趙子璇，李春峰，楊洪旺，劉桂艷

北京理工大學(xué)生命學(xué)院分子醫(yī)學(xué)與生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081

生物轉(zhuǎn)化(bioconversion或biotransformation)是指在生物自身的作用或者體內(nèi)活性酶的催化作用下，外源化合物發(fā)生了一定的生物化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而產(chǎn)生有價(jià)值的化合物的過程，又被稱為生物催化(biocatalysis)。1864年，巴斯德發(fā)現(xiàn)醋酸桿菌能使乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸，從此拉開了人類開創(chuàng)微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的序幕。20世紀(jì)50年代，研究人員利用黑曲霉(Rhizopusnigrican)將黃體酮轉(zhuǎn)化為11α-羥基黃體酮，是生物轉(zhuǎn)化史上的重要里程碑[1]。

生物轉(zhuǎn)化相對(duì)于化學(xué)轉(zhuǎn)化，具有綠色環(huán)保、高效的催化效率、溫和的反應(yīng)條件、簡單的后續(xù)處理等優(yōu)點(diǎn)，往往可以實(shí)現(xiàn)糖基化反應(yīng)等化學(xué)轉(zhuǎn)化中不易實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化，達(dá)到增強(qiáng)生物活性、降低毒性、提高生物利用度等目的。特別是生物轉(zhuǎn)化具有較高的區(qū)域選擇性和立體選擇性，也有較多的反應(yīng)類型，如氧化反應(yīng)、還原反應(yīng)、水解反應(yīng)、縮合反應(yīng)、羥基化反應(yīng)、胺化反應(yīng)、環(huán)化反應(yīng)、?；磻?yīng)、脫羧化、甲基化與去甲基化反應(yīng)和脫氫反應(yīng)等等，更易得到結(jié)構(gòu)新穎的化合物，為新藥開發(fā)提供更有價(jià)值的先導(dǎo)化合物。然而，在種類繁多的微生物中篩選有效轉(zhuǎn)化的菌株就目前而言仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。

五環(huán)三萜類化合物主要存在于陸地高等植物中，分為3種結(jié)構(gòu)類型，即烏蘇烷型、齊墩果烷型和羽扇豆烷型。研究報(bào)道該類化合物具有抗癌、抗糖尿病、抗病毒、抗菌和抗氧化等多種生物活性[2]。雖然很多藥材中含有五環(huán)三萜類化合物，但往往存在含量偏低、活性低或者毒性大的局限。通過生物轉(zhuǎn)化，可以把五環(huán)三萜類化合物轉(zhuǎn)化為高活性低毒性的更有價(jià)值的有效成分或者結(jié)構(gòu)新穎的先導(dǎo)化合物，為進(jìn)一步結(jié)構(gòu)改造和新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 五環(huán)三萜類化合物生物轉(zhuǎn)化

1.1 齊墩果烷型

1.1.1 齊墩果酸

齊墩果酸(oleanolic acid，OA，1)，又被稱為土當(dāng)歸酸，其化學(xué)名為3β-hydroxy-olean-12-en-28-oic acid，其化學(xué)分子式為C30H48O3，分子量為456.70。齊墩果酸不僅具有三萜酸常見的抗腫瘤、抗糖尿病和抗炎等藥理活性，還可以抗口腔病原菌、調(diào)血脂、抗肥胖[3]、保護(hù)血管[4]、保護(hù)神經(jīng)、抗肝脂肪病變和纖維化[5]等。

齊墩果酸在亞麻刺盤孢霉(ColletotrichumliniAS3.448，a)[6]作用下C15位發(fā)生了羥基化反應(yīng)，生成15α-hydroxyl-oleanolic acid(2)，相同的反應(yīng)類型在粉紅單端孢霉(Trichotheciumroseum，g)[7]和蠅卷霉(CircinellamuscaeAS 3.2695，i)[8]也有報(bào)道。在長柄鏈格孢菌(Alternarialongipes，b)[9]中發(fā)生了C2位和C19位的羥基化反應(yīng)，C3位和C28位的糖基化反應(yīng)，同時(shí)，母核骨架齊墩果烷變?yōu)樾芄?，C19位增添了甲基，共生成了6種化合物：2α,3α,19α-trihydroxy-ursolic acid-28-O-β-D-glucopyranoside(3)、2α,3β,19α-trihydroxy-ursolic acid-28-O-β-D-glucopyranoside(4)、oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester(5)、oleanolic acid-3-O-β-D-glucopyranoside(6)、3-O-(β-D-glucopyranosyl)-oleanolic acid-28-O-β-D-glucopyranoside(7)和2α,3β,19α-trihydroxy-oleanolic acid-28-O-β-D-glucopyranoside(8)?；衔?在赭曲霉(AspergillusochraceusCICC 40330，h)[10]中也有發(fā)現(xiàn)。在阿達(dá)青霉(Penicilliumadametzi，c)[9]中，發(fā)生了C7和C21位羥基化反應(yīng)和C28位的糖基化反應(yīng)，生成21β-hydroxyl oleanolic acid(9)、7α,21β-dihydroxyl oleanolic acid(10)和21β-hydroxyl oleanolic acid-28-O-β-D-glucopyranoside(11)。化合物6、9、10和11對(duì)宮頸癌細(xì)胞(Hela)的殺傷活性強(qiáng)于齊墩果酸。在魯氏毛霉(MucorrouxiiNRRL 1894，d)[11]中，齊墩果酸也發(fā)生了C7和C21位羥基化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化生成3β,7β,21β-trihydroxyolean-12-en-28-oic acid(12)，C3位發(fā)生羰基化反應(yīng)生成7β-hydroxy-3-oxo-olean-12-en-28-oic acid(13)、21β-hydroxy-3-oxo-olean-12-en-28-oic acid(14)和7β,21β-dihydroxy-3-oxo-olean-12-en-28-oic acid(15)。其中，化合物14可以抑制牙齦卟啉單胞菌的活性。Zhu等[10]發(fā)現(xiàn)在灰色鏈霉菌(StreptomycesgriseusATCC 13273，e)中，齊墩果酸的C29位的甲基被氧化成羧基，生成3β-dihydroxy-olean-12-en-28,29-dioic acid(16)，同時(shí)C24位發(fā)生羥基化生成3β,24-dihydroxy-olean-12-en-28,29-dioic acid(17)。Martinez等[12]發(fā)現(xiàn)在米黑根毛霉(RhizomucormieheiCECT 2749，f)中齊墩果酸主要發(fā)生羥基化反應(yīng)，集中在C1、C7和C30位上，生成3β,30-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid(18)、3β,7β,30-trihydroxyolean-12-en-28-oic acid(19)和1β,3β,30-trihydroxyolean-12-en-28-oic acid(20)。在粉紅單端孢霉(g)[7]中發(fā)生了C7位、C15位羥基化和C3位羰基化，生成15α-hydroxy-3-oxo-olean-12-en-28-oic acid(21)和7β,15α-dihydroxy-3-oxo-olean-12-en-28-oic acid(22)。在蠅卷霉(i)[8]中齊墩果酸C7、C15和C21位上發(fā)生羥基化，C3位發(fā)生羰基化和C28位發(fā)生糖基化生成已有化合物5、10、11、12和13以及新化合物7β,15α-dihydroxy-3-oxo-olean-12-en-28-oic acid(23)、3β,7β,15α-trihydroxyolean-12-en-28-oic acid(24)和3β,7β,15α-trihydroxyolean-12-en-28-oic acid-28-O-β-D-glucopyranosyl ester(25)，生成的9種化合物均能抑制NO產(chǎn)生，其中化合物23、24和25對(duì)NO的抑制作用大于陽性對(duì)照。由此可見，C7位羥基化和C28位糖基化得到的化合物的抗炎活性強(qiáng)于在C21位羥基化。Xu等[13]研究了串聯(lián)全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，先在華根霉(RhizopuschinensisCICC 40335，j)中轉(zhuǎn)化齊墩果酸生成化合物12，接著通過枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisATCC 6633，k)在化合物12的C3位增加了糖基，生成3-O-β-D-glucopyranosyl-7β,21β-dihydroxyloleanolic acid(26)。化合物12在灰色鏈霉菌(e)中C29位發(fā)生了羥基化和羧酸化，生成新化合物3β,7β,21β,29-tetrahydroxy-olean-12-en-28-oic acid(27)和3β,7β,21β-trihydroxy-olean-12-en-28,29-dioic acid(28)，其中，化合物28具有顯著神經(jīng)保護(hù)作用[13]。齊墩果酸生物轉(zhuǎn)化途徑及其衍生物化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 齊墩果酸的生物轉(zhuǎn)化途徑及其衍生物化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Biotransformation pathway of oleanolic acid and chemical structure of oleanolic acid derivatives

1.1.2 甘草酸

甘草酸(glycyrrhizic acid，GL，29)，又被稱為甘草甜素，其化學(xué)名為3β-glcA1-2glcA-11-oxo-urs-12-en-30-oic acid，化學(xué)分子式為C42H62O16，分子量822.93。甘草酸不僅是一種天然的食品甜味劑，還具有多種藥效活性，如：抗炎、抗過敏、抗病毒、抗哮喘以及增強(qiáng)免疫功能等，在臨床上用于治療肝炎、氣管炎、胃潰瘍和皮膚病等疾病[14]，尤其可以作為一種輔助治療手段，減輕新型冠狀病毒(COVID-19)重癥患者的炎癥反應(yīng)[15]。甘草酸帶有兩分子葡萄糖醛酸，極性大，不易被透膜吸收，生物利用度低，可以通過水解掉葡萄糖醛酸來提高生物利用度。然而化學(xué)方法轉(zhuǎn)化對(duì)兩個(gè)糖苷鍵水解選擇性不強(qiáng)[16]，但在生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域上，通過β-D-葡萄糖醛酸苷酶作用于糖苷鍵，可以水解掉一個(gè)或兩個(gè)葡萄糖醛酸，生成單葡萄糖醛酸甘草次酸(3-O-mono-β-D-glucuronide，GAMG，30)或甘草次酸(glycyrrhetic acid，GA，31)。

筆者所在課題組[17]發(fā)現(xiàn)甘草酸在土曲霉(AspergillusterreusLi-20，w)中既可以轉(zhuǎn)化生成單葡萄糖醛酸甘草次酸也可以生成甘草次酸；在焦曲霉(AspergillusustusLi-62，p)中只轉(zhuǎn)化生成甘草次酸；在產(chǎn)紫青霉(PenicilliumpurpurogenumLi-3，l)中只轉(zhuǎn)化生成單葡萄糖醛酸甘草次酸；在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)褐紅籃狀菌(TalaromycespinophilusLi-93，v)[18]能夠轉(zhuǎn)化甘草酸生成單葡萄糖醛酸甘草次酸，并分離其中的β-D-葡萄糖醛酸苷酶，將其編號(hào)為TpGUS79A。也有學(xué)者研究報(bào)道在黑曲霉(Aspergillussp:CPCC480386，m)[19]、球毛殼菌(Chaetomiumglobosum，n)[20]、藍(lán)狀菌(Talaromycessp.02，o)[21]中轉(zhuǎn)化甘草酸只生成單葡萄糖醛酸基甘草次酸，其中最高轉(zhuǎn)化產(chǎn)率達(dá)98.68%。在大腸桿菌(EscherichiacoliMTCC 1652，q)[22]、米曲霉(Aspergillusoryzae，r)[23]、鼠乳桿菌(Lactobacillusmurinus，s)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus，t)和鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus，u)[24]轉(zhuǎn)化甘草酸只生成甘草次酸，最高轉(zhuǎn)化產(chǎn)率達(dá)到76.7 %。由此看來，不同微生物來源的β-D-葡萄糖醛酸苷酶的對(duì)糖苷鍵具有選擇性水解作用，但導(dǎo)致選擇性水解的原因還有待進(jìn)一步研究。甘草酸的生物轉(zhuǎn)化途徑及其衍生物化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 甘草酸的生物轉(zhuǎn)化途徑及其衍生物結(jié)構(gòu)Fig.2 Biotransformation pathway of glycyrrhizic acid and chemical structure of glycyrrhizic acid derivatives

1.1.3 甘草次酸

C7位羥基化是甘草次酸生物轉(zhuǎn)化中最常見的反應(yīng)類型，在新月彎孢霉(CurvariacrescentKA-91，x)[25]、華根霉(RhizopuschinensisCICC 40335，j)[13]、短刺小克銀漢霉(CunninghamellablakesleeanaCGMCC 3.970，y)[26]、刺孢小克銀漢霉(CunninghamellaechinulataATCC 8688a，z)[27]、無根根霉(RhizopusarrhizusAS 3.2893，A)[28]和蠅卷霉(i)[28]中均有7β-hydroxyl-18β-glycyrrhetinic acid(32)生成。在無根根霉(A)[28]和多型孢毛霉(Mucorpolymorphosporus，B)[29]中可以生成異構(gòu)體7α-hydroxy-18β-glycyrrhetinic acid(33)。另外，在多型孢毛霉(B)[29]中，甘草次酸的C3位發(fā)生羰基化反應(yīng)，C6、C7、C24和C27位發(fā)生羥基化反應(yīng)生成6β,7β-dihydroxyglycyrrhentic acid(34)、27-hydroxyglycyrrhentic-acid(35)、24-hydroxyglycyrrhentic acid(36)和3-oxo-7β-hydroxyglycyrrhentic acid(37)。在刺孢小克銀漢霉(z)[27]中，甘草次酸的C1和C15位發(fā)生羥基化反應(yīng)，C7和C27位酯化成環(huán)，生成15α-hydroxy-18β-glycyrrhetinic(38)、15α-hydroxy-18α-glycyrrhetinic acid(39)、13β-hydroxy-7α,27-oxy-12-dihydro-18β-glycyrrhetinic acid(40)和1α-hydroxy-18β-glycyrrhetinic acid(41)。在假柱孢梨頭霉(AbsidiapseudocylinderosporaATCC 24169，C)[27]中，C7和C15位發(fā)生羥基化反應(yīng)生成7β,15α-dihydroxy-18β-glycyrrhetinic acid(42)。在綠色粘帚霉(GliocladiumvirideATCC 10097，D)[27]中，C3位發(fā)生羰基化反應(yīng)生成3-oxo-18β-glycyrrhetinic acid(43)。在短刺小克銀漢霉(y)[26,30]中甘草次酸的C3位羰基化，C7和C15位羥基化生成3-oxo-15α-hydroxy-18β-glycyrrhetinic acid(44)、3-oxo-15β- hydroxy-18β-glycyrrhetinic acid(45)、3-oxo-7β,15α-dihydroxy-18β-glycyrrhetinic acid(46)、化合物37、38和42。后又發(fā)現(xiàn)在短刺小克銀漢霉(y)[31]中，C24位也能發(fā)生羥基化反應(yīng)生成15α,24-dihydroxyglycyrrhetinic acid(47)、3-oxo-15α,24-dihydroxyglycyrrhetinic acid(48)、3-oxo-7β,24-dihydroxyglycyrrhetinic acid(49)、3-oxo-7β,15α,24-trihydroxy-glycyrrhetinic acid(50)和3-oxo-7α,24-dihydroxyglycyrrhetinic acid(51)。Fan等[28]在無根根霉(A)中轉(zhuǎn)化甘草次酸的C7位羰基化和C15位羥基化生成7-oxo-18β-glycyrrhetinic acid(52)和7-oxo-15α-hydroxy-18β-glycyrrhetinic acid(53)。在蠅卷霉(i)[28]中，C7和C15位發(fā)生羥基化反應(yīng)，C3和C30位發(fā)生糖基化反應(yīng)，生成7β-hydroxyl-18β-glycyrrhetinic acid-3-O-β-D-glucoside(54)、7β-hydroxyl-18β-glycyrrhetinic acid-30-O-β-D-glucoside(55)和15α-hydroxyl-18β-glycyrrhetinic acid-3-O-β-D-glucoside(56)。另外，C3位連接的葡萄糖羥基還可以發(fā)生乙酰化反應(yīng)生成7β-hydroxyl-18β-glycyrrhetinic acid-3-O-β-D-6′-O-acetyl-glucoside(57)和15α-hydroxyl-18β-glycyrrhetinic acid-3-O-β-D-6′-O-acetyl-glucoside(58)?？莶菅挎邨U菌(k)[13,32]可轉(zhuǎn)化甘草次酸的C3和C30位發(fā)生糖基化反應(yīng)，生成30-O-β-D-glucopyranosyl glycyrrhetinic acid(59)和3-O-(β-D-glucopyranosyl)glycyrrhetinic acid-30-O-β-D-glucopyranoside(60)。筆者所在課題組[33]進(jìn)一步將枯草芽孢桿菌中UGT酶在大腸桿菌(Escherichiacoli，E)中重組表達(dá)，生成GA-3-O-β-D-glucoside(61)和GA-30-O-β-D-glucoside(59)，并證明對(duì)乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和人肝癌細(xì)胞(HepG2)的細(xì)胞毒活性比GA和GL高，化合物61對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抗菌活性比GA高。甘草次酸的生物轉(zhuǎn)化途徑及其衍生物化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖3。

圖3 甘草次酸的生物轉(zhuǎn)化途徑及其衍生物結(jié)構(gòu)Fig.3 Biotransformation pathway of glycyrrhetic acid and chemical structure of glycyrrhetic acid derivatives

1.2 烏蘇烷型

熊果酸(ursolic acid，UA，62)，又名烏索酸、烏蘇酸[34]，其化學(xué)名3β-hydroxy-urs-12-en-28-oic acid，化學(xué)分子式為C30H48O3，分子量為456.71。熊果酸在抗癌、抗糖尿病中均起重要作用，被譽(yù)為抗癌治療中最有希望的藥物[35]。熊果酸衍生物的開發(fā)不僅可以彌補(bǔ)熊果酸低溶解性、低滲透性的不足，還可以提高口服利用度[36]。

在深黃傘形霉(Umbelopsisisabelline，F(xiàn))[37]中，熊果酸的C1位和C7位發(fā)生羥基化反應(yīng)，C11位和C12位發(fā)生脫氫氧化反應(yīng)，C13位和C28位發(fā)生酯化反應(yīng)生成3種化合物：3β-hydroxy-urs-11-en-28,13-lactone(63)、3β,7β-dihydroxy-urs-11-en-28,13-lactone(64)和1β,3β-dihydroxy-urs-11-en-28,13-lactone(65)；在小孢擬盤多毛孢(Pestalotiopsismicrospora，G)[38]中，熊果酸的C4位、C15位和C30位發(fā)生羥基化反應(yīng)，C3位發(fā)生羰基化反應(yīng)生成3-oxo-15α,30-dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid(66)、3β,15α-dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid(67)和3β,15α,30-trihydroxy-urs-12-en-28-oic acid(68)，C3位也會(huì)發(fā)生羧化反應(yīng)生成3,4-seco-ursan-4,30-dihydroxy-12-en-3,28-dioic acid(69)4種化合物。Huang等[39]在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)在總狀共頭霉(SyncephalastrumracemosumAS 3.264，H)中C21位也可以發(fā)生羥基化和羰基化反應(yīng)，C11位、C26位發(fā)生環(huán)氧化反應(yīng)，共生成5種化合物：3β,21β-dihydroxy-urs-11-en-28-oic acid-13-lactone(70)、3β,7β,21β-trihydroxy-urs-11-en-28-oic acid-13-lactone(71)、1β,3β-dihydroxy-urs-12-en-21-one-28-oic acid(72)、1β,3β,21β-trihydroxy-urs-12-en-28-oic acid(73)和11,26-epoxy-3β,21β-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid(74)，其中，化合物72對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)有抑制活性。付少彬等[40]在總狀共頭霉(SyncephalastrumracemosumCGMCC 3.2500，I)發(fā)現(xiàn)生成了新化合物3β,7β,21β-trihydroxy-urs-12-en-28-oic acid(75)。研究表明，在鏈格孢菌(AlternariaalternataAS 3.577，J)[41]、梅林青霉(PenicilliummeliniiAS3.4474，K)[42]和巨大芽孢桿菌(BacillusmegateriumCGMCC 1.1741，L)[43]中改變了C3位結(jié)構(gòu)，發(fā)生羰基化反應(yīng)生成3-oxo-urs-12-en-28-oic acid(76)，在梅林青霉(K)[42]中還發(fā)生了C3位和C28位糖基化得到3-O-β-D-吡喃葡萄糖熊果酸酯(77)和28-O-β-D-吡喃葡萄糖熊果酸酯(78)，在巨大芽孢桿菌(L)[43]中，C1位、C11位發(fā)生羥化反應(yīng)，C13位、C28位發(fā)生酯化反應(yīng)，C28發(fā)生糖基化反應(yīng)，得到1β,11α-dihydroxy-3-oxo-urs-12-en-28-oic acid(79)、1β,3β,11α-trihydroxyurs-12-en-28oic acid(80)、1β,11α-dihydroxy-3-oxo-urs-12-en-28-O-β-D-glucopyranoside(81)和1β-hydroxy-3-oxo-urs-12-en-28,13-lactoe(82)，這些衍生物對(duì)一氧化氮的抑制作用強(qiáng)于UA[43]。在長柄鏈格孢菌(AlternarialongipesAS3.2875，M)[44]中，C28位糖基基化得到化合物78，后續(xù)Zhang等[45]在同一菌株種發(fā)現(xiàn)C3位糖基化和羰基化，C2位和C21位羥基化，得到了化合物77、3-carbonyl-ursolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester(83)、2α,3β-dihydroxy ursolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester(84)、3β,21β-dihydroxy ursolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester(85)和3-O-(β-D-glucopyranosyl)-ursolic acid 28-O-(β-D-glucopyranosyl) ester(86)。在灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseussubsp.griseus 4.18，N)[46]和鏈格孢菌(AlternariaalternataATCC 34509，O)[47]中C2位發(fā)生羥基化生成科羅索酸(87)。另外在鏈格孢菌(O)中，C23位、C24位也會(huì)發(fā)生羥基化，C28位羧酸被還原成羥甲基，生成urs-12-en-2α,3β,28-triol(88)、3β,23-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid(89)、2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid(90)、2α,3β,23,24-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid(91)、3β,28-dihydroxy-12-ursene(92)、urs-12-en-3β-ol(93)和urs-12-en-2α,3β-diol(94)，其中化合物87、90和91對(duì)乳腺癌(MCF-7、MDA-MB-231)、結(jié)腸癌(Caco-2)和肝癌(HepG2)細(xì)胞抗增殖活性增強(qiáng)[47]。粉紅粘帚霉(GliocladiumroseumCGMCC 3.3657，P)[48]催化熊果酸C21位羥基化和羰基化，C3位和C28位酯化和羧酸化，C4和C23脫氫氧化，生成21-oxo,A-homo-3α-oxa-urs-12-en-3-one-28-oic acid(95)、21-oxo-3,4-seco-ursan-4(23),12-dien-3,28-dioic acid(96)、21β-hydroxyl-A-homo-3α-oxa-urs-12-en-3-one-28-oic acid(97)、21β-hydroxyl-3,4-seco-ursan-4(23),12-dien-3,28-dioic acid(98)，并證明C21的酮基可能有助于阻止丙型肝炎病毒的入侵。Zhang等[49]利用刺囊毛霉(MucorspinosusAS 3.3450，Q)使C7位和C21位羥基化，C28位羧酸的羥基被甲基化，C3位糖基化得到化合物75、3β,7β-dihydroxy-ursolic acid-28-etha-none(99)和3β,21β-dihydroxy-ursolic acid-3-O-β-D-glucopyranoside(100)。與UA相比，化合物99對(duì)Hela細(xì)胞、K562細(xì)胞和KB細(xì)胞株具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。熊果酸的生物轉(zhuǎn)化途徑及其衍生物結(jié)構(gòu)見圖4。

圖4 熊果酸的生物轉(zhuǎn)化途徑及其衍生物結(jié)構(gòu)Fig.4 Biotransformation pathway of ursolic acid and chemical structure of ursolic acid derivatives

1.3 羽扇豆烷型

白樺脂酸(betulinic acid，BA，101)，也叫樺木酸，其化學(xué)名為3β-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid，其化學(xué)分子式為C30H48O3，分子量為456.7。白樺脂酸也具有抗癌、抗炎和抗氧化等方面的活性。與其他五環(huán)三萜類化合物相比，白樺脂酸在抑制黑色素瘤和抗艾滋病毒方面上發(fā)揮著舉足輕重的作用。白樺脂酸衍生物的抗HIV臨床實(shí)驗(yàn)也已經(jīng)進(jìn)行到Ⅱ期階段，美國癌癥研究所NCI已將其列入快速研發(fā)規(guī)劃項(xiàng)目(RAID)[50]。白樺脂酸已成為研發(fā)新藥方面最具潛力的先導(dǎo)化合物之一。

Goswami等[51]發(fā)現(xiàn)白樺脂酸在巨大芽孢桿菌(BacillusmegateriumSC16644，R;BacillusmegateriumSC6394，S)、脆弱鏈霉菌(StreptomycesfragilisSC16401，T)、雅致小克銀漢霉(CunninghamellaelegansSC16025，U)、土曲霉(AspergillusterreusSC16513，V)改變了原有結(jié)構(gòu)。在芽孢桿菌(R)[51]中，C7、C15、C23位發(fā)生羥基化，C3發(fā)生羰基化，生成3種衍生物：3β,7β,15α-trihydroxy-lup-20(29)en-28-oic acid(102)、3β,7β,15α,23-tetrahydroxy-lup-20(29)en-28-oic acid(103)和7β,15α-dihydroxy-3-oxo-lup-20(29)en-28-oic acid(104)。在芽孢桿菌(S)[51]中，C15、C23位未發(fā)生變化，C30位結(jié)構(gòu)既會(huì)發(fā)生羥基化反應(yīng)，也會(huì)發(fā)生羰基化反應(yīng)，生成3,30-dioxo-lup-20(29)en-28-oic acid(105)、7β-hydroxy-3,7-dioxo-lup-20(29)en-28-oic acid(106)和3-oxo-30-hydroxy-lup-20(29)en-28-oic acid(107)。在脆弱鏈霉菌(T)[51]中，C2位結(jié)構(gòu)改變，轉(zhuǎn)化生成2α,3β,7β-trihydroxy-lup-20(29)en-28-oic acid(108)、2-oxo-3β,7β-dihydroxy-lup-20(29)en-28-oic acid(109)和3-oxo-7β-hydroxy-lup-20(29)en-28-oic acid(110)。在雅致小克銀漢霉(U)[51]中，C25位發(fā)生羥基化反應(yīng)，生成3β,25-dihydroxy-lup-20(29)en-28-oic acid(111)。在土曲霉(V)[51]中，白樺脂酸A環(huán)發(fā)生裂解，C3位發(fā)生羧酸化，C4位發(fā)生羥基化和脫氫反應(yīng)，生成4-hydroxy-3,4-seco-lup-20(29)-en-3,28-dioic acid(112)和3,4-seco-lup-20(29),4(23)-dien-3,28-dioic acid(113)。Wang等[52]也研究了枯草芽孢桿菌(k)中白樺脂酸的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，在C3、C28位連接了糖基，同時(shí)C23位也發(fā)生了羥基化反應(yīng)，生成28-O-β-D-glucopyranosyl betulinic acid(114)、3-O-(β-D-Glucopyranosyl)-betulinic acid-28-O-β-D-glucopyranoside(115)、23-hydroxy-betulinic acid(116)和23-hydroxy-28-O-β-D-glucopyranosyl betulinic acid(117)，化合物117抑制促凝活性強(qiáng)于BA。在解淀粉芽孢桿菌(BacillusamyloliquefaciensFJ18，W)[53]中，白樺脂酸C28位發(fā)生糖基化反應(yīng)，生成3β-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid 28-O-(4-oxy-4-oxobutanoic acid-4-O-β-D-glucopyranosyl)ester(118)和28-O-β-D-glucopyranosyl-3β-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oate(119)，C28位引入糖基對(duì)A375 、Hela 、U251 、SH-SY5Y 和MCF-7的細(xì)胞毒活性均強(qiáng)于BA，但4-oxy-4-oxobutanoic acid的引入?yún)s稍微降低了細(xì)胞毒活性。在蠅卷霉(i)[54]中，C7、C15、C21位發(fā)生羥基化反應(yīng)，C3和C21 位發(fā)生羰基化反應(yīng)，生成化合物102、104和3β,7β,15α,21β-tetrahydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid(120)、3β,7β,21β-trihydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid(121)、3β,7β-dihydroxy-21-oxo-lup-20(29)-en-28-oic acid(122)、7β,21β-dihydroxy-3-oxo-lup-20(29)-en-28-oic acid(123)和3β,7β-dihydroxy-lup-20(29)- en-28-oic acid(124)。在刺孢小克銀漢霉(y)[54]中，C1、C7、C21和C26位發(fā)生羥基化反應(yīng)，生成化合物121、化合物124、1β,3β,26-trihydroxy-lup-20(29)-en- 28-oic acid(125)、1β,3β-dihydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid(126)，另外C1位同時(shí)發(fā)生了乙酰化反應(yīng)，生成3β,7β-dihydroxy-1-O-acetyl-lup-20(29)-en-28-oic acid(127)。化合物102、120、121、122、124、125、126和127均對(duì)NO有抗炎活性，且化合物120、121和126對(duì)NO的抗炎活性強(qiáng)于BA。白樺脂酸的生物轉(zhuǎn)化途徑及其衍生物結(jié)構(gòu)見圖5。

圖5 白樺脂酸的生物轉(zhuǎn)化途徑及其衍生物結(jié)構(gòu)Fig.5 Biotransformation pathway of betulinic acid and chemical structure of betulinic acid derivatives

2 總結(jié)及展望

從上述研究中不難看出，微生物轉(zhuǎn)化可以將天然有機(jī)化合物轉(zhuǎn)化成多種多樣的衍生物，能夠?yàn)樯锘钚院Y選提供更多結(jié)構(gòu)新穎的化合物，進(jìn)而開發(fā)新藥。能夠進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的微生物種類繁多，其中真菌用于五環(huán)三萜類化合物生物轉(zhuǎn)化研究最多，尤其是霉菌，反應(yīng)類型包括羥基化、羰基化、水解、羧酸化、糖基化、還原、脫氫氧化和乙酰化等多種類型。在真菌中，羥基化反應(yīng)最常發(fā)生在C7、C15和C21位上，在C1、C2、C23、C24和C30位上也有較多轉(zhuǎn)化，少數(shù)轉(zhuǎn)化發(fā)生在C4、C5、C6、C13、C19、C25、C26和C29位上。羰基化反應(yīng)最常發(fā)生在C3和C21位上，少數(shù)發(fā)生在C2和 C24位上。酯化反應(yīng)在C13和C28位最常發(fā)生，在C7和C27位也有發(fā)現(xiàn)。脫氫反應(yīng)最常見于C11位，在C4、C5和C23位上偶有發(fā)生。羧酸化在C3、C29和C30位上也非常常見。C3、C28和C30位是連接葡萄糖的常見位點(diǎn)，最易發(fā)生水解反應(yīng)和糖基化反應(yīng)。利用細(xì)菌轉(zhuǎn)化五環(huán)三萜類化合物的研究報(bào)道略少于真菌，研究報(bào)道最多的是桿菌，主要有羥基化、羰基化、糖基化、水解和酯化反應(yīng)等反應(yīng)類型，能實(shí)現(xiàn)C2、C1、C7、C15、C23和C30位羥基化和C3位羰基化，以及真菌中未能實(shí)現(xiàn)的C11位羥基化和C7、C30位的羰基化。除此之外，C11和C26位發(fā)生環(huán)氧化，A環(huán)C2和C3位發(fā)生裂解，C1位發(fā)生乙?；?，C28位羧酸被還原成羥甲基等反應(yīng)類型也不斷被報(bào)道發(fā)現(xiàn)。

生物轉(zhuǎn)化的目的是能夠?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)化成活性更強(qiáng)的化合物。有些轉(zhuǎn)化反應(yīng)增強(qiáng)了對(duì)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞毒活性，如在C2、C7和C21位羥基化[47]，C28位甲基化[49]，C3糖基化[9]，C28位單糖基化[53]，這些轉(zhuǎn)化生成的產(chǎn)物為抗腫瘤藥物活性篩選和研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。另外，在C28位單糖基化可降低血液促凝作用，為心血管疾病提供先導(dǎo)化合物[52]。有些轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以增強(qiáng)抗炎活性[55]，如在C3位羰基化[43]，C1位乙?；珻1、C7、C15、C21和C24位羥基化[31,54]和C3、C28和C30位糖基化[8,28]。有些轉(zhuǎn)化反應(yīng)增強(qiáng)了抗菌活性，如在C28位和C3位糖基化[45]，C3位羰基化和C21位羥基化[11]，其生成的衍生物具有開發(fā)抗菌藥物的潛能。C29位羧酸化有神經(jīng)保護(hù)的潛力[13]。隨著五環(huán)三萜類化合物生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究，大量活性物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，這些新的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物不斷在為臨床應(yīng)用提供新的先導(dǎo)化合物或藥效物質(zhì)。微生物種類眾多，如何通過篩選生物轉(zhuǎn)化活性菌株，使五環(huán)三萜類化合物創(chuàng)造新的活性價(jià)值還需要進(jìn)一步深入研究。

近年來酶工程、細(xì)胞和酶的固定化、基因工程、發(fā)酵工程、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等的飛速發(fā)展，有望把多種基因整合于同一工程菌種同時(shí)完成多部 轉(zhuǎn)化反應(yīng)，使微生物轉(zhuǎn)化在藥物合成上具有更美好的前景。