詹晶晶，潘 虎，楊 輝，劉虎虎，王 翀，周 輝，盧向陽，田 云

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，湖南長沙 410128；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院農(nóng)業(yè)質量標準與檢測研究所，西藏拉薩 850032；3.農(nóng)業(yè)生物化學與生物轉化湖南省高校重點實驗室，湖南長沙 410128）

單寧是繼纖維素、半纖維素和木質素之后第四類豐富的次生代謝產(chǎn)物，被認為是難降解且對機體有毒害的物質，但大量研究表明微生物、植物和動物中存在著一類能夠降解單寧的水解酶—單寧?；饷福▎螌幟福1]，如植物的果實、樹葉、樹枝和樹皮等部位[2]，魚的消化道以及羊的瘤胃等部位[3-4]。該酶能夠催化沒食子酸酯和單寧等底物中酯鍵和縮酚羧鍵的水解，釋放沒食子酸和葡萄糖[5]。自被發(fā)現(xiàn)以來，單寧酶已被廣泛應用于食品、飼料、制藥和化學工業(yè)[6]等行業(yè)。美國和日本等國家已將單寧酶審定為可用于食品工業(yè)的安全食品添加劑，我國衛(wèi)生部2008年發(fā)布的第26號公文將單寧酶列入食品工業(yè)用加工助劑使用名單。隨著日益增長的市場需求，國內(nèi)外學者對單寧酶展開了深入研究分析。該文綜述了不同微生物源單寧酶的酶學性質，作用機制及應用，展望了單寧酶的研究方向和應用前景，以期為單寧酶的研究與應用提供依據(jù)與借鑒。

1 微生物源單寧酶的來源

由于微生物的生物化學多樣性、產(chǎn)酶穩(wěn)定性、便于規(guī)?；囵B(yǎng)等優(yōu)點，目前工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的單寧酶均來源于微生物[7]，因此微生物源單寧酶是近年的研究熱點。產(chǎn)單寧酶的微生物廣泛存在于廢水、糞便、堆肥、土壤、泡菜中[8]，以真菌和細菌為主，其中真菌大多屬于曲霉屬、青霉屬、木霉屬、鐮刀菌屬、酵母菌等，細菌大多屬于乳酸桿菌屬、芽孢桿菌屬、克雷伯氏菌屬、鏈球菌屬、沙雷氏菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬等[9-10]，且部分已被開發(fā)用于工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)單寧酶[5]。真菌單寧酶在降解可水解單寧時表現(xiàn)出高活性，而細菌單寧酶可有效水解天然單寧和單寧酸[1]。單寧酶不同的底物特異性可能是由于其分子結構不同所致，這一發(fā)現(xiàn)對尋找具有新穎酶學特性的單寧酶具有重要的指導意義，為產(chǎn)單寧酶微生物菌株的選育提供了參考方向。

2 微生物源單寧酶的基本特性

微生物源單寧酶研究表明，單寧酶的不同來源及不同的培養(yǎng)條件是造成其酶學性質差異的主要原因[11]。該研究主要從分子質量、pH值、溫度、金屬離子、有機溶劑和表面活性劑等方面對單寧酶進行分析總結，探討微生物源單寧酶的基本特性。

2.1 分子質量

單寧酶分子質量在31～320 kDa之間，由單個或多個亞基組成[12]，不同來源的單寧酶分子質量差異較大。真菌單寧酶分子質量較大（45～320 kDa），存在同源或異源低聚體，有兩個以上亞基[13]。RIUL A J等[14]發(fā)現(xiàn)的海棗曲霉單寧酶由120 kDa和93 kDa的兩個大小亞基組成，B?ER E等[15]從酵母中發(fā)現(xiàn)了由四個相同亞基形成320 kDa的四聚體單寧酶。細菌單寧酶多為分子質量相對較?。?1～90 kDa）的單體[11-13，16]，但ROY S等[17]從鏈霉菌AL1L中發(fā)現(xiàn)的單體單寧酶分子質量較大（180 kDa）。真菌單寧酶均為糖蛋白，但細菌單寧酶未發(fā)現(xiàn)這種翻譯后修飾[11]，故真菌單寧酶分子質量較細菌單寧酶偏大。

2.2 穩(wěn)定性

微生物源單寧酶的最適溫度為30～40 ℃，30～60 ℃內(nèi)熱穩(wěn)定性良好，但近年來一些嗜冷和嗜熱單寧酶也相繼被報道。KASIECZKA-BURNECKA M等[18]從南極輪枝孢屬菌株中分離、鑒定到兩種嗜冷單寧酶TAH1和TAH2，其最適溫度分別為20 ℃和25 ℃；SABU A等[19]研究發(fā)現(xiàn)，多變擬青霉源單寧酶的最大酶活溫度為60 ℃，這些發(fā)現(xiàn)拓展了微生物源單寧酶的應用范圍，為單寧酶在廢水等高溫環(huán)境中的應用提供了可能。多數(shù)微生物源單寧酶的最適pH值為4.0～6.5，在pH 3.0～8.0之間穩(wěn)定[13，15，16]，但植物乳桿菌ATCC 14917T來源的單寧酶最適pH為8.0，且在pH為9.0時仍然保持88%的生物活性[11]，這將拓展單寧酶在堿性環(huán)境中的應用。

2.3 活性

單寧酶一般不需要重金屬類輔助因子，但重金屬能夠普遍抑制單寧酶的活性。B?ER E等[15]報道了Hg2+和Cd2+是酵母單寧酶的抑制劑，但Mg2+對大多單寧酶具有較好的促進作用[13，16，18]，同時Mg2+卻能夠抑制黑曲霉ATTC 16620[19]、植物乳桿菌CECT 748T[20]來源的單寧酶活性。

有機溶劑能夠普遍抑制單寧酶的活性，BENIWAL V等[16]報道了沒食子酸酯對陰溝腸桿菌單寧酶活性的抑制作用，但JANA A等[13]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌源單寧酶在甲醇、乙醇和丙三醇存在時酶活得到大幅提高，這有助于單寧酶催化沒食子酸和多種醇類在有機介質中通過酯化反應合成沒食子酸酯。

表面活性劑通過與蛋白質分子的直接作用影響酶的催化活性，并減少疏水作用，從而有助于維持單寧酶的三級結構的穩(wěn)定，對底物和酶在有機溶劑中的溶解度起著重要作用。1%的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）對枯草芽孢桿菌源單寧酶活性具有促進作用，而吐溫60、吐溫80和Triton X-100具有明顯的抑制作用[13]；吐溫20能夠抑制輪枝孢屬[18]和陰溝腸桿菌[16]源單寧酶的活性；SDS、吐溫60和吐溫80能夠完全抑制青霉菌源單寧酶的活性[21]；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）強烈抑制了輪枝孢屬源單寧酶的活性[18]，不同的表面活性劑對不同的微生物源單寧酶活性表現(xiàn)各異。

上述研究表明，金屬離子、有機溶劑和表面活性劑對不同微生物來源的單寧酶活性的影響各不相同，這可能是不同來源的單寧酶三級結構的差異所致，這些研究為工業(yè)上提升單寧酶的活性提供了可靠的基礎數(shù)據(jù)。

3 微生物源單寧酶的蛋白序列特征

盡管許多微生物通過各種分析被鑒定為具有單寧酶活性，但在最近幾年才開始陸續(xù)研究單寧酶的蛋白質序列，為單寧酶的異源表達重組生產(chǎn)提供了理論基礎。AMRITAB等[22]從美國國家生物信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中檢索了149株細菌和36株真菌的單寧酶蛋白序列，其中只有77個細菌單寧酶和31個真菌單寧酶序列具有不同的氨基酸組成，對這些序列進行了生物信息學分析，如理化性質、超家族搜索、多序列比對、系統(tǒng)發(fā)育樹構建和基序發(fā)現(xiàn)等。這些單寧酶存在多種超家族，一些細菌和真菌的序列與不同的超家族有相似性。單寧酶蛋白序列的多重序列比對顯示，在不同的序列上有保守區(qū)域，氨基酸殘基389～469和482～523之間具有最大同源性，可用于設計單寧酶產(chǎn)生菌和真菌特有的簡并引物或探針。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示了兩個不同的類群，一個只有細菌，另一個既有真菌又有細菌，顯示了這些不同屬之間的某種關系。雖然在第二簇中，幾乎所有的真菌物種都被發(fā)現(xiàn)在一個角落里，這表明真菌屬之間的序列水平相似性。14個基序的分布表明，基序1的特征氨基酸序列為29個氨基酸，即GCSTGGREALKQAQRWPHDYDGIIANNPA，在83.3%的單寧酶序列中均能觀察到，它參與了結構和酶功能。對細菌和真菌來源的單寧酶蛋白序列進行了分析，序列水平的相似性可用于設計基于簡并引物聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增的基因克隆。來自細菌和真菌的序列有著基本的關系，因為它們具有基序特性。基于單寧酶蛋白序列相似性的信息也可以用來研究細菌和真菌之間進化關系的一部分。另一方面，理化參數(shù)分析可以用來預測單寧酶的結構。

4 微生物源單寧酶的作用機制

IIBUCHI S等[23]研究了米曲霉單寧酶的水解途徑、抑制作用和底物特異性。研究顯示，單寧酶可催化水解單寧中的葡萄糖沒食子酸酯生成沒食子酸和葡萄糖，水解中間產(chǎn)物有1,2,3,4,6-黃棓酰單寧、2,3,4,6-四棓酰單寧及兩種單體沒食子酸葡萄糖，單寧水解反應途徑如圖1所示。

由圖1可知，單寧酶由酯酶和縮酚羧酶混合物組成，以酯酶為主，分別具有酯鍵和間雙沒食子酸鍵的特異性，因此單寧酶可水解單寧中的酯鍵（醇基的沒食子酰酯）和縮酚羧鍵（沒食子酸的沒食子酰酯）。含有酚羥基的底物類似物，無論其是否含有羧基，均可競爭性抑制單寧酶的活性，而不含酚羥基的底物類似物不抑制單寧酶的活性，即單寧酶只對某些酚羥基底物起作用。由此可見，單寧酶對底物是否具有催化作用取決于酶-底物復合物（enzyme-substrate compound，ES）的形成。ES的形成有以下三個特點：（1）組成底物酯、醇的結構沒有限制，但酸必須是沒食子酸；（2）任何酚羥基都可能與酶的結合位點發(fā)生反應，抑制形成真正的ES復合物；（3）由于酯鍵或羧基化合物沒有被水解或抑制酶活性，酯鍵、羧基本身與酶不結合，除非它含有酚羥基。

圖1 單寧水解的反應途徑Fig.1 Reaction pathway of tannin hydrolysis

REN B等[24-25]成功解析了植物乳桿菌單寧酶的晶體結構（圖2），研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌單寧酶主要由一個保守的α/β水解酶折疊和一個插入水解酶折疊末端的cap結構域組成。α/β水解酶由18個α螺旋和13個β折疊組成，水解酶折疊結構域是由Ser163、Asp419和His 451組成的催化三聯(lián)體。在該結構中，有一個五肽活性位點基序，絲氨酸位于五肽序列基序中心，即Gly161-X-Ser163-X-Gly165（X=任何氨基酸殘基），屬于典型的絲氨酸水解酶，而cap結構域是參與底物結合的結構特征。在沒食子酸的結合過程中，沒食子酸的羧基與酶的催化三聯(lián)體形成氫鍵相互作用，而沒食子酸的三個羥基則與Asp421、Lys343和Glu357形成另一個氫鍵網(wǎng)絡。突變研究表明，催化三聯(lián)體和與沒食子酸羥基相互作用的三個殘基對與單寧酶活性是必不可少的，每一個殘基的定點突變都導致單寧酶活性幾乎完全喪失。前文提到的重金屬離子Hg2+和Cd2+抑制單寧酶活性，也是由于單寧酶的催化三聯(lián)體被破壞所致。

根據(jù)單寧酶的晶體結構，REN B等[24]提出了單寧酶催化單寧底物水解的機理。當?shù)孜锝Y合時，Ser163的羥基對沒食子酸單元的羰基發(fā)起親核攻擊，His451起協(xié)助作用，形成四面體中間體，該中間體通過與Gly77和Gly164的相互作用形成氫鍵來保持穩(wěn)定。在His451-H作為一種普通酸時，四面體中間體將分解形成醇產(chǎn)物和?；?酶中間體。隨后水分子被His451激活，攻擊?；?，形成第二個四面體中間體，該中間體分解釋放沒食子酸并使酶再生，His451通過與Asp419和Cys204相互作用形成氫鍵來保持穩(wěn)定。單寧酶結構的解析為進一步揭示單寧酶與底物的作用機制、修飾單寧酶以滿足多方面的應用提供了重要的分子理論基礎。

圖2 植物乳桿菌單寧酶的結構[24,25]Fig.2 Structure of tannase from Lactobacillus plantarum

5 微生物源單寧酶的應用

單寧酶具有較好的生物活性，已經(jīng)被廣泛應用于各行各業(yè)中，該文將從食品、飼料、制革、精細化工業(yè)等方面探究單寧酶的實際應用價值。

5.1 食品工業(yè)

單寧酶主要被用于速溶茶、葡萄酒和果汁等產(chǎn)品的處理，這將有助于提升高單寧產(chǎn)品的品質。茶膏的形成增大了茶葉加工中的渾濁度，單寧酶處理后可改善茶飲料冷后渾現(xiàn)象[26]，減少速溶茶中茶膏的形成[27]，提高茶飲料的澄清度[28]，還可以增加多酚類物質在冷飲中的溶解度[29]，改善色澤、脂肪含量和抗氧化性能等[30]。山楂汁[31]、芒果汁[32]、柿子汁[33]等高單寧果汁在儲存時容易形成苦澀味，單寧酶處理后能夠顯著降低果汁的苦澀度，提升果汁的口感及品質[34]。葡萄酒釀制過程中加入單寧酶可水解橡木桶中析出的單寧，使葡萄酒具有濃郁的芳香和誘人的色澤，可大幅降低葡萄酒的苦澀味，提高葡萄酒的品質及經(jīng)濟價值[35]。此外，DE QUEIRóS L D等[36]首次利用單寧酶來增加豆?jié){中異構體的含量從而提升其抗氧化活性，ROBERTO B S等[37]將固定化的單寧酶用來增加茶的抗肥胖和降血糖活性，單寧酶在食品工業(yè)上的應用越來越廣泛。

5.2 飼料工業(yè)

研究表明高水平的膳食單寧對動物營養(yǎng)具有不良影響，單寧能與蛋白質、淀粉、纖維素、礦物質等形成牢固的復合物，可降低動物的攝食量、降低蛋白質消化率、抑制消化酶活性或直接引發(fā)全身毒性，對反芻動物具有毒性或抗營養(yǎng)等作用，嚴重影響家畜的生產(chǎn)效率及品質[38]。然而，單寧廣泛存在于自然界的飼料和牧草中，如樹葉、農(nóng)副產(chǎn)品、農(nóng)業(yè)廢棄物等，經(jīng)單寧酶處理后的飼料，其單寧含量顯著降低[39]、營養(yǎng)成分得到改善[40]、適口性和消化吸收率得到提高[41]，從而提高畜牧養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟效益[42]。

5.3 制革工業(yè)

動物皮革制作過程中通常會產(chǎn)生大量高單寧廢水，對周圍的植物、動物和微生物具有較強的毒害作用，如何消除制革廢水中大量的單寧是擺在生態(tài)環(huán)境保護面前的重大問題。傳統(tǒng)的生物氧化法、混凝法或活性炭吸附法等容易造成單寧的相轉移[43]，不能有效的去除廢水中大量的單寧，無法實現(xiàn)廢水資源的循環(huán)再利用。近年來，微生物源單寧酶被廣泛應用于制革廢水的無害化處理過程中[44]，SHARMA S等[21]使用黑曲霉和可變青霉單寧酶處理制革洗脫液可使單寧含量分別降低45%和36%。

5.4 精細化工業(yè)

沒食子酸和沒食子酸丙酯是重要的抗菌、抗病毒、抗腫瘤等生物活性物質[45]，是重要的高附加值產(chǎn)品。目前，沒食子酸和沒食子酸丙酯的大規(guī)模生產(chǎn)主要采用化學法，高溫、高壓、強酸的生產(chǎn)環(huán)境，不僅耗能較高，且容易造成嚴重的工業(yè)“三廢”污染，急需高效、清潔、環(huán)境友好型的沒食子酸和沒食子酸丙酯生產(chǎn)工藝。單寧酶可催化可水解的單寧（主要是單寧酸）水解形成沒食子酸，同時可通過單寧酸的酯交換反應和沒食子酸與各種醇在有機介質中的酯化反應來合成沒食子酸酯。酶水解法生產(chǎn)沒食子酸和沒食子酸丙酯可以在溫和的條件下進行，并且形成的工藝副產(chǎn)物較少，單寧酶是沒食子酸和沒食子酸丙酯[43]生產(chǎn)的重要基礎。目前使用單寧酶催化合成沒食子酸丙酯是在有機介質中進行的，但是一些有機溶劑對人體有很高的毒性。因此，尋求更安全、高效的非水介質，提高底物轉化率，對今后研究酶法合成沒食子酸酯具有重要意義。

6 展望

單寧結構復雜，應用行業(yè)環(huán)境不同，需要可以適應不同底物、溫度、pH值、金屬離子、表面活性劑和有機溶劑的單寧酶。但目前，微生物源單寧酶主要來源于可培養(yǎng)微生物，而絕大部分的微生物都是不可培養(yǎng)的，急需采用宏基因組學方法挖掘更多尚未被發(fā)現(xiàn)的單寧酶基因，增加單寧酶的來源。同時，較高的工業(yè)生產(chǎn)成本限制了單寧酶的大規(guī)模應用，急需采用合成生物學、酶的定向突變等技術構建功能強大的單寧酶高產(chǎn)基因工程菌，降低單寧酶的使用成本，提高其工業(yè)化應用產(chǎn)出比。筆者目前擬使用定點突變技術構建高效分泌表達單寧酶的工程菌，以期建立基于酶法的五倍子單寧生產(chǎn)沒食子酸的綠色工藝，促進產(chǎn)業(yè)的高效可持續(xù)發(fā)展。