王存堂，李子鈺，張福娟，高增明，孫敬明

1(齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾，161006)2(朝陽師范高等?？茖W(xué)校 生化工程系，遼寧 朝陽，122000)

氧化應(yīng)激是指人體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)與活性氧簇形成失去平衡，從而導(dǎo)致氧化損傷[1]。近年來，來源于植物的天然多酚類抗氧化物質(zhì)備受關(guān)注，包括多酚、黃酮、單寧以及花青素類等。多酚類物質(zhì)屬于果蔬中的次生代謝產(chǎn)物，這些成分可通過清除自由基和其他活性氧族展現(xiàn)較強的抗氧化活性，從而起到清除體內(nèi)自由基，避免機體產(chǎn)生氧化損傷，促進健康、預(yù)防癌癥、心血管等慢性疾病的作用，因此消費者越發(fā)關(guān)注各類食物的抗氧化活性[2]。此外，在食品工業(yè)中，廣泛使用多種抗氧化劑作為脂質(zhì)過氧化的抑制劑，然而在食品中添加許多化學(xué)合成的抗氧化劑如丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯等會對人體健康產(chǎn)生潛在危害[3]。因此，尋找天然無毒的抗氧化成分，在食品加工領(lǐng)域也備受關(guān)注。

山楂為薔薇科蘋果亞科山楂屬(CrataeguspinnatifidaBunge)植物，是我國特有的果樹資源，在中國有悠久的食用和藥用歷史，廣泛分布于亞洲、歐洲、中北美洲及南美洲北部[4]。山楂為藥食同源植物，山楂果實富含維生素C、黃酮類化合物、有機酸、多糖、礦物質(zhì)元素等營養(yǎng)物質(zhì)，保健價值很高，主要具有調(diào)節(jié)血脂、保肝、降壓、助消化、強心、抗氧化、抗腫瘤、抗菌等作用，應(yīng)用十分廣泛[5]。研究表明，山楂中的黃酮類成分主要有金絲桃苷、槲皮素、異槲皮苷、蘆丁、牡荊素鼠李糖苷等[6]；有機酸主要包括枸櫞酸及其甲酸、綠原酸、熊果酸、齊墩果酸等[7]。研究發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地、品種等的山楂葉中含有較高的黃酮類成分，山楂葉、果和籽提取液抗氧化能力高于同濃度的二丁基羥基甲苯[8]。然而，對于不同山楂屬果實不同組織(果皮、果肉、果籽)的抗氧化成分及性能尚缺少系統(tǒng)的研究數(shù)據(jù)。本研究選擇3個不同品種的山楂屬果實(大山楂、小山楂和山里紅)為研究對象，通過測定總酚、總黃酮含量以及抗氧化活性指標(DPPH自由基清除性能，ABTS自由基清除性能，還原能力)等參數(shù)綜合評價山楂屬果實不同組織部位的抗氧化成分及性能。此外，對山楂果實抗氧化成分與抗氧化性能指標之間的相關(guān)性也進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同品種的山楂屬果實于采自黑龍江省齊齊哈爾市周邊果園。選擇大小一致，無機械損傷，無病蟲害的新鮮果實，不同品種山楂果實單果重分別為：山里紅(3.35±0.26) g，小山楂(13.42±1.32) g，大山楂(42.35±2.58) g。將山楂果實用水清洗，用不銹鋼刀將果皮、果肉和果核分離，然后將不同組織冷凍干燥、粉碎，隨后密封于塑料袋中，于-25 ℃下保存?zhèn)溆茫籄BTS、DPPH，美國Sigma-Aldrich 化學(xué)試劑公司；Folin-酚試劑、沒食子酸(galic acid, GA)標準品、蕓香甙(rutin)標準品、抗壞血酸、2.4.6-三吡啶基三嗪[2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine, TPTZ]等試劑均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YB-2500A型多功能粉碎機，永康市速鋒工貿(mào)有限公司；HX-10-50B型真空凍干機，上海滬析有限公司；752 N紫外可見分光光度計，上海精科儀電有限公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機，常州億能實驗儀器公司；XMTD-204數(shù)顯式恒溫水浴鍋，天津市歐諾儀器儀表有限公司；SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵(配RE-53AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器)，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 乙醇提取物的準備

取凍干樣品0.5 g，加入V(乙醇)∶V(水)=7∶3的提取液20 mL于室溫下避光超聲提取15 min，2 000 r/min離心分離10 min，將分離后的沉淀重復(fù)上述提取過程提取2次，離心后合并上清液，并于-2 ℃貯存，在48 h之內(nèi)測定總酚、總黃酮、單寧、花青素以及抗氧化活性等指標。每個樣品提取3次并進行測定。

1.3.2 總酚含量測定

采用Folin-酚試劑法[9]，并稍作修改。取0.15 mL 1.3.1中的提取液于10 mL 試管中，加入0.2 mol/L福林酚試劑1.5 mL混勻，避光靜置5 min。然后加入60 g/L的Na2CO3溶液1.5 mL，然后在75 ℃下水浴中把混合溶液加熱10 min，隨后立即采用冰浴促使反應(yīng)終止，用蒸餾水定容至10 mL。然后在765 nm處測定反應(yīng)液的吸光值。配制不同濃度GA標準品，測得吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作標準曲線?？偡雍恳詻]食子酸當量(gallic acid equivalent，GAE)表示，即每克凍干樣中沒食子酸的毫克數(shù)。

1.3.3 總黃酮含量測定

采用三氯化鋁分光光度法[10]，并稍作修改。取1.0 mL 1.3.1中的提取液于10 mL 試管中，加入5 g/L NaNO2溶液0.3 mL，并搖勻，避光靜置6 min。然后加入10 g/L AlCl3·6H2O溶液0.3 mL，避光靜置6 min。然后加入4.0 mL 100 g/L NaOH溶液，用去離子水添加至10 mL，避光靜置15 min。在510 nm下測溶液的吸光度值。同時配制不同濃度蘆丁標準品，測得其吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作曲線。山楂中總黃酮含量以蘆丁當量(rutin equivalent，RE)表示，即每克凍干樣中蘆丁的毫克數(shù)。

1.3.4 單寧含量測定

采用F-D試劑法測定[11]。取0.5 mL 1.3.1中的提取液于25 mL容量瓶中，各加入70%乙醇(體積分數(shù))0.85 mL、60 g/mL 偏磷酸溶液0.05 mL、水12.5 mL、F-D試劑1.25 mL、1 mol/L碳酸鈉溶液5 mL，劇烈振搖，以水稀釋至刻度，混勻。于30 ℃恒溫箱中放置1.5 h，用分光光度計在波長680 nm處測定吸光度，以Abs值為縱坐標，標準品溶液中單寧酸的含量為橫坐標繪制標準曲線，根據(jù)方程計算得出單寧的含量。

與成人重度窒息所致腦灰質(zhì)彌漫性受損表現(xiàn)不同，HIBD對新生兒腦組織損傷位置具有很強選擇性，且不同成熟度的新生兒腦損傷位置也呈不同的特點。這與新生兒腦組織各部位對能量需求強弱、缺氧缺血發(fā)生時間、性質(zhì)及腦血管解剖生理等有很強相關(guān)性[6-7]。Logitharajah等[8]研究表明機體發(fā)生急性缺氧缺血性窒息時，腦內(nèi)血流再分布代償機制會失效，常易發(fā)生在代謝能量需求最旺盛基底節(jié)、丘腦等部位腦損傷。本研究發(fā)現(xiàn)新生兒窒息的病例MRI雙側(cè)蒼白球區(qū)呈稍短T1WI異常信號，考慮為缺氧缺血性腦損傷和高膽紅素血癥腦損傷所致[9]。這也是本研究將輕度缺氧缺血性腦損傷病例的感興趣區(qū)放置于雙側(cè)基底節(jié)的蒼白球區(qū)原因。

1.3.5 花青素含量測定

采用pH示差法測定[12]。吸取適當濃度樣品提取液1 mL，分別用pH 1.0和4.5的緩沖溶液稀釋至5 mL，混勻，達到平衡后，用1 cm比色皿以蒸餾水作空白對照，分別在510和700 nm處測定吸光值。每個樣品平行3次，花色苷吸光值和含量分別按公式(1)、公式(2)計算：

A=(A510-A700)pH 1.0-(A510-A700)pH 4.5

(1)

(2)

式中：V為提取液總體積，mL；n為稀釋因子；Mr為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量，449.2；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26 900；m為樣品質(zhì)量，g；樣品原花青素含量ACY以mg/100g(矢車菊素-3-葡萄糖苷當量)表示。

1.3.6 DPPH自由基清除性能測定

DPPH自由基清除性能的測定參考ABBASI等[13]的方法，并稍作修改。取0.4 mL稀釋至合適濃度的1.3.1中所述的提取液于10 mL離心管中，加入A517=1.00±0.02的DPPH自由基的甲醇溶液4.0 mL，室溫避光靜置20 min，然后在517 nm處測定反應(yīng)液的吸光度，空白以甲醇代替提取液。同時以吸光度值為縱坐標，標準品溶液中抗壞血酸(維生素C)的質(zhì)量為橫坐標制作標準曲線，根據(jù)曲線方程計算樣品中的DPPH自由基的清除能力，結(jié)果表達為mg/g。如果吸光度值不在線性范圍內(nèi)，將再次稀釋提取液。重復(fù)測定3次。

ABTS陽離子自由基清除性能的測定參考ZHANG等[14]的方法，并稍作修改。將ABTS溶解于20 mmol/L、pH 4.5的醋酸緩沖溶液中得到7 mmol/L的ABTS貯液，與過硫酸鉀溶液 (混合體系中的終濃度為2.45 mmol/L) 混合，在室溫下避光反應(yīng)12～16 h，使溶液達到穩(wěn)定的氧化態(tài)。測定前用20 mmol/L、pH 4.5的醋酸緩沖溶液按體積比1∶75稀釋ABTS貯存液，使溶液的吸光值在734 nm下達到0.7±0.02，以此得到ABTS陽離子自由基工作液，該工作液每次測定前現(xiàn)配。測定時反應(yīng)體系包括3 mL的ABTS工作液和200 μL 1.3.1中所述的合適濃度的提取液。室溫避光靜置6 min 后在734 nm處測定吸光值。同時以吸光度值為縱坐標，標準品溶液中抗壞血酸(維生素C)的質(zhì)量為橫坐標制作標準曲線，根據(jù)曲線方程計算樣品中的ABTS陽離子自由基的清除能力，結(jié)果表達為mg/g。如果吸光度值不在線性范圍內(nèi)，將再次稀釋提取液。重復(fù)測定3次。

1.3.8 還原能力的測定

還原能力的測定參考AL-WESGAHY 等[15]的方法，并稍作修改。取1.0 mL稀釋至合適濃度的1.3.1中所述的提取液于10 mL 離心管中，蒸餾水補足至1 mL。分別加入2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L，pH 6.6)， 2.5 mL 1%鐵氰化鉀(質(zhì)量分數(shù))，混勻。50 ℃水浴20 min。然后加入 2.5 mL 10%三氯乙酸(質(zhì)量分數(shù))。然后在室溫下，6 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL于10 mL離心管中，加入2.5 mL 蒸餾水，再加入0.5 mL 0.1%三氯化鐵(質(zhì)量分數(shù))。反應(yīng)30 min 后在700 nm 處測定吸光度值。以吸光度值為縱坐標，標準品溶液中抗壞血酸(維生素C)的質(zhì)量為橫坐標制作標準曲線，根據(jù)曲線方程計算樣品的還原能力，結(jié)果表達為mg/g。如果吸光度值不在線性范圍內(nèi)，將再次稀釋提取液。重復(fù)測定3次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗均重復(fù)3次。實驗結(jié)果表示為“平均值±標準偏差”，數(shù)據(jù)用Origin Pro 8.5繪制用圖，用IBM SPSS Statistics 23進行方差分析，并進行Duncan′s差異顯著性分析，P<0.05 表示差異顯著。應(yīng)用Pearson Correlation Test分析樣品總酚、總黃酮、單寧、原花青素、抗氧化性能指標之間相關(guān)性，并計算相關(guān)系數(shù)(R2)。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種山楂屬果實不同組織(果核、果肉、果皮)的總酚含量

植物源的抗氧化活性主要是由于酚類化合物的存在，而多酚類化合物的抗氧化機制是基于其供氫能力和金屬離子螯合能力[16]。用福林酚試劑測定不同山楂品種不同組織部位中酚類的含量，結(jié)果以GAE表示，即每克凍干樣中沒食子酸的毫克數(shù)。果蔬品種的差異、生長環(huán)境、成熟的季節(jié)、地域、土壤、施肥、光照時間、采收方式和成熟度等因素都影響著果實中總酚含量[17]。山楂果實中的總酚含量因品種和部位不同而表現(xiàn)出差異 (圖1)。山楂果皮中的總酚含量顯著高于果肉和果核。大山楂和小山楂果皮中總酚含量較高，之間沒有顯著差異，但是較山里紅果皮總酚高約2.14倍；不同品種山楂果肉中總酚含量為23.66～8.21 mg/g，約為4倍的變化；不同山楂品種果核中總酚含量較低，3個品種之間沒有顯著差異。許多研究者也得出了相似的結(jié)果，如棗果皮的總酚含量約是其果肉的10倍[17]，芒果果皮的總酚含量約是其果肉的15倍[18]。酚類物質(zhì)趨向于在外部組織中絮集，這主要是由于酚類物質(zhì)能夠抵抗紫外線輻射，作為防御性物質(zhì)抵抗病原菌和捕食者的入侵[17]。

圖1 山楂屬果實不同組織部位的總酚含量Fig.1 Total phenolic contents from different tissue parts of hawthorn cultivars

2.2 三種山楂屬果實不同組織的總黃酮含量

黃酮類物質(zhì)是植物中最常見、分布最廣的一類重要的酚類化合物，作為抗氧化劑非常有效。黃酮類化合物可以通過與金屬離子形成絡(luò)合物來抑制金屬引發(fā)的脂質(zhì)氧化，從而具有寬泛的藥理學(xué)和生物化學(xué)性能[4]。本研究中用氯化鋁比色法測定了山楂中黃酮類化合物的含量，以此作為定量測定的基礎(chǔ)，結(jié)果采用RE表示，即表示為每克凍干樣中蘆丁的毫克數(shù)。圖2顯示了3種山楂果實果核、果肉、果皮總黃酮含量的差異。山楂不同組織中的黃酮含量在86.26～1.34 mg RE/g，約為80倍的變化。大山楂和小山楂果皮中總黃酮含量最高，且無顯著差異，約為山里紅果皮總黃酮含量的2.5倍；大山楂果肉總黃酮含量較高，約為小山楂、山里紅果肉總黃酮含量的2倍；山楂果核中總黃酮含量較低，三者之間差異不顯著。

圖2 山楂屬果實不同組織部位的總黃酮含量Fig.2 Total flavonoids contents from different tissue parts of hawthorn cultivars

2.3 三種山楂屬果實不同組織的單寧和原花青素含量

植物中的單寧類成分具有抗氧化、清除自由基等生理活性功能，具有潛在的開發(fā)價值。果實中單寧類物質(zhì)的存在也使得果實具有明顯的澀味，進而影響感官質(zhì)量，果實在成熟過程中，單寧的含量會逐漸減少，澀味減輕[19]。由表1可知，對于不同品種的山楂果實，果皮的單寧含量顯著高于果肉，而在果核中則沒有檢出單寧含量。山里紅果皮中單寧含量最高，其次是小山楂，單寧含量最低的是大山楂；山里紅果肉中也含有較高的單寧成分，說明澀味較重，而作為消費者較多食用的大山楂和小山楂果肉中單寧含量較低，且無顯著差異。原花青素主要存在于植物的葉、莖、皮、果內(nèi)，是一種由單體低聚原、高聚原花青素構(gòu)成的酚類化合物[20]。經(jīng)研究證實，在抗氧化功能、清除自由基功能等方面原花青素有較強的作用。由表1可知，山楂果皮中花青素含量最高的是山里紅，其次是小山楂，原花青素含量最低的是大山楂；山里紅果肉中也含有較高的原花青素成分，而大山楂和小山楂果肉中原花青素含量較低，且無顯著差異。同時在果核中沒有檢出原花青素。

表1 山楂屬果實不同組織的單寧和原花青素含量Table 1 Tannin and anthocyanin content of hawthorn cultivars

2.4 三種山楂屬果實不同組織的DPPH自由基清除性能

DPPH自由基清除性能分析是簡單、可接受且應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，用于評估植物提取物的自由基清除能力。DPPH自由基是一種穩(wěn)定的有機自由基，當其接受電子時，會在515～528 nm處失去吸收光譜帶[21]。植物提取物中的多酚類抗氧化成分可提供電子，使穩(wěn)定的紫色線狀DPPH在視覺上顯著地猝滅為淡黃色甚至無色[21]。在本研究中，采用維生素C作為當量物質(zhì)，來衡量不同山楂品種的不同組織中清除DPPH自由基的性能。由圖3可知，山楂果皮的DPPH自由基清除能力較高，其次是果肉，果核。山楂果肉提取物的DPPH自由基能力清除較強，三者之間沒有顯著差異。果核中DPPH自由基清除能力最弱，三者之間沒有顯著差異。

圖3 山楂屬果實不同組織的DPPH自由基清除性能Fig.3 DPPH free radical scavenge capacity of different tissue parts of hawthorn cultivars

2.5 三種山楂屬果實不同組織的ABTS陽離子自由基清除性能

ABTS陽離子自由基氧化后生成相對穩(wěn)定的水溶性自由基(藍綠色)，ABTS陽離子自由基與水溶性的抗氧化劑反應(yīng)可讓溶液褪色，褪色越顯著，該物質(zhì)的自由基清除能力越強[22]。本研究為評價山楂屬果實不同組織部位的ABTS陽離子自由基清除性能，采用維生素C作為當量物質(zhì)，結(jié)果表達為mg 維生素C當量/g DW。由圖4可知，山楂果皮的ABTS陽離子自由基清除能力較強，其次是果肉，果核中的酚類物質(zhì)含量較低，從而使自由基清除能力較弱。山楂果肉提取物的ABTS陽離子自由基清除能力較強，三者之間沒有顯著差異。果核中ABTS陽離子自由基清除能力最弱，三者之間沒有顯著差異。在棗不同組織抗氧化成分及活性的研究中，棗果皮的ABTS陽離子自由基清除能力強于果肉和果核，與本實驗研究結(jié)果相同。

圖4 山楂屬果實不同組織的ABTS陽離子自由基清除性能Fig.4 ABTS free radical scavenge capacity of different tissue parts of hawthorn cultivars

2.6 三種山楂屬果實不同組織的還原能力

評價山楂屬果實不同組織部位的還原性能，采用維生素C作為當量物質(zhì)，結(jié)果表達為mg 維生素C當量/g DW。如圖5所示，3種山楂屬果實的果皮顯示了最高的還原能力，其次為果肉，果核最低。大山楂和小山楂果皮提取物的還原能力顯著高于山里紅；在果肉的提取物中，其還原能力強弱為大山楂>小山楂>山里紅，且大山楂果肉還原能力是小山楂的1.63倍，是山里紅的3.47倍。果核提取物的還原能力較低，且三者之間沒有顯著差異。

圖5 山楂屬果實不同組織的還原能力Fig.5 Reducing power of different tissue parts of hawthorn cultivars

2.7 三種山楂屬果實不同組織的抗氧化成分與抗氧化性能的相關(guān)關(guān)系

為了評價3種山楂果實中總酚、總黃酮、單寧、花青素含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性，本研究計算了皮爾遜相關(guān)系數(shù)(表2)。酚類和黃酮類分子是重要的抗氧化成分，其通過向自由基提供氫原子的能力抑制自由基，許多文獻報道表明總酚和總黃酮含量與抗氧化能力呈線性相關(guān)[23]。

表2 山楂果實中總酚、總黃酮、單寧、原花青素含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性Table 2 Correlation coefficient between antioxidant capacity and total phenolics, flavonoids, tannin and anthocyanin contents

3種山楂屬果實不同組織中中總酚含量與總黃酮含量呈現(xiàn)極顯著的相關(guān)性(R2=0.99)，可以認為在山楂中的酚酸成分以酚類和黃酮類化合物為主。山楂不同組織中總酚含量、總黃酮含量與DPPH 自由基清除性能，ABTS陽離子自由基清除性能和還原能力均呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)關(guān)系，說明山楂提取物中酚類和黃酮類化合物是抗氧化活性的主要提供者。此外單寧含量也與DPPH 自由基清除性能，ABTS陽離子自由基清除性能和還原能力呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系，其R2分別為0.69，0.66和0.73，這主要與單寧類物質(zhì)在果實中含量較低有關(guān)。數(shù)據(jù)顯示原花青素含量與抗氧化活性之間沒有顯著的相關(guān)關(guān)系，也說明原花青素對山楂提取物的抗氧化活性的貢獻較低，這可能是因為花青素含量較低導(dǎo)致。

3 結(jié)論

本研究對3種山楂果實不同組織(皮、肉、核)中總酚、總黃酮、單寧、原花青素含量與抗氧化活性進行了對比研究。結(jié)果表明，山楂屬果實果皮的總酚、總黃酮含量和抗氧化活性最高。其順序從高到低依次為果皮>果肉>果核；大山楂和小山楂果皮和果肉含有較高的總酚、總黃酮，并且表現(xiàn)出了較強的抗氧化活性。而山里紅中的單寧含量比大山楂和小山楂高，說明山里紅澀味較重，不適合作為水果食用，但可作為潛在的抗氧化成分的來源；3種山楂屬果實不同組織中中總酚含量與總黃酮含量呈現(xiàn)極顯著的相關(guān)性；總酚含量、總黃酮含量與DPPH自由基清除性能，ABTS陽離子自由基清除性能和還原能力呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)關(guān)系；原花青素含量與抗氧化活性之間相關(guān)性不顯著。