閆兆威，張 敏，魏明剛，姚 鑫，劉江云

1蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，蘇州 215006；2蘇州大學(xué)藥學(xué)院，蘇州 215123

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種退行性疾病，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨代謝異常和關(guān)節(jié)骨結(jié)構(gòu)破壞，嚴(yán)重時會導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能喪失，已成為50歲以上人群喪失勞動力和致殘的重要病因。其中膝骨性關(guān)節(jié)發(fā)生率最高，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，目前全世界約有1.9億骨性關(guān)節(jié)炎患者，隨著老齡化社會的進(jìn)程，OA患者逐年增多，給患者家庭帶來了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力[1,2]。目前對OA的治療是以一些非特異性藥物減輕臨床癥狀為主，通過口服非阿片類止痛藥(對乙酰氨基酚、中樞鎮(zhèn)痛藥)及非甾體類抗炎藥來緩解關(guān)節(jié)炎患者的癥狀，但并不能從根本上治愈OA，同時該類藥物在心血管系統(tǒng)及胃腸道系統(tǒng)的不良反應(yīng)較多，限制了其應(yīng)用的范圍[3,4]。因此，臨床上亟待開發(fā)一種具有新作用機(jī)制、強(qiáng)效的OA治療創(chuàng)新藥物。Eleutheroside E(EE)是刺五加中特有的木脂素苷類成分(圖1)，課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)EE具有較好的抗炎作用[5,6]，但目前為止，國際尚未見有關(guān)EE在OA治療應(yīng)用的研究報道。故本研究基于前期工作基礎(chǔ)，采用前交叉韌帶切斷法(ACLT)建立兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型，首次選用EE作為治療藥物，通過關(guān)節(jié)腔注射的方式給藥進(jìn)行治療干預(yù)，從動物整體水平對EE在實驗性兔膝骨性關(guān)節(jié)炎的治療及保護(hù)作用進(jìn)行評價。并進(jìn)一步運用分子對接技術(shù)和分子動力學(xué)模擬手段對EE與MMPs相互作用的位點及結(jié)合方式進(jìn)行分析，明確EE與MMPs復(fù)合物結(jié)合的模式，從而為研發(fā)一種天然來源新型的骨性關(guān)節(jié)炎候選治療藥物奠定基礎(chǔ)。

圖1 Eleutheroside E的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structure of eleutheroside E

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

Eleutheroside E(EE，含量≥ 98%，批號：20130811)購于成都瑞芬思生物科技有限公司，塞來昔布(celecoxib，含量≥ 98%，批號：20131019)購于Sigma-Aldrich公司，放于4 ℃冰箱保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。MMP-3(批號：20140212)，MMP-9(批號：20140417)和IL-1β(批號：20140130)的ELISA試劑盒購于TSZ Scientific LLC公司；PGE2(批號：20140625)的ELISA試劑盒購于R&D Systems公司。

1.2 儀器

EL104型電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；3K15型臺式高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)；Sunrise型酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；BX41型光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS 公司)。

1.3 實驗動物

新西蘭大白兔，30只，雄性，體重3.0～3.5 kg，清潔級，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號(SCXK(滬)2012-0002)。試驗期間飼養(yǎng)室溫度20～24 ℃，相對濕度為65～75%，自由攝食和飲水，實驗動物處理遵守實驗動物倫理原則。

1.4 實驗方法

1.4.1 OA動物模型建立及藥物處理

取30只雄性的健康新西蘭大白兔，體重3.0～3.5 kg，清潔級，隨機(jī)分為5組，每組6只，分為假手術(shù)組(sham operation，SO)、模型組(model)、EE低劑量(20 mg/kg，EE-20)、EE高劑量(60 mg/kg，EE-60)治療藥物組、陽性對照藥celecoxib(15 mg/kg，Cel-15)組。所有動物造模前一天右膝備皮，術(shù)前稱重，用10%水合氯醛按300 mg/kg經(jīng)腹腔注射麻醉，將動物仰臥位固定于手術(shù)臺上，消毒鋪單。假手術(shù)組僅做皮膚切口，不切斷前交叉韌帶。模型組和各治療組的動物均采用文獻(xiàn)報道的前交叉韌帶切斷法(ACLT)建立骨性關(guān)節(jié)炎動物模型[7]。具體操作步驟如下，取髕骨內(nèi)側(cè)切口，顯露關(guān)節(jié)腔，切斷前交叉韌帶，并切除斷端1～2 mm，防止術(shù)后粘連，術(shù)中注意保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，逐層縫合切口，術(shù)后3天肌肉注射青霉素，40萬U/d。各組實驗動物四周后觀察切口愈合良好后，再進(jìn)行關(guān)節(jié)腔注射給藥，每次注射藥物體積為0.5 mL，每周給藥1次，連續(xù)進(jìn)行5周。治療藥物EE組，關(guān)節(jié)腔注射給予EE-20和EE-60兩種劑量；陽性藥物組，關(guān)節(jié)腔注射給予Cel-15；模型組僅注射給予空白溶媒生理鹽水0.5 mL；藥物在注射前用生理鹽水溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配，假手術(shù)組不予任何處理正常飼養(yǎng)。

1.4.2 大體觀察

處死動物取材時，觀察右膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)面是否光澤，有無軟化灶、糜爛、潰瘍和缺損，有無軟骨剝脫，軟骨下骨質(zhì)暴露，關(guān)節(jié)局部有無骨贅形成。并用大體評分規(guī)則進(jìn)行評估[8]：0分：關(guān)節(jié)面光滑，色澤正常；1分：關(guān)節(jié)面粗糙，有小的裂隙，色澤灰暗；2分：關(guān)節(jié)面糜爛，軟骨缺損達(dá)軟骨表層或中層；3分：關(guān)節(jié)面潰瘍形成，缺損達(dá)軟骨深層；4分：軟骨剝脫，軟骨下骨質(zhì)暴露。

1.4.3 組織病理學(xué)觀察

采用空氣栓塞法處死各組實驗動物后，矢狀位切取右膝關(guān)節(jié)，股骨內(nèi)側(cè)骼負(fù)重部分標(biāo)木，厚約0.5 cm，包括關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨，置于10%中性甲醛溶液中固定24 h，10% EDTA脫鈣，酒精脫水，透明、浸蠟，5 μm層厚連續(xù)切片，烤片1 h，脫蠟、水化，HE染色，脫水、透明，中性塑膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)是否清晰，軟骨細(xì)胞排列是否整齊，有無軟骨細(xì)胞增生、缺失，有無軟骨裂隙、潰瘍及缺損、軟骨層纖維成分是否增多等病理改變情況。觀察滑膜組織有無肥厚及增生，有無血管侵入，有無炎細(xì)胞浸潤等情況[9]。根據(jù)骨關(guān)節(jié)病組織分類方法中關(guān)節(jié)軟骨與滑膜的病變計分標(biāo)準(zhǔn)[10]，對各組動物膝關(guān)節(jié)標(biāo)本的病變程度進(jìn)行計分和組間比較。

1.4.4 關(guān)節(jié)液中IL-1β、PGE2、MMP-3和MMP-9的水平測定

實驗結(jié)束后，處死兔子取關(guān)節(jié)液，測定關(guān)節(jié)液中IL-1β、PGE2、MMP-3和MMP-9的水平，所有檢測實驗均按照ELISA試劑盒的使用說明書進(jìn)行操作。

1.4.5 分子對接實驗

采用Chemdraw 15.0繪制小分子EE的2D結(jié)構(gòu)，保存為cdx格式。載入Chem3D 15.0，用MM2力場進(jìn)行能量最小化，保存為pdb格式。載入Autodocktool 1.5.6程序，添加電荷，分配原子類型，所有可旋轉(zhuǎn)鍵均設(shè)置為柔性，保存為pdbqt格式，用于分子對接。以MMP-3(PDB ID：1B8Y)和MMP-9(PDB ID：1GKC)晶體結(jié)構(gòu)作為蛋白受體，進(jìn)行分子對接。在Pymol 1.7程序中刪除晶體結(jié)構(gòu)中的結(jié)晶水和其他小分子，添加氫原子后保存。載入Autodocktool 1.5.6程序，添加電荷，分配原子類型，保存為pdbqt格式，作為分子對接受體。采用Vina 1.1.2軟件進(jìn)行分子對接，獲取配體-受體復(fù)合物初始坐標(biāo)，選取affinity最佳構(gòu)象作為分子對接結(jié)果。

1.4.6 分子動力學(xué)模擬

采用Amber 18軟件包對蛋白-小分子復(fù)合物進(jìn)行分子動力學(xué)模擬。蛋白使用ff14SB力場參數(shù)，小分子配體則使用gaff通用力場參數(shù)，并使用ANTECHAMBER 模塊計算其AM1-BCC原子電荷。將蛋白-小分子復(fù)合物載入tleap模塊，自動添加氫原子和拮抗離子以中和電荷。選擇TIP3P顯性水模型，設(shè)置周期性邊界條件。分子動力學(xué)模擬工作流程共包括能量最小化、加熱、平衡、生產(chǎn)動力學(xué)模擬等4步。首先，約束蛋白(和小分子)重原子，對水分子進(jìn)行10 000步(含5 000步最速下降法和5 000步共軛梯度法)能量最小化；隨后，在50 ps時間內(nèi)，將體系緩慢加熱至300 K；加熱完成后，在npt系綜下對體系進(jìn)行50 ps的平衡。最后，將體系在npt系綜下進(jìn)行50 ns的分子動力學(xué)模擬。每隔10 ps保存一次軌跡數(shù)據(jù)，并用CPPTRAJ模塊進(jìn)行相關(guān)分析。配體和蛋白的結(jié)合自由能計算則采用MMPBSA.py模塊進(jìn)行。

1.4.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理系統(tǒng)，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，統(tǒng)計分析采用Mann-Whitney U 檢驗，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 EE對兔子大體觀察的影響

假手術(shù)組顯示：軟骨面完整光滑，色澤正常，無關(guān)節(jié)積液及滑膜增生。模型組顯示：軟骨剝脫，軟骨下骨暴露，股骨外髁有明顯骨贅及潰瘍生成。EE-20、EE-60和Cel-15治療組中顯示：關(guān)節(jié)軟骨表面欠光滑，有散在潰瘍點，軟骨邊緣無骨贅形成，未見裂紋及軟化灶，大體破壞程度明顯降低，其中EE-60和Cel-15治療組與模型組比較，治療效果明顯(P<0.001)。EE治療后代表性股骨外髁圖及各組的大體評分見圖2所示。

圖2 EE對兔子大體觀察的影響Fig.2 Effect of EE on macroscopic observations of rabbits注：與假手術(shù)組比較，### P < 0.001；與模型組比較，* P<0.05,*** P<0.001。Note:### P<0.001 vs SO group;*P<0.05,*** P<0.001 vs model group.

2.2 EE對兔子膝關(guān)節(jié)病理觀察的影響

關(guān)節(jié)軟骨HE染色結(jié)果：假手術(shù)組中顯示：動物軟骨表層完整，軟骨結(jié)構(gòu)清晰可辨，細(xì)胞排列整齊，潮線結(jié)構(gòu)完整；模型組中顯示：軟骨表層剝脫，細(xì)胞明顯增生，排列嚴(yán)重紊亂，潮線結(jié)構(gòu)破壞。Cel-15治療組顯示：軟骨病變程度較輕,表面光滑，但仍可見軟骨表層細(xì)胞的染色加深及細(xì)胞排列紊亂；EE-20和EE-60治療組顯示：軟骨表層輕微破損，可見一定程度的表層細(xì)胞增生，部分細(xì)胞的染色加深等軟骨病變，但與模型組比較有明顯的改善。EE治療后代表性關(guān)節(jié)軟骨病理圖片及各組關(guān)節(jié)軟骨的病理評分見圖3所示。

圖3 EE對兔子關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)的影響(HE,×100)Fig.3 Effect of EE on histopathology of articular cartilage of rabbits(HE,×100)注：與假手術(shù)組比較，###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05,***P<0.001。Note:###P<0.001 vs SO group;*P<0.05,***P<0.001 vs model group.

滑膜HE染色結(jié)果：假手術(shù)組中顯示：滑膜織無肥厚及增生，無血管侵入，無炎細(xì)胞浸潤；模型組中顯示：滑膜內(nèi)襯細(xì)胞增生，排列雜亂，毛細(xì)血管及纖維組織增生，大量炎癥細(xì)胞浸潤。EE-20和EE-60治療組中顯示：滑膜細(xì)胞數(shù)量較模型組減少，輕度纖維組織增生，少量炎證細(xì)胞浸潤。EE和Cel-15治療組與模型組比較，治療效果明顯(P<0.001)。EE治療后代表性滑膜組織病理圖片及各組滑膜的病理評分見圖4所示。

圖4 EE對兔子滑膜組織病理學(xué)的影響(HE,×100)Fig.4 Effect of EE on histopathology of synovial membrane of rabbits(HE,×100)注：與假手術(shù)組比較，###P<0.001；與模型組比較，***P<0.001。Note:###P<0.001 vs SO group;***P<0.001 vs model group.

2.3 ELISA法測定EE對關(guān)節(jié)液中IL-1β、PGE2、MMP-3和MMP-9水平的影響

取兔子的關(guān)節(jié)液，采用ELISA檢測方法，對關(guān)節(jié)液中IL-1β、PGE2、MMP-3和MMP-9的水平進(jìn)行測定。檢測結(jié)果分析顯示：模型組動物關(guān)節(jié)液中IL-1β、PGE2、MMP-3和MMP-9的含量水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.001)；EE-20、EE-60 mg/kg和Cel-15治療組與模型組比較，均能明顯降低關(guān)節(jié)液中IL-1β、PGE2、MMP-3和MMP-9的水平，其中EE-60和Cel-15治療組與模型組比較，抑制作用顯著(P<0.001)，見圖5A～D。

圖5 EE對關(guān)節(jié)液中IL-1β(A)、PGE2(B)、MMP-3(C)和MMP-9(D)水平的影響Fig.5 Effect of EE on the levels of IL-1β (A)、PGE2 (B)、MMP-3 (C) and MMP-9 (D) in synovial fluid 注：與假手術(shù)組比較，###P<0.001；與模型組比較，***P<0.001。Note:###P<0.001 vs SO group;***P < 0.001 vs model group.

2.4 分子對接結(jié)果分析

分子對接實驗顯示，EE配體可結(jié)合于MMPs催化位點的凹槽中，并獲得了對接的最佳構(gòu)象，其中EE與MMP-3對接的最低自由能值為-8.2 kcal/mol；EE與MMP-9對接的最低自由能值為-7.5 kcal/mol，見圖6所示(中心位置顯示的紫色圓球為催化必須的Zn離子)。

圖6 分子對接最佳構(gòu)象示意圖Fig.6 Optimal conformation of molecular docking注：Zn離子由紫色圓球表示。A.EE與MMP-3對接的最佳構(gòu)象；B.EE與MMP-9對接的最佳構(gòu)象。Note:Zn ions are represented by purple spheres.A.Optimal conformation of molecular docking between EE with MMP-3;B.Optimal conformation of molecular docking between EE with MMP-9.

同時，EE配體糖環(huán)上的多個羥基可與MMP-3和MMP-9受體中的多個氨基酸(如His201側(cè)鏈N、Ala189骨架N、Ser412骨架O、His411骨架O等)形成氫鍵，這些氫鍵對于配體的結(jié)合起到重要作用。此外，EE配體苯環(huán)可與MMP-3中(Tyr155、Phe86、Tyr168、Phe210、Val163)和MMP-9中(Leu188、Val398、Tyr423、Tyr420、Leu187)等疏水殘基形成疏水堆積作用，亦可穩(wěn)定其結(jié)合，見圖7所示。

圖7 EE與MMP-3(A)和MMP-9(B)殘基間的相互作用圖Fig.7 Interaction of EE with the active site residue of MMP-3 (A) and MMP-9 (B)

2.5 分子動力學(xué)模擬結(jié)果分析

進(jìn)一步應(yīng)用AmberTools 18.0軟件進(jìn)行分子動力學(xué)模擬實驗，采取rmsd平衡之后的軌跡，基于MMGBSA方程計算配體EE與MMP-3和MMP-9的結(jié)合自由能。實驗結(jié)果顯示(見表1)：EE與MMP-3的總結(jié)合自由能為-19.8 kcal/mol，EE與MMP-9的結(jié)總合自由能為-15.2 kcal/mol，相比較而言，EE與MMP-3的總結(jié)合能更低，表明EE與MMP-3結(jié)合能力更強(qiáng)，此結(jié)果與上述ELISA檢測實驗結(jié)果趨勢基本一致。其中，在EE與MMP-3和MMP-9復(fù)合物結(jié)合的過程中，主要的貢獻(xiàn)來源于范德華勢能和靜電作用，且兩個體系具有相似的結(jié)合模式。此外，在整個分子動力學(xué)過程中，蛋白回旋半徑曲線均較為平穩(wěn)，穩(wěn)定在15?附近，蛋白整體結(jié)構(gòu)緊湊，不存在松散、去折疊等情況。

表1 EE與MMP-3和MMP-9結(jié)合自由能分析Table 1 Binding free energy analysis of EE binding to MMP-3 and MMP-9

3 討論與結(jié)論

關(guān)節(jié)軟骨的基本組成成分為軟骨基質(zhì)、軟骨細(xì)胞和水。軟骨基質(zhì)主要由蛋白多糖和膠原組成，軟骨細(xì)胞是軟骨基質(zhì)分解代謝反應(yīng)的主要來源，在正常的生理條件下，軟骨成分的降解與合成之間保持動態(tài)平衡。骨性關(guān)節(jié)炎(OA)病變的發(fā)生主要是由于一些相關(guān)介質(zhì)或因子引起了關(guān)節(jié)組織的骨、軟骨、甚至關(guān)節(jié)內(nèi)韌帶和肌腱的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)進(jìn)行性破壞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨局部軟化、磨損及結(jié)構(gòu)損壞[11]。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)與OA患者的骨關(guān)節(jié)損傷及病情活動密切相關(guān)，在關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)及軟骨細(xì)胞破壞的病理過程中起著非常關(guān)鍵的作用[12]。MMPs是一種能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的鋅蛋白水解酶，幾乎能降解ECM的所有成分，在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中，軟骨細(xì)胞及滑膜細(xì)胞分泌過量的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-3和MMP-9)[13]，打破了基質(zhì)金屬蛋白酶-基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(MMP-TIMP)的平衡，使ECM發(fā)生了不可逆的降解，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的腫脹、抗外力作用下降、關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥反應(yīng)加重，最終致使關(guān)節(jié)功能的喪失[14]。

MMPs過量表達(dá)導(dǎo)致的軟骨破壞已經(jīng)成為研究OA發(fā)病機(jī)理的熱點之一，因此通過尋找MMPs抑制劑成為治療OA藥物研發(fā)的新策略。

中藥是祖國醫(yī)藥寶庫中的重要組成部分，由于其來源廣泛、化學(xué)成分豐富、不良反應(yīng)少，開發(fā)成新藥易于人體接受的特點，越來越受到國內(nèi)外研究學(xué)者的關(guān)注，目前嘗試從中藥篩選發(fā)掘針對疾病靶標(biāo)的新型小分子治療藥物已經(jīng)成為研究熱點[15,16]。刺五加Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxim.) Harms又名五加參、刺拐棒，是一種名貴的藥用植物，主產(chǎn)于中國的黑龍江、吉林、遼寧、河北、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)及日本北海道等地，在我國有著悠久的藥用歷史[17]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)eleutheroside E(EE)是刺五加中主要活性成分之一[18]，目前關(guān)于EE的藥理作用報道不多，主要為降低血糖、改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松、抗中樞疲勞及記憶缺損、降低腦缺血再灌注損傷等方面[19-22]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)EE可以明顯抑制炎癥因子和關(guān)節(jié)軟骨破壞的情況，經(jīng)文獻(xiàn)檢索調(diào)研，截至目前國際尚未見有關(guān)EE在OA治療應(yīng)用的研究報道。

因此，本文首次對EE治療骨性關(guān)節(jié)炎作用進(jìn)行了研究，從動物整體水平對EE在實驗性兔膝骨性關(guān)節(jié)炎的治療及保護(hù)作用進(jìn)行評價，從而為EE防治骨性關(guān)節(jié)炎提供實驗依據(jù)。本研究采用經(jīng)典的前交叉韌帶切斷法(ACLT)建造兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型，通過關(guān)節(jié)腔注射的方法注射給予EE-20和EE-60進(jìn)行治療干預(yù)，每周給藥1次，連續(xù)給藥5周，研究其對兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型的炎癥細(xì)胞因子等指標(biāo)以及關(guān)節(jié)病理學(xué)改變的影響，觀察EE對兔膝骨關(guān)節(jié)炎動物模型的防治作用。實驗結(jié)果顯示EE能明顯改善骨關(guān)節(jié)炎部位炎細(xì)胞浸潤、纖維組織增生及軟骨表層破壞等情況。有研究表明：MMP-3和MMP-9可以加快OA關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)中細(xì)胞外基質(zhì)的損害，促進(jìn)軟骨破壞的速度，從而推進(jìn)OA的進(jìn)展過程。此外,IL-1β也是導(dǎo)致OA產(chǎn)生的關(guān)鍵因素，IL-1β可誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞一氧化氮(NO)、環(huán)氧化酶(COX)的產(chǎn)生，而環(huán)氧化酶2又能夠促進(jìn)一氧化氮、前列腺素E2(PGE2)的分泌，而PGE2是一種多效性炎癥介質(zhì)，它能夠增加MMPs和其他分解代謝物質(zhì)的產(chǎn)生從而影響關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而加速關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞[23,24]。因此，我們進(jìn)一步采用ELISA檢測方法，對EE干預(yù)后OA模型動物關(guān)節(jié)液中炎癥介質(zhì)(IL-1β和PGE2)以及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-3和MMP-9的水平進(jìn)行分析測定。結(jié)果顯示：EE治療干預(yù)后可以明顯降低關(guān)節(jié)液中炎癥介質(zhì)(IL-1β和PGE2)以及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-3和MMP-9的水平(P< 0.001)，表明EE具有明顯抗骨性關(guān)節(jié)炎的作用。

目前，分子對接技術(shù)和分子動力學(xué)模擬已成為探索蛋白與受體結(jié)合方式的重要工具，在新藥研究領(lǐng)域中具有的重要應(yīng)用價值[25]。本研究進(jìn)一步運用分子對接技術(shù)及分子動力學(xué)模擬手段，對EE與MMPs相互作用位點和結(jié)合方式進(jìn)行了分析和探討。研究結(jié)合于MMP-3和MMP-9催化位點的凹槽中，EE糖環(huán)上的羥基可與MMP-3和MMP-9受體中的氨基酸形成氫鍵，這些氫鍵對于配體的結(jié)合起到了重要作用。此外，EE配體苯環(huán)亦可與MMP-3和MMP-9中的疏水殘基形成疏水堆積作用，亦可穩(wěn)定其結(jié)合。分子動力學(xué)模擬實驗表明，EE與MMP-3和MMP-9復(fù)合物結(jié)合過程中，主要貢獻(xiàn)來源于范德華勢能和靜電作用，且兩個體系具有相似的結(jié)合模式。其中，EE與MMP-3的總結(jié)合能更低，相比較而言，EE與MMP-3結(jié)合能力更強(qiáng)，此結(jié)果與上述ELISA檢測實驗結(jié)果的趨勢基本一致。以上數(shù)據(jù)為今后研究EE抗MMPs的分子作用機(jī)制以及開發(fā)木脂素苷類母核結(jié)構(gòu)新型MMPs抑制劑提供了關(guān)鍵的理論依據(jù)。

綜上所述，關(guān)節(jié)腔注射EE可以明顯改善骨關(guān)節(jié)炎部位炎細(xì)胞浸潤、纖維組織增生及軟骨表層破壞等情況，并降低關(guān)節(jié)液中炎癥介質(zhì)(IL-1β和PGE2)以及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-3和MMP-9的含量水平，表明EE具有明顯抗骨性關(guān)節(jié)炎的作用。此外，進(jìn)一步的分子對接技術(shù)和分子動力學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，EE配體可結(jié)合于MMP-3和MMP-9催化位點的凹槽中，EE配體糖環(huán)上的多個羥基可與MMP-3和MMP-9受體中的多個氨基酸形成氫鍵，這些氫鍵對于配體的結(jié)合起到重要作用。本研究結(jié)果將為研發(fā)一種天然來源新型的骨性關(guān)節(jié)炎候選治療藥物奠定了基礎(chǔ)。