究[13]表明，深加工肉制品和粗加工肉制品中動物源性成分定量結(jié)果差異顯著。因此，在建立動物源性成分定量分析模型時應(yīng)當(dāng)充分考慮樣品DNA降解造成的不利影響?？衫门c待檢樣品加工方式相同的標(biāo)準(zhǔn)參考基質(zhì)[31]構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，或引入基質(zhì)修正系數(shù)[38]來降低DNA降解造成的干擾。

2.5 擴(kuò)增效率

基于實(shí)時熒光PCR技術(shù)的動物源性成分定量分析策略，不能直接對樣品DNA進(jìn)行定量，需要依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品中靶基因循環(huán)閾值代入擬合方程計(jì)算靶基因含量。擬合計(jì)算過程要求待檢樣品DNA擴(kuò)增效率與標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率相同，且為95%～105%[39]。即使樣品DNA經(jīng)過嚴(yán)格的提取、純化步驟，提取產(chǎn)物中始終含有基質(zhì)帶入的PCR抑制物[40]（如多糖、乙二胺四乙酸、鈣離子、無機(jī)鹽），降低樣品DNA的擴(kuò)增效率。尤其是待檢樣品與參考基質(zhì)在成分組成、加工工藝不同時，擴(kuò)增效率引入的誤差更加突出。Pfaffl[41]研究結(jié)果表明，參考基質(zhì)與樣品DNA的擴(kuò)增效率有5%的差異，經(jīng)過30 次PCR循環(huán)后，會帶入113%的系統(tǒng)誤差。

2.6 DNA含量測定

實(shí)時熒光PCR技術(shù)定量過程需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，但尚無定量準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)品。分光光度法（A260 nm）最常用于總DNA含量測定，但分光光度法對單鏈DNA更敏感，且受DNA提取過程中帶入的苯酚、氯仿干擾較大，對DNA含量的測定結(jié)果不夠準(zhǔn)確[42-43]。受DNA提取效率的影響，提取的總DNA含量與樣品的基質(zhì)類型密切相關(guān)，深加工肉制品由于樣品DNA大量降解，樣品中總DNA含量較少，受分光光度法的影響更大[44-45]。

2.7 物種基因組大小

采用分光光度法測定樣品總DNA含量，若以g/g表示定量結(jié)果，需要帶入物種基因組大小計(jì)算基因組當(dāng)量。但不同物種基因組大小差異顯著，基因組當(dāng)量不易準(zhǔn)確計(jì)算。例如，?；蚪M大小是雞基因組的3 倍[13]，牛肉樣品中摻假雞肉，牛源性成分含量被高估，導(dǎo)致定量分析結(jié)果不準(zhǔn)確。要消除物種基因組大小引入的誤差，需要預(yù)先知道待檢樣品中動物源性成分組成，查詢對應(yīng)的物種基因組大小，準(zhǔn)確計(jì)算DNA拷貝數(shù)，這與定量檢測目的矛盾。因此，在定量分析模型中引入物種基因組大小這一參數(shù)，將大大降低定量方法的實(shí)用性。

3 結(jié) 語

肉制品中動物源性成分定量檢測準(zhǔn)確度要求高，影響因素較多，研究內(nèi)容復(fù)雜，基于DNA分析的定量分析模型構(gòu)建困難。數(shù)字PCR技術(shù)[18-19]能夠?qū)游镌葱猿煞诌M(jìn)行絕對定量檢測，不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線、不受擴(kuò)增效率影響、PCR抑制干擾較小。但基于數(shù)字PCR的定量分析策略依然受結(jié)果表示形式、靶基因選擇、DNA提取效率、DNA降解、物種基因組大小等因素影響，在構(gòu)建定量分析模型時應(yīng)充分考慮上述參數(shù)，保證定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、引入校正系數(shù)等方案設(shè)計(jì)，基于實(shí)時熒光PCR技術(shù)的定量分析策略同樣能夠?qū)崿F(xiàn)動物源性成分的準(zhǔn)確定量，與數(shù)字PCR技術(shù)相比，實(shí)時熒光PCR技術(shù)具有成熟穩(wěn)定、成本較低、儀器平臺廣泛、易于推廣實(shí)施等優(yōu)勢，在保障肉制品質(zhì)量安全方面更加適用。但已報(bào)道的定量分析方法存在以下不足，嚴(yán)重限制了這些方法的推廣應(yīng)用：第一，用于定量的靶基因拷貝數(shù)與樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的對應(yīng)關(guān)系無法準(zhǔn)確計(jì)算;第二，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示樣品中定量結(jié)果時要求DNA提取效率接近100%，但由于不同肉制品動物源性成分、加工工藝、原輔料不同，DNA提取效率很難達(dá)到100%;第三，定量過程需要構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，但無法獲得定量準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)品。

不同物種、組織、細(xì)胞的含水量、密度并不相同，相同質(zhì)量的樣品其DNA含量差異顯著，將質(zhì)量分?jǐn)?shù)引入定量模型極大降低了定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。基于實(shí)時熒光PCR技術(shù)的準(zhǔn)確定量分析策略，應(yīng)以基因組當(dāng)量（g/g）或細(xì)胞數(shù)含量（cell/cell，c/c）代替質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示定量結(jié)果，將實(shí)時熒光PCR定量數(shù)據(jù)與質(zhì)量分?jǐn)?shù)區(qū)分;以細(xì)胞核固定拷貝或單拷貝基因作檢測靶標(biāo)，可以消除拷貝數(shù)變異引入的系統(tǒng)誤差;采用參考基質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠避免DNA質(zhì)量濃度向拷貝數(shù)的換算;確認(rèn)方法學(xué)性能時，提高DNA提取效率，優(yōu)化PCR擴(kuò)增體系，引入固定的校正系數(shù)解決參考基質(zhì)變化引入的系統(tǒng)誤差;通過人工合成單拷貝靶基因和內(nèi)參基因，制備靶基因和內(nèi)參基因含量相同的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，能夠有效解決標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不宜獲取的難題，同時保障了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)批間穩(wěn)定性，大幅提高定量檢測可行性。同時，我國應(yīng)當(dāng)推進(jìn)肉制品動物源性成分定量分析策略的開發(fā)，盡快建立肉制品動物源性成分定量分析方法，有效區(qū)分交叉污染、原料帶入和惡意摻假，為監(jiān)督抽檢、市場監(jiān)管提供可靠的技術(shù)支撐和準(zhǔn)確的肉制品評價(jià)體系。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部. 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則： GB 7718—2011[S]. 北京： 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2011： 2-3.

[2] European Commission. Commission Directive 2002/86/EC[S]. Brussels： Official Journal of the European Communities， 2002： L 305/19.

[3] IWOBI A， SEBAH D， KRAEMER I， et al. A multiplex real-time PCR method for the quantification of beef and pork fractions in minced meat[J]. Food Chemistry， 2015， 169： 305-313. DOI：10.1016/j.foodchem.2014.07.139.

[4] BALLIN N Z， VOGENSEN F K， KARLSSON A H. Species determination： can we detect and quantify meat adulteration？[J]. Meat Science， 2009， 83： 165-174. DOI：10.1016/j.meatsci.2009.06.003.

[5] KALTENBRUNNER M， HOCHEGGER R， CICHNA-MARKL M.?Development and validation of a fallow deer （Dama dama）-specific TaqMan real-time PCR assay for the detection of food adulteration[J]. Food Chemistry， 2018， 243： 82-90. DOI：10.1016/j.foodchem.2017.09.087.

[6] KANG T S. Development of four PCR-based methods to differentiate tilefish species （Branchiostegus japonicus and B. albus）[J]. Food Chemistry， 2019， 271： 1-8. DOI：10.1016/j.foodchem.2018.07.138.

[7] KIM M J， KIM H Y. Development of a fast duplex real-time PCR assay for simultaneous detection of chicken and pigeon in raw and heat-treated meats[J]. Food Control， 2018， 85： 1-5. DOI：10.1016/j.foodcont.2017.09.012.

[8] MANO J， NISHITSUJI Y， KIKUCHI Y， et al. Quantification of DNA fragmentation in processed foods using real-time PCR[J]. Food Chemistry， 2017， 226： 149-155. DOI：10.1016/j.foodchem.2017.01.064.

[9] KIM S H， HUANG T S， SEYMOUR T A， et al. Production of monoclonal antibody for the detection of meat and bone meal in animal feed[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2004， 52： 7580-7585. DOI：10.1021/jf048789a.

[10] MULDOON M T， ONISK D V， BROWN M C， et al. Targets and methods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs[J]. International Journal of Food Science and Technology， 2010， 39： 851-861. DOI：10.1111/j.1365-2621.2004.00858.x.

[11] CHOU C C， LIN S P， LEE K M， et al. Fast differentiation of meats from fifteen animal species by liquid chromatography with electrochemical detection using copper nanoparticle plated electrodes[J]. Journal of Chromatography B： Analytical Technologies in The Biomedical and Life Sciences， 2007， 846： 230-239. DOI：10.1016/j.jchromb.2006.09.006.

[12] VALLEJO-C?RDOBA B， COTA-RIVAS M. Meat species identification by linear discriminant analysis of capillary electrophoresis protein profiles[J]. Journal of Capillary Electrophoresis， 1998， 5： 171-175. DOI：10.1002/（SICI）1099-1271（1998090）13：5<321：：AID-BIO495>3.0.CO;2-5.

[13] LAUBE I， ZAGONH J， BROLL H. Quantitative determination of commercially relevant species in foods by real-time PCR[J]. International Journal of Food Science and Technology， 2007， 42：?336-341. DOI：10.1111/j.1365-2621.2006.01249.x.

[14] KALTENBRUNNER M， HOCHEGGERM R， CICHNA-MARKL M.?Tetraplex real-time PCR assay for the simultaneous identification and quantification of roe deer， red deer， fallow deer and sika deer for deer meat authentication[J]. Food Chemistry， 2018， 269： 486-494. DOI：10.1016/j.foodchem.2018.07.02.

[15] AMARAL J S， SANTOS G， MBPP OLIVEIRAI M， et al. Quantitative detection of pork meat by EvaGreen real-time PCR to assess the authenticity of processed meat products[J]. Food Control， 2017， 72： 53-61. DOI：10.1016/j.foodcont.2016.07.029.

[16] NAAUM A M， SHEHATA H R， CHEN S， et al. Complementary molecular methods detect undeclared species in sausage products at retail markets in Canada[J]. Food Control， 2018， 84： 339-344. DOI：10.1016/j.foodcont.2017.07.040.

[17] EUGSTER A， RUF J， RENTSCH J， et al. Quantification of beef and pork fraction in sausages by real-time PCR analysis： results of an interlaboratory trial[J]. European Food Research and Technology， 2008， 227： 17-20. DOI：10.1007/s00217-007-0686-9.

[18] FLOREN C， WIEDEMANN I， BRENIG B， et al. Species identification and quantification in meat and meat products using droplet digital PCR （ddPCR）[J]. Food Chemistry， 2015， 173： 1054-1058. DOI：10.1016/j.foodchem.2014.10.138.

[19] CAI Yicun， HE Yuping， L? Rong， et al. Detection and quantification of beef and pork materials in meat products by duplex droplet digital PCR[J]. PLoS One， 2017， 12（8）： e0181949. DOI：10.1371/journal.pone.0181949.

[20] 宋麗萍， 薛晨玉， 路勇， 等. 應(yīng)用實(shí)時熒光PCR技術(shù)定量檢測羊肉中的豬肉成分[J]. 食品科技， 2014， 39（10）： 319-322; 326.

[21] 姜潔， 宋麗萍， 郭淼， 等. 應(yīng)用實(shí)時熒光PCR技術(shù)量化檢測羊肉中豬源性和雞源性成份[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)， 2015， 6（9）： 3701-3707.

[22] DRUML B， MAYER W， CICHNA-MARKL M， et al. Development and validation of a TaqMan real-time PCR assay for the identification and quantification of roe deer （Capreolus capreolus） in food to detect food adulteration[J]. Food Chemistry， 2015， 178： 319-326. DOI：10.1016/j.foodchem.2015.01.003.

[23] WANG Wenjun， FU Ming， ZHANG Qingde， et al. A novel quantitative real-time PCR method for the detection of mammalian and poultry species based on a shared single-copy nuclear DNA sequence[J]. Food Chemistry， 2021， 341： 128170. DOI：10.1016/j.foodchem.2020.128170.

[24] CHEN Xiaoyu， LU Lixia， XIONG Xianghui， et al. Development of a real-time PCR assay for the identification and quantification of bovine ingredient in processed meat products[J]. Reproductive Sciences， 2020， 10（1）： 2052. DOI：10.1038/s41598-020-59010-6.

[25] DOLCH K， ANDREE S， SCHWAGELE F. Comparison of real-time PCR quantification methods in the identification of poultry species in meat products[J]. Foods， 2020， 9（8）： 1049. DOI：10.3390/foods9081049.

[26] HOSSAIN M， ALI M， SULTANA S， et al. Quantitative tetraplex real-time polymerase chain reaction assay with TaqMan probes discriminates cattle， buffalo， and porcine materials in food chain[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2017， 65： 3975-3985. DOI：10.1021/acs.jafc.7b00730.

[27] KIM M， YOO I， LEE S Y， et al. Quantitative detection of pork in commercial meat products by TaqMan（R） real-time PCR assay targeting the mitochondrial D-loop region[J]. Food Chemistry， 2016， 210： 102-106. DOI：10.1016/j.foodchem.2016.04.084.

[28] L?PEZ-ANDREO M， ALDEGUER M， GUILL?N I， et al. Detection and quantification of meat species by qPCR in heat-processed food containing highly fragmented DNA[J]. Food Chemistry， 2012， 134： 518-523. DOI：10.1016/j.foodchem.2012.02.111.

[29] LAUBE I， SPIEGELBERG A， BUTSCHKE A， et al. Methods for the detection of beef and pork in foods using real-time polymerase chain reaction[J]. International Journal of Food Science and Technology， 2003， 38： 111-118. DOI：10.1046/j.1365-2621.2003.00651.x.

[30] LAUBE I， ZAGON J， SPIEGELBERG A， et al. Development and design of a ‘ready-to-use reaction plate for a PCR-based simultaneous detection of animal species used in foods[J]. International Journal of Food Science and Technology， 2007， 42： 9-17. DOI：10.1111/j.1365-2621.2006.01154.x.

[31] EUGSTER A， RUF J， RENTSCHR J. Quantification of beef， pork， chicken and turkey proportions in sausages： use of matrix-adapted standards and comparison of single versus multiplex PCR in an interlaboratory trial[J]. European Food Research and Technology， 2009， 230： 55-61. DOI：10.1007/s00217-009-1138-5.

[32] L?PEZ-CALLEJA I M， SILVIA D L C， GONZ?LEZ I， et al. Market analysis of food products for detection of allergenic walnut （Juglans regia） and pecan （Carya illinoinensis） by real-time PCR[J]. Food Chemistry， 2015， 177： 111-119. DOI：10.1016/j.foodchem.2015.01.017.

[33] L?PEZ-CALLEJA I M， SILVIA D L C， PEGELS N， et al. High resolution TaqMan real-time PCR approach to detect hazelnut DNA encoding for ITS rDNA in foods[J]. Food Chemistry， 2013， 141： 1872-1880. DOI：10.1016/j.foodchem.2013.05.076.

[34] IWOBI A， SEBAH D， SPIELMANN G， et al. A multiplex real-time PCR method for the quantitative determination of equine （horse） fractions in meat products[J]. Food Control， 2017， 74： 89-97. DOI：10.1016/j.foodcont.2016.11.035.

[35] DRUML B， GRANDITS S， MAYER W， et al. Authenticity control of game meat products-a single method to detect and quantify adulteration of fallow deer （Dama dama）， red deer （Cervus elaphus） and sika deer （Cervus nippon） by real-time PCR[J]. Food Chemistry， 2015， 170： 508-517. DOI：10.1016/j.foodchem.2014.08.048.

[36] BUNTJER J B， LAMINE A， HAAGSMA N， et al. Species identification by oligonucleotide hybridization： the influence of processing of meat products[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 1999， 79： 53-57. DOI：10.1002/（SICI）1097-0010（199901）79：13.0.CO;2-E.

[37] KANG T S. Basic principles for developing real-time PCR methods used in food analysis： a review[J]. Trends in Food Science and Technology， 2019， 91： 574-585. DOI：10.1016/j.tifs.2019.07.037.

[38] K?PPEL R， RUF J， ZIMMERLI F， et al. Multiplex real-time PCR for the detection and quantification of DNA from beef， pork， chicken and turkey[J]. European Food Research and Technology， 2008， 227： 1199-1203. DOI：10.1007/s00217-008-0837-7.

[39] MARCHESI U， MAZZARA M， BROLL H， et al. European Network of GMO Laboratories （ENGL） 2015 definition of minimum performance requirements for analytical methods of GMO testing[S]. Ispra： Molecular Biology and Genomics Unit， 2015： 1-18. DOI：10.13140/RG.2.1.2060.5608.

[40] SCHRADER C， SCHIELKE A， ELLERBROEK L， et al. PCR inhibitors-occurrence， properties and removal[J]. Journal of Applied Microbiology， 2012， 113： 1014-1026. DOI：10.1111/j.1365-2672.2012.05384.x.

[41] PFAFFLM W. A new mathematical model for relative quantification in realtime RT-PCR[J]. Nucleic Acids Research， 2001， 29（9）： 2003-2007. DOI：10.1093/nar/29.9.e45.

[42] KANG T S， TANAKA T. Comparison of quantitative methods based on SYBR Green real-time qPCR to estimate pork meat adulteration in processed beef products[J]. Food Chemistry， 2018， 269： 549-558. DOI：10.1016/j.foodchem.2018.06.141.

[43] COSTA J， AMARAL J S， GRAZINA L， et al. Matrix-normalised real-time PCR approach to quantify soybean as a potential food allergen as affected by thermal processing[J]. Food Chemistry， 2017， 221： 1843-1850. DOI：10.1016/j.foodchem.2016.10.091.

[44] TIGST D， JEMIMA M， MICHELLE H， et al. Effect of source of DNA on the quantitative analysis of genetically engineered traits using digital PCR and real-time PCR[J]. Journal of AOAC International， 2017， 100： 492-498. DOI：10.5740/jaoacint.16-0284.

[45] YALCINKAYA B， YUMBUL E， MOZIOGLU E， et al. Comparison of DNA extraction methods for meat analysis[J]. Food Chemistry， 2017， 221： 1253-1257. DOI：10.1016/j.foodchem.2016.11.032.