潘紅 賴呈純 黃賢貴 范麗華 段長青 李紹振

摘? 要? 以刺葡萄2個同質(zhì)不同型的愈傷組織細胞系為材料，研究不同處理因子對其花青素和原花青素合成能力的影響。試驗結(jié)果表明，刺葡萄DLR細胞系具有高產(chǎn)花青素和原花青素的能力，在培養(yǎng)至45 d時，其花青素與原花青素的含量均達到最高值，分別為113.85 μg/g（FW）和 3 562.95 μg/g（FW）;低溫、高溫、肉桂酸、殼聚糖、紫外線、黑暗和KT等因子，對DLR細胞系花青素和原花青素的累積表現(xiàn)出不同的效應(yīng);其中，4 ℃低溫處理下，DLR細胞花青素的積累效果最佳，比對照提高了2.14倍;殼聚糖處理下，原花青素積累效果最佳，是對照的2.84倍。刺葡萄DLW細胞系不具有或極低的花青素和原花青素合成能力，處理因子調(diào)控對其作用效果不明顯。本研究的結(jié)論為進一步進行刺葡萄細胞花青素和原花青素合成調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞? 刺葡萄;愈傷組織;花青素;原花青素;合成調(diào)控中圖分類號? S663.1;TS255.1???? 文獻標(biāo)識碼? A

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.012

花青素是一類具有多個酚羥基的黃酮類化合物，廣泛存在于植物的葉、花、果實、種子、根塊中，可呈現(xiàn)橙色、紅色至藍色的水溶性天然色素^[1]。原花青素是植物中廣泛存在的多酚類化合物，在酸性介質(zhì)中加熱可形成花青素^[2]。研究表明，花青素和原花青素是天然的抗氧化劑，具有清除人體自由基、保護心血管、促進細胞增殖、抗腫瘤、抗突變、抗炎、促進視力等生物學(xué)活性，在人類健康保護方面發(fā)揮著越來越重要的作用^[3-6]。目前市場上的花青素和原花青素主要是從植物中獲取，天然花青素和原花青素的合成不僅與遺傳基因相關(guān)，還與外界環(huán)境因子相關(guān)，生產(chǎn)受到很大的限制^[7-8]。葡萄中花青素和原花青素的含量較其他植物中高^[2]，但大量提取應(yīng)用勢必對生產(chǎn)帶來極大的壓力。隨著技術(shù)的不斷革新，植物細胞培養(yǎng)被認(rèn)為是獲得植物次生代謝產(chǎn)物的有效途徑^[9]。利用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)可以在可控的條件下，有目的地提高花青素和原花青素的含量，進而進行大規(guī)模工廠化生產(chǎn)。在植物細胞培養(yǎng)的過程中，前體飼喂和誘導(dǎo)子一般具有高度的專一性，添加合適的代謝前體和誘導(dǎo)子可以提高細胞中次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。有研究表明，代謝前體、誘導(dǎo)子和激素等對花青素和原花青素含量的積累存在差異^[10-11]。目前，未見刺葡萄愈傷組織花青素和原花青素生物合成調(diào)控的相關(guān)報道。為了探索前體飼喂和誘導(dǎo)子對刺葡萄細胞花青素和原花青素誘導(dǎo)的效果，本課題組在誘導(dǎo)并長期保存的刺葡萄細胞系的基礎(chǔ)上，研究了培養(yǎng)時間、前體飼喂和不同誘導(dǎo)子等處理下刺葡萄細胞中花青素和原花青素含量變化情況，以期為定向調(diào)控刺葡萄細胞花青素和原花青素合成提供技術(shù)支持。

1? 材料與方法

1.1? 材料

以福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所葡萄研究中心長期繼代保存的2個同質(zhì)不同型的刺葡萄愈傷組織細胞系DLR和DLW^[12]為實驗材料。DLR細胞系穩(wěn)定呈紫紅色，DLW細胞系穩(wěn)定呈淺黃綠色。

1.2? 方法

1.2.1 ?不同階段的刺葡萄愈傷組織培養(yǎng)? 將刺葡萄愈傷組織DLR、DLW接入附加1.0 mg/L 2，4-D的MS固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 d時分別取樣。培養(yǎng)室溫度為25 ℃，光照強度1 500～2 000 lx，相對濕度50%～60%，每天光照12 h。設(shè)5次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2? 不同處理下的刺葡萄愈傷組織培養(yǎng)? 溫度處理：刺葡萄愈傷組織培養(yǎng)至24 d時，將其分別置入4 ℃、37 ℃的溫度條件下，培養(yǎng)24 h后取樣，并以培養(yǎng)室（25 ℃）培養(yǎng)的愈傷組織為對照。肉桂酸處理：將培養(yǎng)至24 d時的DLR、DLW愈傷組織置于濃度為40 mg/L的肉桂酸溶液中（肉桂酸溶液采用附加1.0 mg/L 2，4-D的MS液體培養(yǎng)基配制），在培養(yǎng)室中培養(yǎng)24 h后取樣。殼聚糖處理：將培養(yǎng)至24 d時的刺葡萄愈傷組織置于濃度為800 mg/L的殼聚糖溶液中，在培養(yǎng)室中培養(yǎng)24 h后取樣。暗培養(yǎng)處理：將刺葡萄愈傷組織于遮光條件下培養(yǎng)25 d后取樣。UV-B處理：將培養(yǎng)至24 d時的DLR、DLW愈傷組織置于紫外燈（0.15 W/m²）下照射3 h，再培養(yǎng)24 h后取樣。KT處理：將DLR、DLW愈傷組織接種到附加1.0 mg/L 2，4-D和0.5 mg/L KT的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 d。以上各處理除了暗培養(yǎng)外均在光照條件下培養(yǎng)，均以附加1.0 mg/L 2，4-D的MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 d的愈傷組織為對照，培養(yǎng)室溫度為25 ℃，光照強度1 500～2 000 lx，相對濕度50%～60%，每天光照12 h。實驗均設(shè)5次生物學(xué)重復(fù)。刺葡萄愈傷組織收集過程去除培養(yǎng)基，用濾紙吸附多余水分，裝入塑封袋，液氮速凍后，放入–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3? 花青素與原花青素含量測定? 參照賴呈純等^[12]報道的方法進行刺葡萄愈傷組織花青素與原花青素含量的提取與測定。

1.3? 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件處理數(shù)據(jù)，并利用DPS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和方差分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同培養(yǎng)階段的刺葡萄細胞培養(yǎng)物花青素含量

2個刺葡萄細胞系DLR和DLW（圖1）在不同培養(yǎng)階段中花青素含量的變化如圖2所示。從圖2可以看出，DLW刺葡萄細胞中幾乎檢測不到花青素的存在，整個培養(yǎng)過程都維持在痕量的水平，含量在0.05～0.50 μg/g（FW）變化，這說明DLW細胞系幾乎不合成花青素或沒有合成花青素的能力。隨培養(yǎng)時間的延長，DLR刺葡萄細胞中花青素含量呈一個動態(tài)的變化，類似M形變化趨勢，即先緩慢增加，20 d后快速增加，30 d后急劇增加，35 d形成一個高峰后開始快速下降，40 d降到低點，隨后又快速增加，45 d達另一個高峰，而后又迅速下降，一直持續(xù)到60 d，花青素含量在7.39～113.85 μg/g（FW）變化。35 d和45 d是DLR細胞系花青素含量累積的2個高峰，含量分別為109.04 μg/g（FW）和113.85 μg/g（FW），與其他階段的DLR細胞培養(yǎng)物花青素含量相比，差異極顯著（p<0.01）;含量最低值出現(xiàn)在培養(yǎng)的第10 天，僅為7.39 μg/g（FW）。這種雙峰的變化，可能與DLR細胞系花青素的累積不同的大寫字母表示差異極顯著（p<0.01），不同的小寫字母表示差異顯著（p<0.05）;DLW由于數(shù)值太小，不進行差異顯著性分析。

與細胞的衰老存在相關(guān)性，當(dāng)前期細胞生長到35 d時，花青素的累積達到高峰，35 d后隨著細胞衰老，花青素合成受阻，部分降解，40 d后抗衰老的機制運行，花青素合成再次激活，45 d花青素含量又形成一個高峰，之后隨著細胞的進一步衰老，花青素合成再次受阻，并且快速降解。

2.2? 不同處理下刺葡萄細胞培養(yǎng)物花青素含量

在不同處理條件下，刺葡萄DLR、DLW細胞系花青素含量變化情況如圖3所示。DLW細胞系其花青素的含量并沒有明顯增加，仍維持在極低水平，在0.35～0.65 μg/g（FW）變化，這說明不同因子處理對DLW細胞系花青素合成的誘導(dǎo)是無效的。對于DLR細胞系來說，不同因子的處理對其細胞培養(yǎng)物花青素含量的累積有很大影響，其中，4 ℃低溫處理對花青素累積的促進效果最好，其花青素含量為46.05 μg/g（FW），比對照的21.47 μg/g（FW）提高了約2.14倍;殼聚糖處理后，花青素含量為39.31 μg/g（FW），比對照提高了約1.83倍;高溫37 ℃處理也能較大幅度提高細胞中花青素含量，為35.16 μg/g（FW），比對照增加了1.64倍;UV處理花青素含量為26.44 μg/g（FW），比對照增加了1.23倍;肉桂酸處理下，細胞花青素含量不升反降，可能是加入肉桂酸代謝前體會改變花青素合成途徑中次生產(chǎn)物的累積水平;0.5 mg/L KT處理對DLR細胞花青素

2.3? 不同培養(yǎng)階段的刺葡萄細胞培養(yǎng)物原花青素含量變化

不同的培養(yǎng)時間對原花青素含量的積累具有較大的影響。從圖4可以看出，刺葡萄DLW細胞系原花青素含量在整個培養(yǎng)過程中都維持在一個很低的水平，檢測到的原花青素含量在52.56～ 130.48 μg/g（FW）。DLR細胞系持續(xù)的培養(yǎng)過程中，原花青素含量變化呈現(xiàn)為倒V形，檢測到的原花青素含量在577.33～3 562.95 μg/g（FW）： 10～15 d略微下降，之后持續(xù)快速上升， 35～40 d時有一個停滯階段，40～45 d又開始迅速增加，45 d原花青素含量達到最大累積量，為3 562.95 μg/g（FW），而后又?jǐn)嘌率降匮杆俳档?，直?0 d。這種變化趨勢可能是與DLR細胞的生長和衰老相適應(yīng)的結(jié)果，35 d后細胞開始衰老，衰老的反應(yīng)機制到40 d后開始建立，45 d后細胞大部分進入衰老，合成受阻并且次生產(chǎn)物開始降解，導(dǎo)致其原花青素的含量持續(xù)下降。

2.4? 不同處理下刺葡萄細胞培養(yǎng)物原花青素含量變化

經(jīng)過不同因子處理，刺葡萄DLR、DLW細胞系原花青素含量變化如圖5所示。對于DLW細胞系，不同因子的處理并不能增加其原花青素含量，說明這些處理對于其原花青素的合成是無效的。對于DLR細胞系來說，各因子的誘導(dǎo)效果差異較大，處理后對刺葡萄DLR細胞培養(yǎng)物原花青素的累積效果為：殼聚糖>KT>37 ℃>肉桂酸> 4 ℃>UVB>CK>暗培養(yǎng)。濃度為800 mg/L的殼聚糖對DLR細胞培養(yǎng)物原花青素累積效果最好，含量可達到3 742.96 μg/g（FW），比對照[1 317.85 μg/g（FW）]增加了2.84倍;其次為KT，原花青素含量為3 311.89 μg/g（FW），比對照增加了2.51倍左右;4 ℃、37 ℃和肉桂酸處理也能顯著增加原花青素含量，增加1.6倍以上。這說明殼聚糖、激素、37 ℃、肉桂酸和4 ℃處理均可以增加刺葡萄細胞原花青素的合成與累積;紫外光對刺葡萄細胞原花青素的合成有一定的抑制作用，而暗培養(yǎng)對其原花青素的合成有強烈的抑制作用，說明光照對原花青素的合成同樣是必需條件。

2.5? 刺葡萄細胞花青素和原花青素合成的關(guān)聯(lián)性分析

植物花青素和原花青素的合成經(jīng)由了次生代謝苯丙烷類途徑和類黃酮途徑，從形成無色花青素后出現(xiàn)分支^[13-14]。就刺葡萄DLW細胞系而言，其不能形成花青素，也幾乎不合成原花青素。對于刺葡萄DLR細胞系，在連續(xù)的2個月培養(yǎng)過程中，其花青素出現(xiàn)2個累積高峰，而原花青素只有1個累積高峰，含量最高峰都出現(xiàn)在培養(yǎng)的第45天。在各種因子處理的情況下，DLR細胞代謝前體肉桂酸會抑制花青素的合成，但卻顯著地促進原花青素的合成;激素KT處理對DLR細胞花青素的合成沒有顯著的促進作用，卻可以極顯著地增加其原花青素的合成;紫外光處理可以顯著地促進花青素的合成，但對原花青素的累積作用效果不明顯。這種變化情況說明，花青素和原花青素的合成與累積具有一定的關(guān)聯(lián)性，其合成和累積的過程受諸多因素的影響，這有待進一步深入的研究。

3? 討論

本研究對2個刺葡萄細胞系花青素和原花青素含量進行了分析，刺葡萄DLW細胞系花青素與原花青素含量極少，且定向調(diào)控也無明顯作用，這說明其不適合用于生產(chǎn)花青素和原花青素。DLR細胞系具有較強的合成花青素和原花青素的能力，在培養(yǎng)45 d時，花青素和原花青素的含量均達到峰值。不同的調(diào)控因子對DLR細胞系花青素和原花青素的合成具有較大影響，但作用的效果存在較大差異。

4 ℃低溫處理對提高花青素的積累效果最明顯，低溫能夠誘導(dǎo)花青素積累，使花青素含量提高，這一現(xiàn)象在蘋果^[15]、紅橙^[16]、菊花^[17]等植物中都得到了驗證。37 ℃高溫處理下DLR細胞中花青素和原花青素的含量明顯增加，雖然有研究表明高溫抑制了合成花青素基因的表達^[15]，使植物分解代謝加劇，導(dǎo)致花青素合成受抑制或分解增加^[18]，但也有研究報告顯示花青素生物合成基因的mRNA積累和UFGT的酶活性在高溫下不受抑制^[19]。殼聚糖處理的刺葡萄DLR細胞，表現(xiàn)出最強的原花青素合成能力，培養(yǎng)25 d的細胞培養(yǎng)物，其原花青素含量比對照組提高了2.84倍。殼聚糖對次生代謝產(chǎn)物的積累作用，在許多研究中都得以證實^[20-22]。光是影響植物的重要環(huán)境因子之一，植物通過光受體感知并傳遞光信號，調(diào)節(jié)植物生長和發(fā)育的各個過程^[23]。在離體培養(yǎng)的細胞中，光通過激活花青素代謝途徑中的相關(guān)酶基因的表達，對花青素苷合成進行調(diào)控，VvmyBA1是花青素生物合成的調(diào)控基因，在避光的條件下，植物細胞內(nèi)源性ABA含量降低，VvmyBA1的表達被抑制^[24]。CHS、DFR、UFGT等都屬于光調(diào)節(jié)酶，以光敏色素為光受體^[25-26]。刺葡萄細胞在暗培養(yǎng)的條件下，其花青素和原花青素的含量與對照相比分別減少了94%和55%。這說明光對刺葡萄細胞花青素和原花青素的積累具有明顯的刺激作用，DLR細胞系屬于光敏感型。紫外光是類黃酮生物合成的有效促進因子^[27-28]，刺葡萄DLR細胞在紫外光處理下，花青素含量顯著增加，而對原花青素合成有一定的抑制作用，這種現(xiàn)象的作用機制還有待進一步研究。肉桂酸是花青素、原花青素合成途徑的必要物質(zhì)之一^[29-30]，在肉桂酸處理DLR細胞系中，發(fā)現(xiàn)其花青素合成能力受抑制，而能促進原花青素的合成。激素是植物生長發(fā)育過程中的一個重要調(diào)節(jié)因子，在DLR細胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，添加KT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)物，在同一時間內(nèi)比未添加KT培養(yǎng)的刺葡萄愈傷組織DLR顏色紅，呈深紅色，實驗結(jié)果顯示，KT對刺葡萄愈傷組織DLR花青素含量的積累并沒有顯著性影響，但原花青素含量的積累是對照的2.51倍。以上這些現(xiàn)象的作用機制，均有待進一步的深入研究。

以上分析說明，處理因子的濃度或處理時間等對植物細胞次生代謝產(chǎn)物的積累具有一定的影響作用。過低的濃度、過短的處理時間都可能達不到誘導(dǎo)效果，高濃度的誘導(dǎo)子與長時間的處理可能對細胞次生代謝產(chǎn)物的積累具有一定的拮抗作用。所以處理因子的使用量與處理時間也有一定的要求。雖然本研究未對各處理因子的使用濃度或處理時間做深入研究，但為后續(xù)研究提供了方向，為進一步開展刺葡萄細胞花青素和原花青素合成定向調(diào)控與基因表達的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

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