吳力亞，吳天祥，汪玲

1(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽，550025)2(貴州食品工程職業(yè)學(xué)院，貴州 貴陽，550025)

灰樹花(Grifolafrondosa)是一種名貴的藥食用真菌，以子實(shí)體或菌絲體作為食用部分，具有多種活性功能[1-2]，如抗氧化[3]、降血糖[4]、降血脂、抗腫瘤[5]、清除重金屬[6]，并且含有較為豐富的生物活性物質(zhì)，如灰樹花多糖、多酚、甾醇類、萜類等活性成分[2,7]。傳統(tǒng)灰樹花固態(tài)培養(yǎng)主要是利用木屑、稻草以及農(nóng)作物副產(chǎn)品作為生長(zhǎng)基質(zhì)，灰樹花采收后，菌糠則被丟棄，造成很大的資源浪費(fèi)及環(huán)境污染。開發(fā)一種新型的灰樹花生長(zhǎng)基質(zhì)，并完全利用其發(fā)酵基質(zhì),具有很高的研究?jī)r(jià)值[8]。本研究通過前期的實(shí)驗(yàn)將已優(yōu)化的苦蕎、薏仁米等各種基質(zhì)的比例作為灰樹花發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?？嗍w作為西南地區(qū)一種藥食同源谷物,富含黃酮類物質(zhì)，其蘆丁含量極高[9-10]，薏仁米富含薏仁酯、薏仁素和豐富的淀粉物質(zhì)[11-12]，兩者可以作為灰樹花發(fā)酵基質(zhì)，為灰樹花的生長(zhǎng)提供碳氮源。

天麻(Rhizomagastrodiae)是一種名貴中藥[2,13]，富含天麻素(p-hydroxymethylphenyl-β-D-glucopyranoside，GA)、對(duì)羥基苯甲醇(p-hydroxybenzyl alcohol，HA)、對(duì)羥基苯甲醛(p-hydroxylbenzaldehyde，HBA)、巴利森苷(parishin)，具有很高的藥理功效[14-15]。課題組前期試驗(yàn)驗(yàn)證了添加一定比例的天麻提取物參與灰樹花液態(tài)深層發(fā)酵能夠顯著地促進(jìn)灰樹花胞外多糖的分泌及生物量的增加以及分解利用天麻成分進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化[16-20]。本研究將中藥天麻以不同比例的添加量參與灰樹花的固態(tài)發(fā)酵，旨在進(jìn)一步豐富和拓展中藥資源與食用菌共發(fā)酵以及兩者之間相互影響、生物轉(zhuǎn)化的研究前景以及中藥菌質(zhì)產(chǎn)品的食藥價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰樹花(菌種編號(hào)5404)，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；天麻，貴州大方；苦蕎，貴州威寧；薏仁米，貴州興仁；GA對(duì)照品、HA對(duì)照品、HBA對(duì)照品、巴利森苷對(duì)照品、蘆丁對(duì)照品、異槲皮苷對(duì)照品，北京索萊寶生物科技有限公司；Al(NO3)3、NaNO2，上海阿拉丁試劑有限公司；其余試劑均為市售分析純；斜面培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

BXM-30R型立式滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1D型凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；TGL-20M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司；CTFD-12S型真空冷凍干燥機(jī)，青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀及檢測(cè)器、Agilent 5TC-C18型色譜柱，美國(guó)Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 灰樹花固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配制流程

灰樹花固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配制流程如圖1所示。

圖1 灰樹花固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配制流程圖Fig.1 Flow chart of preparation of Grifola frondosa solid fermentation medium

1.3.2 灰樹花菌種培養(yǎng)方法

1.3.2.1 斜面種子培養(yǎng)

從母種試管中挑取黃豆粒大小菌絲塊接種于PDA培養(yǎng)皿中部，25 ℃恒溫培養(yǎng)，至菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)斜面，轉(zhuǎn)置4 ℃保存。

1.3.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)

培養(yǎng)基成分組成：苦蕎粉4.5 g；苦蕎皮1.5 g；薏仁米1.5 g；麩皮0.4 g；葡萄糖0.1 g；

天麻粉：天麻烘干，超微粉碎機(jī)打碎成天麻粉，過60目篩。分別按照培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)的0%、10%、20%、30%、40%、50%加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中參與固態(tài)發(fā)酵。

將上述材料混勻加水，置于滅菌鍋中滅菌(121 ℃、30 min)，培養(yǎng)基降低到室溫，接入灰樹花菌種于培養(yǎng)基中，放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)酵12 d(25 ℃)。

1.3.3 發(fā)酵基質(zhì)的處理

發(fā)酵基質(zhì)在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d后，將其進(jìn)行真空冷凍干燥，干燥之后的發(fā)酵物超微粉碎并過80目篩，收集粉末，置于-20 ℃條件下保存，作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.4 分析方法

1.4.1 總黃酮含量的測(cè)定

精確稱取0.4 g菌粉，加入20 mL 50%的乙醇中，常溫?fù)u晃提取1 h，8 000 r/min離心10 min，取上清液，作為待測(cè)樣品溶液。采用NaNO2、Al(NO3)3顯色法測(cè)量，總黃酮含量以蘆丁當(dāng)量表示。

1.4.2 GA、HA、HBA、巴利森苷含量的測(cè)定[2]

1.4.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 5TC-C18型色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；洗脫程序：0～35 min(0%～30% B)，35～40 min(30%～100% B)，40～45 min(100%～3% B)；流動(dòng)相：0.1%的磷酸水(D)、乙腈(B)；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：221 nm；柱溫：30 ℃。

1.4.2.2 樣品溶液的配制

精確稱取0.5 g發(fā)酵粉末，加入10 mL 75%乙醇，常溫浸提12 h，8 000 r/min離心10 min，取上清液作為待測(cè)樣品溶液，按照上述HPLC條件進(jìn)行GA、HA、HBA、巴利森苷含量的測(cè)定，將各種物質(zhì)的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各種物質(zhì)的含量。

1.4.3 蘆丁、異槲皮苷含量的測(cè)定[21]

1.4.3.1 色譜條件

流動(dòng)相：0.02%的磷酸水、乙腈；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：30 ℃；等度洗脫：V(乙腈)∶V(0.02%磷酸水)=20∶80。

1.4.3.2 樣品溶液的配制

精確稱取0.5 g發(fā)酵粉末，加入10 mL甲醇，常溫浸提12 h，8 000 r/min離心10 min，取上清液作為待測(cè)樣品溶液，按照上述HPLC條件進(jìn)行蘆丁、異槲皮苷含量的測(cè)定，將各種物質(zhì)的峰面積分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各種物質(zhì)的含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有的數(shù)據(jù)使用Origin 10軟件畫圖，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示(n=3)，使用單因素方差分析(ANOVA)和配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表示數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰樹花固態(tài)發(fā)酵不同時(shí)間形態(tài)及表觀結(jié)構(gòu)的變化

圖2為灰樹花在未添加天麻培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)變化。在生長(zhǎng)7 d時(shí)，灰樹花菌絲體基本鋪滿培養(yǎng)基，且菌絲顏色亮白，聯(lián)結(jié)致密，說明灰樹花能夠在基質(zhì)上進(jìn)行正常的生長(zhǎng)，此種培養(yǎng)基未對(duì)灰樹花的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。圖3為發(fā)酵組和未發(fā)酵組在不同時(shí)間菌質(zhì)的表觀形態(tài)圖。由圖3可知，在發(fā)酵組，隨著灰樹花發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，基質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生大量細(xì)微的孔隙，在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，基質(zhì)由外到內(nèi)均產(chǎn)生了較大的孔隙，結(jié)構(gòu)近乎崩解，相比于發(fā)酵組，未發(fā)酵組基質(zhì)在0～12 d的表觀結(jié)構(gòu)形態(tài)均未發(fā)生明顯的變化，結(jié)構(gòu)均較為完整致密。對(duì)比兩者基質(zhì)的表觀結(jié)構(gòu)，說明經(jīng)灰樹花發(fā)酵，對(duì)基質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了顯著的崩解作用，通過對(duì)基質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞，使得基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更容易析出，增加了菌絲體與基質(zhì)的接觸面積，有利于菌絲體更好地吸收利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以供自身的生長(zhǎng)代謝。

圖2 不同生長(zhǎng)時(shí)間灰樹花在基質(zhì)上的菌絲體變化Fig.2 The change of mycelium of G.frondosa in the substrate at different days

圖3 發(fā)酵組和未發(fā)酵組基質(zhì)不同時(shí)間的掃描電鏡Fig.3 Scanning electron microscopy of substrates in fermented and unfermented groups at different days

2.2 不同天麻添加量對(duì)灰樹花發(fā)酵基質(zhì)總黃酮含量的影響

如圖4所示，通過相同天麻添加比例，不同接菌方式[一組為未發(fā)酵組(未接菌)，一組為發(fā)酵組(接菌)]，對(duì)比每組總黃酮含量，結(jié)果表明灰樹花在生長(zhǎng)發(fā)酵的同時(shí)能夠分解總黃酮，使得總黃酮含量明顯降低。天麻參與灰樹花固態(tài)發(fā)酵能夠一定程度的促進(jìn)灰樹花分解總黃酮，在天麻添加量分別為10%、20%、30%、40%、50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí)，相比于空白組(0%)分解總黃酮的能力分別提高了1.05、1.24、1.2、1.3和1.01倍。此結(jié)果驗(yàn)證了灰樹花能夠在以苦蕎為主要基質(zhì)的培養(yǎng)基進(jìn)行正常的生長(zhǎng)，是由于其能夠?qū)|(zhì)中富含的總黃酮類物質(zhì)進(jìn)行分解代謝提供自身的生長(zhǎng)需求。同時(shí)也驗(yàn)證了添加一定比例的天麻參與灰樹花發(fā)酵能夠一定程度的促進(jìn)其分解代謝總黃酮的能力。通過提高總黃酮類物質(zhì)的分解能力，提高大分子黃酮類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子黃酮苷類物質(zhì)，并且增加其水溶性和分子利用程度，進(jìn)而提高菌質(zhì)食藥用價(jià)值。

a-天麻添加量0%；b-天麻添加量10%；c-天麻添加量20%;d-天麻添加量30%;e-天麻添加量40%;f-天麻添加量50%圖4 不同天麻添加量對(duì)發(fā)酵基質(zhì)總黃酮含量的影響Fig.4 The effect of different proportions of R.gastrodiae on the total flavonoids content of fermentation substrate注：**示與未發(fā)酵組相比，具有顯著性差異(P<0.01)(下同)

2.3 不同天麻添加量對(duì)灰樹花發(fā)酵基質(zhì)蘆丁及異槲皮苷含量的影響

由圖4和圖5研究結(jié)果可知，以苦蕎為主要發(fā)酵基質(zhì)，灰樹花會(huì)對(duì)總黃酮類物質(zhì)進(jìn)行分解。為進(jìn)一步探究對(duì)灰樹花發(fā)酵基質(zhì)中總黃酮類物質(zhì)中具體成分含量的影響，采用HPLC對(duì)基質(zhì)中蘆丁和異槲皮苷進(jìn)行含量檢測(cè)(圖6)，結(jié)果表明在發(fā)酵12 d后，發(fā)酵基質(zhì)中蘆丁和異槲皮苷的含量均有不同程度的降低。由圖7可知，隨著天麻添加量的增加，發(fā)酵基質(zhì)中蘆丁的含量減少程度更高，相比于空白組(0%)，在天麻添加量為10%、20%、30%、40%、50%時(shí)，蘆丁含量降低量分別增加了1.37、1.70、1.03、1.13和4.0倍(P<0.01)。與空白組相比均具有極顯著性差異，說明在天麻添加量為50%時(shí)，對(duì)灰樹花分解蘆丁具有最大的促進(jìn)作用；由圖8可知，在天麻添加量為分別為20%、30%、40%、50%時(shí)，對(duì)灰樹花分解異槲皮苷具有極顯著地促進(jìn)作用，相比于空白組(0%)，對(duì)異槲皮苷的降低量分別提高了1.06、1.09、1.08和1.08倍(P<0.01)。文獻(xiàn)記載，橙皮苷酶可以將蘆丁有效地轉(zhuǎn)化為異槲皮苷[21]，在此次實(shí)驗(yàn)中，分別對(duì)同一基質(zhì)中的蘆丁和異槲皮苷物質(zhì)進(jìn)行含量測(cè)定，異槲皮苷的含量并未升高，可以排除蘆丁含量的減少是由于灰樹花分泌的橙皮苷酶將其轉(zhuǎn)化為異槲皮苷，而是灰樹花在生長(zhǎng)過程中對(duì)蘆丁進(jìn)行了分解利用。

圖5 不同天麻添加量對(duì)促進(jìn)灰樹花對(duì)總黃酮分解能力的影響Fig.5 The effect of different proportions of R.gastrodiae on the promotion of G.frondosa on the decomposition of total flavonoids

a-蘆?。籦-異槲皮苷?qǐng)D6 蘆丁和異槲皮苷的高效液相色譜圖Fig.6 High performance liquid chromatogram of rutin and isoquercitrin

圖7 不同天麻添加量對(duì)發(fā)酵基質(zhì)中蘆丁降低量的影響Fig.7 The effect of different proportions of R.gastrodiae on the reduction of rutin in fermentation substrate

圖8 不同天麻添加量對(duì)發(fā)酵基質(zhì)中異槲皮苷降低量的影響Fig.8 The effect of different proportions of R.gastrodiae on the reduction of isoquercitrin in fermentation substrate

2.4 灰樹花對(duì)不同添加量天麻主要成分的影響

微生物在生長(zhǎng)代謝的同時(shí)會(huì)向外界分泌多種胞外酶：如纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等[22-24]，分泌的胞外酶會(huì)按照各種酶的專一性選擇性地分解代謝有機(jī)物轉(zhuǎn)化為小分子。灰樹花分泌的胞外酶同樣可以作用于天麻的成分，選擇天麻所含的4種主要成分(GA、HA、HBA、巴利森苷)進(jìn)行HPLC檢測(cè)，探究灰樹花對(duì)天麻4種成分的影響。圖9為天麻4種主要成分的混標(biāo)圖,結(jié)果表明，在天麻添加量為10%～50%時(shí)，與未接種灰樹花(未發(fā)酵組)相比，接種灰樹花(發(fā)酵組)能夠幾乎完全分解GA。由表1可知，在天麻添加量為10%時(shí)，灰樹花對(duì)HA和HBA的分解最為顯著，表明高比例的天麻參與灰樹花固態(tài)發(fā)酵能夠抑制灰樹花對(duì)天麻本身對(duì)HA和HBA的分解；添加天麻都能夠提高巴利森苷的含量，其中50%天麻添加量提高其含量最為顯著。表明在天麻參與灰樹花固態(tài)發(fā)酵時(shí)，整個(gè)發(fā)酵體系存在著巴利森苷成分不同程度的生物轉(zhuǎn)化。文獻(xiàn)表明在微生物參與谷物進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，能夠改變整個(gè)發(fā)酵體系的生物活性的種類和含量，進(jìn)而提高發(fā)酵物的食藥用價(jià)值[25-26]。

圖9 GA、HA、HBA、巴利森苷的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品色譜圖Fig.9 Chromatograms of standard reference substances of GA, HA, HBA, and parishin

表1 灰樹花對(duì)不同天麻添加量基質(zhì)中天麻主要成分的影響Table 1 Influence of G.frondosa on the main components of R.gastrodiae in different dosages of R.gastrodiae

3 結(jié)論

以貴州特色藥食同源作物苦蕎、薏仁米等為主要基質(zhì)，接種灰樹花作為發(fā)酵菌種，灰樹花在此基質(zhì)上能夠正常的生長(zhǎng)代謝，灰樹花能夠有效分解利用苦蕎及薏仁米等基質(zhì)，試研發(fā)創(chuàng)新一種新的適合灰樹花菌絲體生長(zhǎng)的培養(yǎng)基質(zhì)。以不同比例的中藥天麻參與灰樹花的固態(tài)發(fā)酵，研究天麻對(duì)發(fā)酵基質(zhì)中主要活性成分含量的影響。結(jié)果表明，不同比例的天麻參與固態(tài)發(fā)酵，對(duì)灰樹花菌絲體的生長(zhǎng)沒有明顯的抑制作用，同時(shí)天麻的加入能夠不同程度地促進(jìn)灰樹花對(duì)基質(zhì)中總黃酮物質(zhì)的分解，通過提高總黃酮類物質(zhì)的分解能力，提高大分子黃酮類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子黃酮苷類物質(zhì)，并且增加其水溶性和分子利用程度，進(jìn)而提高菌質(zhì)食藥用價(jià)值，并且灰樹花也能夠?qū)μ炻樗饕煞諫A、HA、HBA等物質(zhì)進(jìn)行分解，與未發(fā)酵組相比都存在不同程度的分解，后期的研究重點(diǎn)主要為總黃酮類和3種主要天麻活性成分的具體轉(zhuǎn)化物質(zhì)。發(fā)酵體系中巴利森苷的含量與未發(fā)酵組相比反而有所提高，表明通過灰樹花的發(fā)酵，可以進(jìn)行巴利森苷成分的生物合成和富集。試驗(yàn)驗(yàn)證了灰樹花在非傳統(tǒng)基質(zhì)上仍然能夠進(jìn)行正常的生長(zhǎng)，并且能夠分解總黃酮類物質(zhì),改變基質(zhì)的表觀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，天麻參與其發(fā)酵能夠促進(jìn)其分解總黃酮類物質(zhì)。本研究拓展了中藥資源與大型真菌共發(fā)酵的思路和前景，為創(chuàng)新藥物菌質(zhì)的品種提供了參考。