郭根茂，黃 青*，王青青，王麓雅，劉 銀，劉 權，蘇雪松

1海南大學生態(tài)與環(huán)境學院；2海南省農林環(huán)境過程與生態(tài)調控重點實驗室；3海南省熱帶生態(tài)環(huán)境修復工程研究中心，海口 570228

木醋液，又稱木醋酸,是秸稈、木材和鋸末等農林及農產品加工企業(yè)的廢棄生物質經熱裂解產生的煙氣混合物冷凝得到的棕黃色至深褐色液體[1]。木醋液具有抗氧化、殺菌、除臭等作用，常被用作抗氧化劑、生物肥料添加劑、抗菌劑、除臭劑、食品保鮮劑等多方面，因而廣泛應用于農業(yè)、食品、畜牧產業(yè)、環(huán)境和日化工業(yè)等領域[2]。

木醋液組分復雜，木醋液理化性質和組分隨原材料種類和收集方法的不同而有所差異。有研究報道熱解溫度是影響木醋液組分與含量的重要因素[3]。Zheng等[4]發(fā)現(xiàn)熱解溫度從250 ℃升高至350 ℃，蘆竹木醋液組分隨溫度升高乙酸含量減少，酮類和酚類物質含量升高。Wei等[5]對核桃枝木醋液分析發(fā)現(xiàn)，230～450 ℃溫度段酸類物質呈減少趨勢。一些學者對比研究不同原料來源木醋液組分種類和含量存在差異，如Li等[6]分析櫟樹、核桃殼、花生殼、玉米芯和稻殼五種不同原料木醋液組分發(fā)現(xiàn)木本的櫟樹與核桃殼與草本植物(玉米芯、花生殼、稻殼)在己二酮與糠醇等低含量組分是有與無的區(qū)別。過往，研究主要集中木醋液在農業(yè)、食品以及組分分析等相關應用領域，鮮有從木醋液同原料、溫度以及木醋液組分間相互關系進行研究。

本研究基于GC-MS分析低溫度段(270～340 ℃)和高溫段(370～400 ℃)的桉樹木醋液組分數(shù)據(jù)以及近26年來國內外75篇關于木醋液組分數(shù)據(jù)，通過聚類熱圖分析、線性回歸分析、NMDS分析、相關性分析和隨機森林模型等統(tǒng)計學分析方法，探討木醋液組分同溫度、原料與木醋液組分及其相互關系，以期為生物質資源化、木醋液的加工制備、應用與研究提供參考或借鑒。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究除分析測試的桉樹木醋液組分數(shù)據(jù)外，還包含來源于國內外期刊論文中的數(shù)據(jù)。中文文獻以“木醋液”或者“木醋酸”兩個關鍵詞依次對“知網(wǎng)”“萬方”和“維普”3個中文數(shù)據(jù)庫進行檢索，英文文獻依次以“Wood vinegar”“Pyroligenous acid”“Smoke liquid” “Prolysis liquid”為關鍵詞在“Web of Science”“Springer Link”“Science Direct”“Wiley”“Scopus”“ProQuest”和“PubMed ” 7個英文數(shù)據(jù)庫中進行檢索。所收錄文獻出版時間從1996年至2020年，人工方法對檢索到的文獻進行逐一核實和校對，篩選甄別出含組分分析文獻：(1)通過閱讀文獻的題目和摘要排除與木醋液組分不相關文獻；(2)剔除各個數(shù)據(jù)庫重復的木醋液組分文獻；(3)閱讀全文，排除數(shù)據(jù)不完整的文獻。文獻數(shù)據(jù)獲取流程見圖1。

圖1 木醋液文獻篩選流程圖Fig.1 The flowchart of wood vinegar literature research

1.2 桉樹木醋液化學組分分析

1.2.1 桉樹木醋液樣品制備

以海南桉樹木屑為原料，熱裂解制備生物質炭過程中收集低溫段(270～340 ℃)和高溫段(370～400 ℃)煙氣冷凝液，靜置備用。

1.2.2 木醋液的脫水處理

根據(jù)Li等[6]的方法，量取桉樹木醋液10 mL，每次用3 mL乙醚，萃取6次，合并乙醚溶液，經氮吹去除乙醚，獲得木醋液濃縮液，即GC-MS待測樣品。

1.2.3 GC-MS條件

采用HP-5MS(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)石英毛細管柱。氦氣(99.999%)為載氣以1 mL /min的恒定流速作為載氣。氣相色譜-質譜條件：初始溫度60 ℃，以15 ℃/min的速率升至180 ℃保持1 min，然后以10 ℃/min的速率升至270 ℃保持5 min，分流進樣。分流比為10∶1，延遲時間為2.5 min，電子能量70 eV，EI 電子轟擊離子源，離子源溫度為230 ℃，質量掃描范圍為20～550 amu/s。通過與美國國家標準與技術研究所數(shù)據(jù)庫中的質譜(NIST05)譜圖庫進行比對，對化合物進行鑒定。

1.2.4 保留指數(shù)測定

與木醋液的GC-MS檢測條件相同，對系列正烷烴(C8～C40)混標進樣分析，分別記錄各正烷烴的保留時間，保留指數(shù)計算參照Liao等[7]的方法。

RI=100n+100(tx-tn)/ (tn+1-tn)

式中n和n+1表示待分析化合物(x)流出前后的正構烷烴所含碳原子的數(shù)目，tx表示待分析化合物的保留時間，tn表示第n個碳原子數(shù)的正構烷烴保留時間。

1.3 木醋液組分數(shù)據(jù)庫構建與數(shù)據(jù)分類

經甄別獲得75篇有效文獻，其中英文文獻58篇，中文文獻17篇。建立木醋液組分數(shù)據(jù)庫，主要包括作者、題目、發(fā)表時間、熱解溫度、熱解原料、組分化學物質和相對含量。從所得的文獻中提取木醋液組分化合物和其相對含量，并匯總歸納為酚類、酸類、酯類、酮類、醇類、醛類和其他物質等7類物質，對文獻中的木醋液熱解溫度數(shù)據(jù)劃分為2個區(qū)間，中低溫(低于350 ℃)和高溫(高于350 ℃)，文獻中51種木醋液原料分為木本植物源和草本植物源兩大類，其中草本植物源有15種，木本植物源有36種。

1.4 數(shù)據(jù)分析

非度量多維尺度法分析(NMDS)基于Bray-Curtis距離反映不同熱解溫度區(qū)間木醋液組分之間的差異，并且利用Anosim相似性分析檢驗其差異顯著性，使用R(version 3.6.1)進行分析,相關性分析利用Pearson法在R語言的Corrplot包進行,隨機森林模型構建通過 R語言Random Forest包實現(xiàn)，均方誤差(mean decrease accuracy)和基尼指數(shù)(Gini)評價木醋液組分重要性得分及顯著性檢驗通過R語言rfPermute包實現(xiàn)。木醋液的組分相對含量用平均值表示,利用SPSS.25進行分析。聚類熱圖分析(Heatmap)用于表示木醋液化合物相對含量，含量多少用顏色深淺來表征，使用R(version 3.6.1)進行分析。溫度與木醋液組分的線性回歸關系使用R(version 3.6.1)進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同溫度的桉樹木醋液的組分

不同溫度的桉樹木醋液組分GC-MS分析表明，從種類上，低溫度段桉樹木醋液組分中共鑒定出23種化合物，高溫度段桉樹木醋液組分中鑒定出28種化合物(見表1)。其中，在高溫度段檢測出1-羥基-2-丁酮、1，1，1-三甲氧基乙烷、3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮、3-甲基-1，2-環(huán)戊二酮、對甲酚、2-甲氧基苯酚、2-呋喃甲醇和4-乙基苯酚8種物質而在低溫度段卻未被檢測到。低溫度檢測出的環(huán)戊乙酮、4，4-二甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-甲基-1，2-苯二醇和4-甲基鄰苯二酚等4種物質在高溫段卻沒有被檢測到。說明高溫段產生的木醋液成分化合物種類多于低溫度段。含量上，不同溫度段木醋液的化學物質其相對含量隨溫度增加的變化趨勢不一致，在桉樹木醋液中乙酸隨溫度的增加相對含量降低。高溫段僅為低溫段的15.8%，2，6-二甲氧基苯酚的相對含量隨溫度的增加而增加，高溫段是低溫段含量的20.5倍。結果顯示低溫段桉樹木醋液酸類物質相對含量為高溫度段桉樹木醋液含量的3.4倍，低溫度段桉樹木醋液酚類物質相對含量為高溫度段含量的62.5%。酮類、酯類和醛類物質相對含量不同溫度沒有顯著差異。

表1 275～340 ℃和370～400 ℃段桉樹木醋液組分Table 1 Compositions of eucalyptus wood vinegar at 275-340 ℃ and 370-400 ℃ temperature ranges

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2.2 熱解溫度對木醋液組分影響

通過非度量多維尺度法(NMDS)和相似性分析(ANOSIM)結果表明：NMDS1正向軸主要為熱解溫度低于350 ℃的木醋液，NMDS1負向軸主要為熱解溫度高于350 ℃的木醋液。兩個溫度段間的木醋液組分差異顯著(P<0.01，R=0.466)(見圖2)。為驗證本結果，將本研究中分析測試的不同溫度段桉樹木醋液利用NMDS和ANOSIM分析顯示：桉樹低溫段木醋液處在NMDS1正向軸，桉樹高溫段木醋液處在NMDS1負向軸。推測高溫度段組分與低溫度段的木醋液組分存在顯著差異。

圖2 兩個溫度區(qū)間木醋液組分NMDS分析Fig.2 NMDS analysis of two temperature intervals of wood vinegar compositions

利用隨機森林模型對酚類物質、酸類物質、酯類物質、醛類物質、醇類物質、酮類物質和其他物質等木醋液組分的重要性進行預測，結果顯示酸類物質的均方誤差和基尼指數(shù)最高，分別為14.9%和25.4%，其次為酚類物質(MDA =9.7%，MDGini=19.25%)，其余物質的均方誤差和基尼指數(shù)沒有顯著相關性(P>0.05)(見圖3)，即表明酸類物質和酚類物質為木醋液的主要物質。

圖3 隨機森林模型均方誤差(A)和基尼指數(shù)(B)預測木醋液組分的相對重要性Fig.3 Random forest model mean decrease accuracy (A) and mean decrease Gini(B) predict the relative importance of wood vinegar components注：*P <0.05，**P <0.01；該模型的袋外錯誤率(OOB)為13.7%。a：酸類物質;b：酚類物質;c：酮類物質;d：醛類物質;e：醇類物質;f：酯 類物質。Note:*P <0.05,**P <0.01;out-of-bag error rate of the model was 13.7%.a:Acids;b:Phenolics;c:Ketones;d:Aldehydes;e:Alcohols;f:Esters

經描述性統(tǒng)計分析結果表明：酸類和酚類物質是木醋液的主要組分，當熱解溫度低于350 ℃時，酸類物質含量約為酚類物質的4.2倍。酮類物質平均相對含量為11.18%， 醛類物質、醇類物質和酯類物質占木醋液組分相對總含量的12.90%。高溫段酚類物質較低溫段平均含量增加了1.9倍，酸類物質含量減少了86%，其平均含量為34.2%，酮類物質平均含量增加了1.3倍，醛類物質含量下降約56%(見表2)。

表2 低于和高于350 ℃兩個溫度區(qū)間的木醋液組分含量描述性統(tǒng)計分析Table 2 Descriptive statistical analysis of the content wood vinegar in temperature ranges below and above 350 ℃

2.3 原料對木醋液組分的影響

木本和草本兩大類的51種不同木醋液組分進行描述性統(tǒng)計分析結果表明：51種不同原料木醋液以酚類(30.65%)和酸類物質(29.16%)為主。木醋液組分中的酚類、酸類、酮類和醛類草本植物源是木本植物源中木醋液相對含量的80%、136%、89%和81%。兩類植物源木醋液間的酸類物質、酚類物質、酮類物質和醛類物質含量沒有顯著性差異(P>0.05)(見圖4)。

圖4 木本植物源與草本植物源木醋液組分相對含量的差異顯著性分析Fig.4 Significant difference analysis of content wood vinegar components from woods and herbs 注：(A)酸類物質；(B)酚類物質；(C)醛類物質；(D)酮類物質。Note:(A) Acids;(B) Phenolics;(C) Aldehydes;(D) Ketones.

木醋液組分化合物種類復雜多樣，有機酸類物質主要化合物是乙酸和丙酸，其平均相對含量分別為29.48%和3.13%。酮類化合物中1-羥基-2-丙酮相對含量最高，其平均相對含量為5.18%；酚類物質中主要化合物是苯酚、2-甲氧基苯酚和2,6-二甲氧基苯酚，其平均相對含量分別為 8.07%、8.02%和5.72%。醛類物質以糠醛為主，其平均相對含量為8.31%。醇類物質主要以糠醇為主，其平均相對含量為2.52%(見圖5)。

圖5 不同原料木醋液組分化合物相對含量的熱圖分析Fig.5 The heat map analysis of relative content of components in wood vinegar from different raw materials注：顏色條代表木醋液組分的相對含量(%)，紅色代表相對含量高，綠色代表相對含量低。Note:The color bar represents the relative content (%)of wood vinegar,red represents high relative content,green represents low relative content,and the color changes from green to red.

2.4 木醋液組分與溫度的相關性分析

木醋液組分與其熱解溫度相關性分析結果表明：熱解溫度與酸類物質(r2=0.03，P=0.001)呈顯著負相關，y=-0.08x+55.7(圖6B)。熱解溫度與酚類物質(r2=0.03，P=0.03)為正相關，y=0.03x+19.15(圖6C)。熱解溫度與酮類物質(r2=0.001，P=0.6)和醛類物質(r2=0.002，P=0.56)無相關性(見圖6A、6D)。由于木醋液以酚類和酸類物質為主(圖3),即表明熱解溫度對木醋液組分具有重要影響。

圖6 熱解溫度與木醋液組分的相關性分析Fig.6 Correlation analysis of pyrolysis temperature on components of wood vinegar注：(A)酮類物質；(B)酸類物質；(C)酚類物質；(D)醛類物質。Note:(A) Ketones;(B) Acids;(C) Phenolics;(D) Aldehyde.

2.5 木醋液組分的相關性分析

木醋液組分酸類物質與酚類物質呈顯著負相關(P<0.01，r2=-0.43)，酸類物質與酯類物質呈顯著正相關(P<0.01，r2=0.31)，醇類物質和酮類物質呈極顯著正相關(P<0.01，r2=0.23)，酚類物質與酯類物質呈顯著負相關(P<0.01，r2=-0.3)(見圖7)。

圖7 木醋液組分的相關性分析Fig.7 Correlation analysis of wood vinegar composition注：*P<0.05；**P<0.01。

3 討論

3.1 溫度對木醋液組分的影響

熱解溫度低于350 ℃和高于350 ℃的木醋液組分具有顯著差異，熱解溫度低于350 ℃酸類物質的相對含量高，而高于350 ℃酚類物質相對含量增加，酸類物質含量減少。根據(jù)已有研究報道推測是生物質中木質纖維的熱解有關，正如Wu等[8]認為木醋液中酸類物質主要來源于半纖維素和纖維素熱解，木醋液中的酚類物質主要來源于木質素的熱解,而半纖維素主要熱解溫度段在200～320 ℃，纖維素熱解溫度段在240～350 ℃，木質素的主要熱解溫度范圍在350～600 ℃[9]。木質素結構復雜，木質素的苯丙烷單元的烷基側鏈含有很多羥基官能團，在熱解初期，這些羥基官能團可以通過脫水反應生成酚類物質，隨著溫度升高到350 ℃，木質素基本單元之間連接的醚鍵會發(fā)生斷裂，產生大量的酚類物質，因而酚類物質可以產生在350～500 ℃溫度段[10]。Ngo等[11]研究利用響應面法研究了原料進料速度，生物質的粒徑，熱解溫度和停留時間對木醋液組分的影響，結果顯示熱解溫度是影響木醋液組分差異的主要因素。

3.2 原料對木醋液組分的影響

植物生物質是由木質纖維組成，木質纖維主要由纖維素，半纖維素，木質素組成[12]，木醋液是植物生物質熱解的產物。纖維素，半纖維素，木質素的含量和組成結構會影響木醋液組分，Alves等[13]發(fā)現(xiàn)竹子的纖維素和半纖維素含量高于木質素含量，熱解過程中產生酸類物質含量高于酚類物質。Wu等[8]研究表明竹子木醋液酸類物質高于杉木木醋液，是由于竹子中的半纖維素含量較高。在本研究中，酸類物質主要以乙酸的相對含量最高，其次是丙酸。有研究[14]發(fā)現(xiàn)乙酸和丙酸主要來源于生物質半纖維素發(fā)生脫水反應，其木糖基單元相連的乙?；臒峤夂吞侨┧峄臄嗔旬a生，這可能是木醋液組分中以乙酸為主的酸類物質含量最高的原因之一。生物質熱解初期，由于纖維素的解聚產生乙酸和大量的長鏈酸，隨著溫度升高，有利于半纖維素進一步熱解產生乙酸。

木醋液組分中酚類物質以苯酚、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚和2，6-二甲氧基苯酚為主。Wang等[15]認為木醋液的酚類物質可能源于木質素的熱分解，木質素結構中的a-醚鍵和b-醚鍵發(fā)生斷裂，釋放創(chuàng)愈木基和丁香基芳香化合物,這些芳香化合物通過O-CH3鍵分解或自由基誘導重排反應形成2-甲氧基苯酚和2,6-二甲氧基苯酚，故造成了這兩種含甲氧基酚類化合物相對含量較高，2-甲氧基苯酚較易發(fā)生去甲氧基反應以及O-CH3鍵的斷裂，生成短側鏈苯酚類化合物，如鄰苯二酚、苯酚。Mathew等[16]研究也認為2-甲氧基苯酚是通過自由基誘導的重排反應生成2-甲基苯酚，2-甲基苯酚通過去甲基化產生苯酚。

木醋液酮類物質化合物復雜多樣，環(huán)戊酮、3-甲基-1，2-環(huán)戊酮和1-羥基-2-丙酮是木醋液組分中酮類物質主要化合物。Lu等[17]研究發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高，生物質纖維素大分子解聚形成活性纖維素，然后通過β-1，4糖苷鍵的斷裂和單體單元分子內重排生成左旋葡聚糖(1，6-脫水-β-D-葡萄糖)等中間產物，隨著左旋葡聚糖的進一步分解，呋喃環(huán)的打開和C-C鍵的斷裂產生1-羥基-2-丙酮。Wang等[15]研究表明低溫加氫熱解過程，在鐵離子的催化作用下，可促進1，3-環(huán)戊二酮、羥基丙酮、2-環(huán)戊烯酮的產生。Chen等[18]認為半纖維素的各個糖單元發(fā)生鍵的斷裂和重整，易于形成五碳環(huán)的環(huán)戊酮和環(huán)戊烯酮類產物，如2-環(huán)戊烯酮、2-甲基-2-環(huán)戊烯酮、2，5-二甲基環(huán)戊酮、3-甲基-1，2-環(huán)戊二酮等，推測是導致木醋液組分酮類化合物種類復雜的原因。

醛類物質的主要化合物是糠醛和5-羥甲基糠醛。有研究發(fā)現(xiàn)半纖維素結構解聚的木糖結構單元通過斷裂吡喃環(huán)上連接鍵發(fā)生開環(huán)反應，開環(huán)的木糖單元連續(xù)脫水形成C-2和C-3、C-4和C-5之間雙鍵的烯醇式結構，由于烯醇式結構不穩(wěn)定，緊接著發(fā)生C-2上的羥基和C-5之間脫水成環(huán)，從而產生糠醛[19]。而Chheda等[20]研究表明纖維素通過水解成葡萄糖，進一步通過葡萄糖異構化而產生果糖。果糖經歷了多次脫水和裂解反應，形成5-羥甲基糠醛。5-羥甲基糠醛進一步分解生成糠醛。Chen等[21]發(fā)現(xiàn)半纖維素在250 ℃和300 ℃下熱解時，對于糠醛的產生至關重要。

本研究木醋液組分中醇類物質主要化合物是糠醇和甲醇。有研究發(fā)現(xiàn)，木質素的脂肪族醇羥基側鏈結構在熱解時發(fā)生斷裂，生成醇類物質[22]，Hou等[23]研究認為生物質在熱解過程中，金屬離子如鉀離子或者鈉離子可促進葡萄糖吡喃環(huán)發(fā)生斷裂，生成的單糖碎片經過重整和異構化生成甲醇、糠醇等醇類物質。

4 結論

本文基于實驗與文獻數(shù)據(jù)，利用多元統(tǒng)計分析方法探討不同原料、溫度對木醋液組分的影響及其相互關系：桉樹木醋液低溫和高溫度段木醋液組分差異顯著，隨溫度升高桉樹木醋液中酸類物質含量降低，酚類物質含量升高。酮類、酯類和醛類物質隨溫度變化差異不顯著。 熱解溫度低于350 ℃和高于350 ℃的木醋液組分存在明顯差異，熱解溫度低于350 ℃的木醋液，酸類物質含量高，熱解溫度高于350 ℃的木醋液，酚類物質含量增多，酸類物質含量減少。乙酸是酸類物質的主要物質，酚類物質以苯酚、愈創(chuàng)木酚和2,6-二甲氧基苯酚為主，醛類物質和酮類物質以糠醛、1-羥基-2-丙酮為主，醇類物質主要物質是糠醇、甲醇。木醋液組分中酸類物質與酚類物質、酚類物質與酯類物質均呈顯著負相關；酸類物質與酯類物質、醇類物質和酮類物質均呈極顯著正相關。熱解溫度是影響木醋液組分的重要因素。