孫細(xì)珍，左可成，唐娟,2，熊亞青,2，樂細(xì)選，杜佳煒,2，錢全全，陳雅慧，楊強(qiáng)

1(勁牌有限公司，湖北 黃石，435100)2(中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗室，湖北 黃石，435100)

小曲清香型白酒是指以糧谷為原料，以小曲作糖化發(fā)酵劑釀制的白酒，是中國白酒的主要酒種之一[1]，廣泛分布于四川、重慶、貴州、云南、湖北等地[2]。小曲清香型白酒具有歷史文化悠久，用曲量少、發(fā)酵周期短、貯存時間短、出酒率高等特點(diǎn)[3]，且因其酒體醇甜柔和、清香純正的獨(dú)特風(fēng)味長期以來受到消費(fèi)者的喜愛。

在酒精飲料的釀造過程中，因發(fā)酵條件控制不當(dāng)、工藝操作及管理不善、各種工作用具及生產(chǎn)場所不潔都可能會導(dǎo)致異嗅味物質(zhì)的產(chǎn)生[4]。異嗅味物質(zhì)會造成酒體的口味、香氣的不協(xié)調(diào)，對產(chǎn)品質(zhì)量有重要影響，當(dāng)前國內(nèi)外對酒精飲料中的異嗅味開展了較多研究。KINZURIK等[5]采用頂空固相微萃取(head space-solid phase microextraction，HS-SPME)結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜解析出引起葡萄酒產(chǎn)生煮熟的洋蔥和蔬菜味的化合物為乙硫醇、硫代乙酸乙酯和二乙基二硫；徐巖等[6]確認(rèn)濃香型白酒產(chǎn)生窖泥臭的化合物是4-甲基苯酚，該物質(zhì)感官描述為窖泥臭、皮革臭、焦皮臭、動物臭；王露露[7]采用氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜(gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS)技術(shù)結(jié)合香氣活力值(odor activity value,OAV)，從“鹽菜味”異嗅樣品和正常樣品中篩選出23種含量差異顯著的重要香氣化合物；進(jìn)一步通過化學(xué)計量法結(jié)合香氣添加、缺失實(shí)驗，發(fā)現(xiàn)2-甲基-3-呋喃硫醇、糠硫醇等“量微香大”的含硫化合物含量失調(diào)是造成醬香型白酒“鹽菜味”缺陷的關(guān)鍵因素。目前國內(nèi)外對小曲清香型白酒異嗅味物質(zhì)研究少見報道，醛異味是小曲清香型白酒極為常見的風(fēng)格缺陷，感官描述為類似青草、過熟水果、酸的以及脂肪臭的令人不愉快的復(fù)合氣味，嚴(yán)重影響小曲清香型白酒的風(fēng)味與品質(zhì)。因此，明晰小曲清香型白酒中醛異味物質(zhì)，對更好地控制與提升其風(fēng)味品質(zhì)具有重要意義。

本實(shí)驗以醛異味和正常的小曲清香型白酒為研究對象，基于感官分析，采用GC-O-MS、HS-SPME/GC-MS技術(shù)對2種樣品的揮發(fā)性成分進(jìn)行比較，通過香氣強(qiáng)度與OAV鑒定2組樣品在重要風(fēng)味物質(zhì)上的差異性；進(jìn)一步采用偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA)方法對2組樣品進(jìn)行判別分析，明確醛異味樣品和正常樣品間的顯著差異性香氣成分，為生產(chǎn)工藝的改進(jìn)提供數(shù)據(jù)支持與優(yōu)化方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小曲清香型白酒試驗樣品，共19批；其中1批為標(biāo)準(zhǔn)樣品(編號為SS-1)，供感官分析時參比用；另外18批供本試驗研究用，全部由勁牌有限公司(中國湖北)提供。

本研究所用標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純，購于上海安譜實(shí)驗科技股份有限公司；所用化學(xué)試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所用水均為超純水，為本實(shí)驗室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

AB135-S十萬分之一電子分析天平，美國Mettler-Toledo公司；FA2004萬分之一天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；DC12H氮吹儀，上海安譜科技有限公司；7890B-5977C氣質(zhì)聯(lián)用儀、8890氣相色譜儀(配氫火焰離子化檢測器，GC-FID)、DB-FFAP毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)、CP-WAX色譜柱(50 m×0.25 mm×0.2 μm)、HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國Agilent科技有限公司；嗅聞儀(ODP 4，Gerstel GmbH & Co.KG, Mülheim, Germany)、MPS 2多功能樣品前處理平臺，德國Gerstel公司；DVB/CAR/PDMS萃取頭(50/30 μm)，美國Supelco公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 感官評價與樣品分級

小曲清香型白酒的感官評價和樣品分級由勁牌公司10名專業(yè)評酒委員組成感官評價小組(其中國家級評酒委員5人、省級評酒委員5人)，在感官描述分析中均具有長期經(jīng)驗。參考文獻(xiàn)[8-9]和EN ISO 8589《感官分析 試驗室設(shè)計的一般指南》、GB/T 10345—2007，就醛異味對小曲清香型白酒與標(biāo)準(zhǔn)樣品SS-1(醛味強(qiáng)度為2)進(jìn)行對比討論。小組成員在3點(diǎn)強(qiáng)度等級上以隨機(jī)順序?qū)悠返娜┊愇哆M(jìn)行評級(1=低，2=中等，3=強(qiáng))，強(qiáng)度>2的樣品分為醛異味樣品，強(qiáng)度≤2的樣品分為正常樣。

1.3.2 液液萃取(liquid-liquid extraction, LLE)分析

參考文獻(xiàn)[10]方法稍做改進(jìn)，采用LLE方法提取小曲清香型白酒O-1和N-1樣品的香氣物質(zhì)。取100 mL樣品用超純水稀釋至體積分?jǐn)?shù)為10%，加入氯化鈉至飽和，再加入二氯甲烷進(jìn)行提取(提取3次，每次70 mL)，合并有機(jī)相，加入無水Na2SO4在4 ℃下過夜脫水，過濾后的提取液在40 ℃下氮吹濃縮至約2 mL，所得濃縮液用于GC-MS及GC-O分析。

1.3.3 GC-MS和GC-O分析

LLE提取液分別經(jīng)HP-5MS和DB-FFAP色譜柱進(jìn)行GC-O-MS分析。

氣相色譜條件：DB-FFAP色譜柱的升溫程序為初溫50 ℃，以3.5 ℃/min升至220 ℃，保持10 min，再以15 ℃/min升至250 ℃；HP-5MS色譜柱的升溫程序為初溫50 ℃，保持5 min，以3.5 ℃/min升至180 ℃，以30 ℃/min升至320 ℃，保持10 min；載氣為高純氦氣，流速為1 mL/min，進(jìn)樣口溫度為280 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子轟擊源能量為70 eV；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；輔助通道加熱溫度280 ℃；全掃描模式及特征離子掃描模式，掃描質(zhì)量35～350 u。

GC-O條件：在配有ODP4嗅聞儀的GC-MS上進(jìn)行，樣品經(jīng)DB-FFAP色譜柱分離后按照1∶1的分流比流入嗅聞儀及GC-MS；嗅聞儀傳輸線溫度為250 ℃，嗅聞口溫度為200 ℃，加濕器流速50 mL/min。3名評價人員(1名男性和2名女性)進(jìn)行GC-O分析，分析過程中將鼻子置于嗅聞口前，記錄色譜流出物保留時間、香氣特性和香氣強(qiáng)度。每個評價人員重復(fù)分析2次，最終結(jié)果以3個評價人員平均值計。在進(jìn)行GC-O分析前，評價人員要對標(biāo)準(zhǔn)品(濃度高于其在空氣、水中的嗅覺閾值)進(jìn)行反復(fù)嗅聞，并經(jīng)過長達(dá)3個月的GC-O嗅聞訓(xùn)練。

1.3.4 定性分析

香氣化合物采用NIST14譜庫檢索進(jìn)行初步定性；將樣品、標(biāo)樣和C5～C30正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品在同樣GC-MS分析條件進(jìn)行分析，根據(jù)待測物質(zhì)的保留時間，計算保留指數(shù)(retention index, RI)對物質(zhì)進(jìn)行鑒定，RI計算如公式(1)所示：

(1)

式中：RI為保留指數(shù)；n為正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)；Rt(n+1)、Rt(n)分別代表碳數(shù)為n+1、n的正構(gòu)烷烴的保留時間，min；Rt(x)為被測組分保留時間，min，且Rt(n+1)>Rt(x)>Rt(n)。

1.3.5 定量分析

對GC-O分析中香氣強(qiáng)度≥2的香氣物質(zhì)采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用無水乙醇配制成標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液逐級稀釋成7個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，向其中加入適量內(nèi)標(biāo)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中異戊醇、乙酸乙酯、乙縮醛等物質(zhì)采用GC-FID定量分析；辛酸乙酯、癸酸乙酯、戊酸乙酯等物質(zhì)采用HS-SPME進(jìn)行定量分析。定量標(biāo)準(zhǔn)品的線性范圍最低濃度必須保證其色譜圖信噪比≥10。所有樣品重復(fù)測定3次。

1.3.5.1 GC-FID分析條件

白酒中的常量揮發(fā)性物質(zhì)通過GC-FID直接進(jìn)樣分析，準(zhǔn)確吸取1.0 mL樣品于樣品瓶中，加入10.0 μL內(nèi)標(biāo)溶液(IS1：叔戊醇，18 000 mg/L；IS2：乙酸正戊酯，15 000 mg/L；IS3-1：2-乙基己醇，12 000 mg/L)，混合均勻后直接進(jìn)樣供氣相色譜分析。氣相色譜條件：CP-WAX色譜柱，升溫程序：初溫35 ℃，保持1 min，以3 ℃/min升到70 ℃，以3.5 ℃/min升到190 ℃，保持22 min；載氣為高純氮?dú)?，恒流模式，流速? mL/min，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度為260 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，分流進(jìn)樣，分流比為30∶1。所有樣品重復(fù)測定3次。

1.3.5.2 HS-SPME分析條件

參考文獻(xiàn)[9]方法稍做改進(jìn)，將待測樣品用超純水稀釋至體積分?jǐn)?shù)10%，取8 mL稀釋液于20 mL頂空瓶中并加氯化鈉至飽和，加入10.0 μL內(nèi)標(biāo)溶液(IS3-2：2-乙基己醇，100 mg/L；IS4：2-辛醇，100 mg/L),充分混合并在50 ℃下孵育5 min以達(dá)到平衡，將老化(250 ℃下老化30 min)后的固相微萃取纖維頭插入頂空瓶中并萃取45 min，定期振動(每振動10 s后停止2 s)，萃取結(jié)束后將纖維頭插入GC-MS進(jìn)樣口，在250 ℃下解吸5 min，在DB-FFAP色譜柱中采用1.3.3 中儀器條件進(jìn)行HS-SPME/GC-MS分析。通過空白試驗和加標(biāo)試驗考察基質(zhì)效應(yīng)，所有樣品重復(fù)測定3次。

1.3.6 OAV計算

各物質(zhì)的OAV等于其濃度與閾值的比值，此研究中化合物閾值Ti主要參考文獻(xiàn)。一般認(rèn)為，當(dāng)OAV<1時，說明該物質(zhì)對樣品總體氣味貢獻(xiàn)不明顯；當(dāng)OAV≥1時，說明該物質(zhì)對樣品總體氣味有明顯貢獻(xiàn)，OAV越大說明該物質(zhì)對樣品總體氣味的貢獻(xiàn)程度越大。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應(yīng)用SPSS 22.0對不同樣本之間的最小顯著差異進(jìn)行單因素分析，α≤0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異；使用Origin 8.6對數(shù)據(jù)進(jìn)行說明；使用Umetrics公司SIMCA 13.0軟件進(jìn)行主成分分析(principal component analysis, PCA)和OPLS-DA，進(jìn)一步對正常樣品和醛異味樣品的定量結(jié)果進(jìn)行差異性分析，篩選出顯著性差異化合物。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官分析結(jié)果

感官分析小組在專業(yè)品酒室(恒溫20 ℃)嗅聞酒樣，綜合各評價成員的分析結(jié)果，并經(jīng)討論后從18個供試驗樣品中篩選出11個正常樣品(用JPXQLN表示，設(shè)為組N，編號為N-1～N-11)、7個醛異味樣品(用JPXQLO表示，設(shè)為組O，編號為O-1～O-7)。

2.2 定性分析

香氣化合物的鑒定是通過RI、香氣描述以及MS庫的比對，最后通過標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行確認(rèn)。在小曲清香型白酒中鑒定出香氣強(qiáng)度≥2的香氣物質(zhì)共61種(表1)，包括9種脂肪酸、26種酯類、1種內(nèi)酯、12種醇類、7種醛類、1種縮醛類、3種酮類和2種酚類。其中脂肪酸化合物主要呈現(xiàn)酸臭、汗臭和窖泥臭等；酯類化合物呈現(xiàn)花香和水果香；醇類物質(zhì)主要呈青草香、花香，而烯醇的風(fēng)味則呈青草、塵土風(fēng)味；醛類化合物呈現(xiàn)堅果香和花果香。對比醛異味和正常小曲清香型白酒樣品，發(fā)現(xiàn)上述61種香氣物質(zhì)均同時存在，其中55種香氣物質(zhì)在2種白酒樣品中香氣強(qiáng)度值基本相同，醛異味樣品中丁酸、乙醛、正丙醇和乙縮醛香氣強(qiáng)度值高于正常樣品，戊酸乙酯、己酸乙酯香氣強(qiáng)度值則低于正常樣品。

表1 醛異味和正常小曲清香型白酒的揮發(fā)性成分鑒定結(jié)果Table 1 Results of volatile compounds in JPXQLO and JPXQLN

2.3 定量結(jié)果

為了進(jìn)一步明確醛異味和正常樣品中揮發(fā)性成分的差異性，本研究采用GC-FID結(jié)合HS-SPME/GC-MS方法對定性出的61種風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了定量分析，所定量的風(fēng)味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，R2均在0.990以上，定量參數(shù)信息及定量結(jié)果見表2。

續(xù)表2

從表2可知醛異味樣品中OAV≥1的化合物有32種，正常樣品中OAV≥1的化合物有31種，在乙縮醛、乙醛、正丙醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯上醛異味樣品的OAV高于正常樣品，而在丁酸乙酯、己酸乙酯、戊酸乙酯等酯類物質(zhì)上醛異味樣品的OAV低于正常樣品，這與2.2中的GC-O分析結(jié)果接近，表明醛異味樣品與正常樣品間的差異主要來源于揮發(fā)性物質(zhì)的含量與比例關(guān)系。

2.4 香氣化合物的判別分析

小曲清香型白酒組成中98%是乙醇和水，另外2%的微量成分種類繁多復(fù)雜并存在交互作用，決定著小曲清香型白酒的風(fēng)味與質(zhì)量，因此很難通過簡單的數(shù)據(jù)分析獲得有效的變量，為有效區(qū)分醛異味樣和正常小曲清香型白酒，明確引起醛異味的來源，本研究采用多元統(tǒng)計方法對兩者進(jìn)行分析。多元統(tǒng)計分析手段能夠在多個對象和多個指標(biāo)互相關(guān)聯(lián)的情況下分析目標(biāo)樣品的統(tǒng)計規(guī)律，因此被廣泛運(yùn)用于食品科學(xué)領(lǐng)域。其中 PCA是常見的統(tǒng)計學(xué)分析手段，在酒類、茶葉、食品工藝等領(lǐng)域的判別分析上有廣泛應(yīng)用[22]。

OPLS-DA變量重要性因子(variable importance in the projection，VIP)可以量化每個變量對分類的貢獻(xiàn)，VIP值越大，變量在不同類別間差異越顯著，當(dāng)VIP值>1時，可界定對應(yīng)的變量為該判別模型的關(guān)鍵變量[24]。本研究所建立的OPLS-DA模型中，VIP值>1的化合物共有13種，它們分別是乙醛(VIP=1.96)，過量的乙醛產(chǎn)生青香、青草、爛熟的蘋果香等異嗅，在醛異味的小曲清香型白酒中含量明顯高于正常樣；乙縮醛(VIP=1.79)，呈青水果、黃油氣味；正丙醇(VIP=1.07)，具有醇香和成熟水果香、青草氣味；乙酸(VIP=1.07)，呈酸的、醋、刺激性和不愉快的氣味；糠醛(VIP=1.79)是最重要的呋喃類化合物之一，呈甜香、焙烤香；丙酸(VIP=1.16)，呈現(xiàn)明顯的酸或醋氣味以及干酪、腐等刺激性氣味；3-羥基-2-丁酮(VIP=1.04)、丁酸(VIP=1.08)，有腐臭、干酪、汗臭、酸臭、窖泥臭；異戊酸(VIP=1.70)，呈現(xiàn)酸、干酪、汗臭、腐敗氣味；辛酸(VIP=1.45)，有似山羊臭、干酪、脂肪臭、油脂臭等不愉快的氣味；異丁醛(VIP=1.14)，呈青香或青草、麥芽香等；乙酸丁酯(VIP=1.84)，呈青草、漿果、甜香、水果氣味；辛酸乙酯(VIP=1.45)，呈水果、甜香、梨氣味；它們是小曲清香型白酒正常樣和醛異味樣之間的顯著性差異化合物，其中OAV≥1的化合物有乙縮醛、乙醛、正丙醇、乙酸、丁酸、辛酸乙酯、異戊酸、異丁醛、丙酸，在醛異味和正常樣品中這9種化合物的OAV對比分析如圖2所示。

a-PCA模型；b-OPLS-DA模型圖1 醛異味和正常小曲清香型白酒風(fēng)味物質(zhì)PCA和OPLS-DA得分圖Fig.1 PCA and OPLS-DA scores of aroma compounds in JPXQLO and JPXQLN

從圖2可知，在9種OAV≥1的顯著差異性化合物中，乙縮醛、乙醛、正丙醇具有最大的OAV，結(jié)合它們的氣味特征進(jìn)行分析，可知過量的乙縮醛、乙醛、正丙醇主要表現(xiàn)為青草、過熟的水果氣味，過量的脂肪酸呈現(xiàn)酸的、腐臭、脂肪臭氣味，綜合起來對小曲清香型白酒產(chǎn)生醛異味具有重要影響，主要表現(xiàn)為類似青草、過熟水果、酸的以及脂肪臭的令人不愉快的復(fù)合氣味，辛酸乙酯主要呈現(xiàn)水果香、甜香，對小曲清香型白酒產(chǎn)生醛異味關(guān)聯(lián)性不大，后期將通過重構(gòu)試驗和添加試驗對它們進(jìn)一步驗證。

圖2 醛異味和正常小曲清香型白酒中差異性風(fēng)味物質(zhì)OAV對比圖Fig.2 Comparison of OAV between JPXQLO and JPXQLN

3 結(jié)論

本實(shí)驗采用LLE方法提取小曲清香型白酒的揮發(fā)性物質(zhì)，經(jīng)GC-O-MS技術(shù)進(jìn)行定性分析，鑒定出61種香氣強(qiáng)度大于2的香氣化合物；進(jìn)一步采用HS-SPME/GC-MS以及GC-FID技術(shù)進(jìn)行定量分析并計算OAV。結(jié)果表明，小曲清香型白酒正常樣和醛異味樣品之間的香氣組分種類一致，但是共有香氣物質(zhì)的含量存在差異；進(jìn)一步采用基于香氣成分絕對含量的OPLS-DA模型將醛異味樣品和正常樣品成功區(qū)分，并鑒定出OAV≥1且VIP≥1的化合物共9種，為乙縮醛、乙醛、正丙醇、乙酸、丁酸、辛酸乙酯、異戊酸、異丁醛、丙酸。過量的乙縮醛、乙醛、正丙醇主要表現(xiàn)為青草、過熟的水果氣味，過量的脂肪酸呈現(xiàn)酸的、腐臭、脂肪臭氣味，綜合起來主要表現(xiàn)為類似青草、過熟水果、酸的以及脂肪臭的令人不愉快的復(fù)合氣味，這些化合物的含量與比例關(guān)系對小曲清香型白酒產(chǎn)生醛異味具有重要影響。本研究為調(diào)控生產(chǎn)工藝，協(xié)調(diào)小曲清香型白酒的香氣，提高小曲清香型白酒的酒質(zhì)提供了數(shù)據(jù)指導(dǎo)，也為分析中國白酒異雜味物質(zhì)來源提供了理論依據(jù)與技術(shù)思路。