任燕 羅春麗 蔣雯文 黃明進(jìn) 謝丹

(貴州大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025)

白術(shù)RhizomaAtractylodisMacrocephalae能益氣健脾且燥濕，是一種對(duì)不明原因腸炎有效的傳統(tǒng)中藥，β-桉葉醇是白術(shù)中一種活性成分。為了證實(shí)β-桉葉醇具有修復(fù)腸膜的功效，本文選取IEC-6細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，IEC-6細(xì)胞是胃腸粘膜修復(fù)藥理實(shí)驗(yàn)的適宜細(xì)胞模型[1]，腸上皮細(xì)胞IEC-6細(xì)胞來(lái)源于大鼠小腸隱窩細(xì)胞，是腸道屏障的關(guān)鍵組成部分，具有阻止抗原、毒素和有害微生物從腸腔轉(zhuǎn)移到循環(huán)中的作用[2-3]。IEC-6細(xì)胞常用于體外建立胃腸粘膜損傷修復(fù)模型[4]。本研究我們假設(shè)β-桉葉醇可能通過(guò)多胺介導(dǎo)的信號(hào)通路調(diào)節(jié)Ca2+，從而調(diào)節(jié)IEC-6的增殖和遷移，為β-桉葉醇胃腸黏膜損傷修復(fù)作用機(jī)制研究提供參考。為了證實(shí)這一假設(shè)，我們采用MTT法、劃痕法、流式細(xì)胞術(shù)及蛋白印跡法等研究β-桉葉醇對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖和遷移的影響，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ODC和Ca2+濃度、TRPC1mRNA和蛋白的表達(dá)，以及對(duì)細(xì)胞周期的影響探討β-桉葉醇對(duì)胃腸粘膜損傷的修復(fù)作用的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1細(xì)胞系 IEC-6細(xì)胞系，購(gòu)自中國(guó)模式培養(yǎng)收集中心(CCTCC)。

1.2試劑 β-桉葉醇(10 mg，批號(hào)：ZT-70925)購(gòu)于中國(guó)四川省藥檢所；RPM 1640培養(yǎng)基(美國(guó)圣路易斯Sigma化工公司)；0.25%胰蛋白酶/EDTA；雙抗；胰蛋白酶(美國(guó)大島Gibco Life Technologies)；胎牛血清(中國(guó)蘭州民海生物科技有限公司)；MTT和DMSO(Sigma Chemical Co.)；TNF-α及ODC酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)；PBS緩沖液；甲氨蝶呤(MTX)；EB(溴化乙錠)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖的影響 培養(yǎng)細(xì)胞是在37℃的含5%CO2的加濕空氣中進(jìn)行。在RPM 1640培養(yǎng)基中添加10%熱滅活胎牛血清(FBS)和慶大霉素。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，PBS洗滌2次，胰蛋白酶消化，1000 rpm離心5 min，吸除上清液，加入適量培養(yǎng)基使其成為單細(xì)胞懸液；用血球計(jì)數(shù)板對(duì)該單細(xì)胞懸液所含細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度5×104mL，100 μL/孔接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)，37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，分別將已稀釋的不同濃度(0 mol·L-1、10 mol·L-1、20 mol·L-1、40 mol·L-1、80 mol·L-1、160 mol·L-1)的 β-桉葉醇(無(wú)血清培養(yǎng)基配藥)加入各相應(yīng)孔中，放入孵箱，培養(yǎng)24 h后，吸棄上清，每孔加入200μL終濃度為0.5 mg·mL的MTT溶液；并輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板數(shù)次，37℃，5% CO2恒溫繼續(xù)培養(yǎng)4h；吸棄液體，每孔加入150 μL DMSO，避光振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在492 nm處的吸光度值。用以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖率：增殖率(%)=[1-A492 nm(處理細(xì)胞)/A492 nm(對(duì)照細(xì)胞)]×100%。

2.2對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用PBS清洗，胰蛋白酶消化，1000 rpm離心5 min，吸除上清液，加入適量培養(yǎng)基使其成為單細(xì)胞懸液；用血球計(jì)數(shù)板對(duì)該單細(xì)胞懸液所含細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度1×105mL，2 mL/孔接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，將實(shí)驗(yàn)組分為2組(β-桉葉醇組和空白對(duì)照組)，分別加入相應(yīng)的藥物成分，放入孵箱，培養(yǎng)24 h后，吸棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞2次，終止消化，將細(xì)胞液移入1.5 mL管中，1000 rpm離心5 min，吸除上清液，PBS洗滌2次，吸除上清液，用于ELISA檢測(cè)ODC。

2.3對(duì)IEC-6細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響 細(xì)胞培養(yǎng)同上，加入適量培養(yǎng)基使其成為單細(xì)胞懸液；用血球計(jì)數(shù)板對(duì)該單細(xì)胞懸液所含細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度1×105mL，2 mL/孔接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，將實(shí)驗(yàn)組分為2組(β-桉葉醇組和空白對(duì)照組)，放入孵箱，培養(yǎng)24 h后，吸棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞2次，終止消化，將細(xì)胞液移入1.5 mL管中，1000 rpm×5 min離心，吸除上清液，采用不含Ca2+、Mg2+的D-Hanks緩沖液洗滌2次，吸除上清，然后加入適量含有fluo-3/AM的D-Hanks緩沖液(fluo-3/AM終濃度為1μM)，置于37℃避光孵育30 min，用-Hanks緩沖液輕洗2次，再加入D-Hanks緩沖液，37℃，繼續(xù)孵育20 min，將每個(gè)樣品移入流式細(xì)胞儀反應(yīng)杯，用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量。

2.4對(duì)IEC-6細(xì)胞各組間沖溝距離的影響 用PBS清除對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的IEC-6細(xì)胞，胰蛋白酶消化，吸入15 mL塑料離心管，1000 rpm×5 min離心，吹打成單細(xì)胞懸液。用血球計(jì)數(shù)板對(duì)該單細(xì)胞懸液所含細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)至2×105mL-1，接種于6孔板中，6孔培養(yǎng)板背面每隔0.5 cm劃?rùn)M線，然后將6孔培養(yǎng)板置于37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜，待貼壁細(xì)胞后，取上清液，用200 μL移液管吹掃垂直溝道，用PBS清洗兩次，清除脫落細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞， PBS洗滌，胰蛋白酶消化，1000 rpm離心5 min，吸除上清液，加入適量培養(yǎng)基使其成為單細(xì)胞懸液；用血球計(jì)數(shù)板對(duì)該單細(xì)胞懸液所含細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度2×105mL-1，2 mL/孔接種于6孔板中，6孔板背面提前用馬克筆每隔0.5 cm劃線，每孔至少5條線，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至單層，吸除上清液，使用200 μL槍頭比著直尺，垂直于背后橫線劃痕，用PBS洗滌2次，去除劃下細(xì)胞，加入β-桉葉醇和2%FBS，放入孵箱，在100 μx0005 μ顯微鏡下拍攝，隨機(jī)取5個(gè)場(chǎng)，于0 h、24 h拍照。利用PS軟件和motic軟件計(jì)算各間溝間距離。

2.5對(duì)IEC-6細(xì)胞周期的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用PBS清洗，胰蛋白酶消化，1000 rpm離心5 min，吸除上清液，加入適量培養(yǎng)基使其成為單細(xì)胞懸液；用血球計(jì)數(shù)板對(duì)該單細(xì)胞懸液所含細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度1.3×105mL-1，2 mL/孔接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，將實(shí)驗(yàn)組分為2組(β-桉葉醇組和空白對(duì)照組)，分別加入相應(yīng)的藥物成分，放入孵箱，培養(yǎng)24 h后，吸棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞2次，用細(xì)胞上清液終止消化，將細(xì)胞液移入1.5 mL管中，1000 rpm離心5 min，吸除上清液，PBS洗滌2次，吸除上清液，加入500 μL體積分?jǐn)?shù)為70%的冷乙醇，4℃固定過(guò)夜；27000 rpm離心5 min，吸棄上清，用PBS洗滌2次，加入配制好的500 μL PI/RNase A 染色工作液(臨用時(shí)將 Rnase A：PI 工作液按 1：9 體積配制)，室溫避光 30 min后，用流式細(xì)胞儀分析結(jié)合量。

2.6對(duì)細(xì)胞TRPC1蛋白基因表達(dá)的影響 細(xì)胞培養(yǎng)同上，收集細(xì)胞離心，將細(xì)胞重新懸浮在1毫升的PBS中，分成4個(gè)微管離心。去除上清液，洗滌細(xì)胞兩次，后向每管加入RIPA 裂解液，置碎冰上裂解10 min；收集裂解液，4℃，離心，取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。并將細(xì)胞裂解液與5個(gè)SDS-PAGE加載緩沖液混合。將等量的蛋白質(zhì)在95℃下加熱10分鐘，然后在預(yù)制的7-15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠上分離。將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜中，該膜在Tris緩沖鹽水加含5%脫脂奶粉的0.05%吐溫-20(TBS-T)中封閉1 h。將膜在TBS-T中洗滌，并在含1%脫脂牛奶的TBS-T中與原代單克隆抗體在4℃下孵育過(guò)夜。將PVDF膜放入一抗中，4℃孵育過(guò)夜；用TBST將PVDF膜洗3次，每次5 min；后將PVDF膜放入二抗中，室溫孵育2-3 h；用TBST將PVDF膜洗3次，每次10 min。將PVDF膜平鋪到保鮮膜上，將ECL發(fā)光液的A、B兩種試劑等體積混合后，均勻的滴加到膜上，反應(yīng)1 min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入暗室中，曝光，用凝膠圖像分析成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析，結(jié)果以目的蛋白相對(duì)表達(dá)量表示。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白積分光密度值(IOD)/內(nèi)參積分光密度值(IOD)，各樣本蛋白質(zhì)水平與GAPDH相關(guān)。

2.7對(duì)細(xì)胞TRPC1蛋白基因表達(dá)的影響 細(xì)胞培養(yǎng)同上，收集細(xì)胞，離心，將顆粒重新懸浮在PBS中，分成4個(gè)微管離心。將上清液丟棄。從每個(gè)樣本中提取總RNA，然后使用定量PCR(QPCR)cDNA動(dòng)物總RNA分離試劑盒將等量RNA反向轉(zhuǎn)錄成cDNA。從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索基因全序列，使用Primer Premier引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)篩選各基因特異性引物。所有引物均交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成，并以ULTRAPAGE純化。所有引物在使用前須檢查一個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物。將樣品在95℃下加熱10 min，然后熔化，退火。以GAPDH為參考基因，利用Microsoft Excel軟件對(duì)實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和分析。在標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)相對(duì)定量計(jì)算拷貝數(shù)。

3 結(jié)果

3.1β-桉葉醇對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示，與空白組相比，β-桉葉醇濃度在80 μm、160 μm的細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，增殖率均無(wú)顯著性差異(p>0.05)。在10 μm、40 μm(24 h)、10 μm、20 μm(48 h)、10 μm、20 μm(72 h)(p<0.05)上有差異，與空白組比較，β-桉葉醇的20 μm(24 h)濃度有顯著差異(p<0.01)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表 1 β-桉葉醇對(duì)IEC-6 細(xì)胞增殖影響(OD值及增殖率)

3.2β-桉葉醇對(duì)IEC-6細(xì)胞內(nèi)ODC含量的影響 ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，IEC-6細(xì)胞中ODC濃度β-桉葉醇組(20μm，24 h)有顯著性差異(p<0.01)。見(jiàn)表2。

3.3β-桉葉醇對(duì)IEC-6細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響結(jié)果表明與空白組比較，β-桉葉醇組(20 μm，24 h)有顯著性差異(p<0.05)。各組IEC6細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度見(jiàn)表2。

3.4β-桉葉醇對(duì)IEC-6細(xì)胞各組間沖溝距離的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與0 h相比，β-桉葉醇組(20μM，24 h)有顯著性差異(p<0.05)，空白組(24 h)與0 h相比無(wú)顯著性差異(p<0.05)。各組沖溝距離見(jiàn)表2。

表 2 IEC-6細(xì)胞內(nèi)ODC含量

3.5β-桉葉醇對(duì)IEC-6細(xì)胞周期的影響 結(jié)果表明β-桉葉醇組在G1期的OD值明顯高于空白組(p<0.01)，S期β-桉葉醇組OD值明顯低于空白組，數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表 3 β-桉葉醇對(duì)細(xì)胞周期的影響(OD值)

3.6β-桉葉醇對(duì)細(xì)胞TRPC1蛋白基因表達(dá)的影響(Western blot) Western blotting和PCR分析顯示(圖1)在IEC6細(xì)胞中，β-桉葉醇組TRPC1的表達(dá)明顯高于空白組(p<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表 4 TRPC1蛋白基因表達(dá)值

圖1 β-桉葉醇對(duì)ICE-6細(xì)胞TRPC1蛋白基因表達(dá)影響的Western印跡結(jié)果

4 討論

本論文研究了β-桉葉醇對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖和遷移的影響。體外MTT結(jié)果表明β-桉葉醇處理的IEC-6細(xì)胞增殖率明顯高于空白組，如表1所示；ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，β-桉葉醇處理的IEC-6細(xì)胞中ODC濃度高于空白對(duì)照組，如表2所示；采用流式細(xì)胞儀分析顯示細(xì)胞內(nèi)鈣離子的含量，結(jié)果顯示β-桉葉醇組明顯高于空白組，如表3所示。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明β-桉葉醇能快速刺激損傷后IEC-6細(xì)胞遷移，對(duì)細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用明顯，如表4所示；采用流式細(xì)胞技術(shù)研究細(xì)胞周期，結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，β-桉葉醇(10mol·L-1)處理的IEC-6細(xì)胞具有更多的二倍體，在細(xì)胞復(fù)制中起重要作用，如表5所示；Western blot實(shí)驗(yàn)和RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TRPC1蛋白在β-桉葉醇組中的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組，如表6和表7所示。

鳥氨酸脫羧酶(ODC)是多胺生物合成的限速酶，介導(dǎo)上皮細(xì)胞增殖，在胃粘膜損傷的最佳修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。精胺、亞精胺、腐胺等多胺可介導(dǎo)胃腸道細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，并在胃十二指腸粘膜損傷的最佳修復(fù)中發(fā)揮重要作用[5]。ODC調(diào)節(jié)多胺的生物合成，它在胃腸道的細(xì)胞生長(zhǎng)和分化中起著重要的作用，從而促進(jìn)損傷后的修復(fù)[6-7]，在高滲氯化鈉給藥后胃粘膜愈合等條件下，ODC活性增加[8]，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)多胺增加時(shí)，Kv1.1通道被激活，導(dǎo)致細(xì)胞膜電位超極化。研究表明，腸上皮細(xì)胞Kv1.1通道的表達(dá)依賴于多胺的調(diào)節(jié)[9-12]，細(xì)胞膜電位的超極化可增強(qiáng)鈣離子內(nèi)流[13-14]，多胺的增加可以增加Ca2+的驅(qū)動(dòng)力，Ca2+通過(guò)激活Kv通道而侵入[12]，因此增加[Ca2+]cyt，[Ca2+]cyt的增加可促進(jìn)細(xì)胞遷移，這解釋了較高濃度的ODC在β-桉葉醇處理的細(xì)胞中可增加細(xì)胞中Ca2+的濃度，同時(shí)也解釋了β-桉葉醇促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，并與影響細(xì)胞內(nèi)多胺合成和細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]cyt濃度的增加。TRPC1是調(diào)節(jié)鈣池的鈣通道之一，TRPC1介導(dǎo)的CCE(由于儲(chǔ)存耗竭引起的鈣離子進(jìn)入稱為電容性鈣離子進(jìn)入)是[Ca2+]cyt的重要來(lái)源，調(diào)節(jié)粘膜損傷的早期修復(fù)[15]，[Ca2+]cyt可刺激細(xì)胞遷移并促進(jìn)早期修復(fù)過(guò)程。由于非興奮性細(xì)胞不表達(dá)VDCC(一種有效的電壓依賴性鈣通道)，[Ca2+]Cyt細(xì)胞的增加主要依賴于離子跨膜通道和細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流的釋放[16,17]。如果[Ca2+]cyt減少，細(xì)胞遷移將受到抑制[18-20]；當(dāng)細(xì)胞受到相應(yīng)的刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+離子濃度增加，[Ca2+]Cyt的相應(yīng)增加在激活細(xì)胞分化、增殖、遷移、蛋白質(zhì)分泌和免疫應(yīng)答等生理過(guò)程中起著重要的觸發(fā)和第二信使作用[21]。維持細(xì)胞遷移需要穩(wěn)定升高的[Ca2+]Cyt，這主要取決于細(xì)胞外Ca2+的流入。細(xì)胞周期[Ca2+]cyt的增加與TRPC1mRNA和蛋白的高表達(dá)有關(guān)。在分化的腸上皮細(xì)胞中，TRPC1mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)顯著高于非分化細(xì)胞[22]。CAV1蛋白也可以通過(guò)激活TRPC-1介導(dǎo)的Ca2+流入促進(jìn)粘膜損傷后修復(fù)[23]。因此，在腸上皮細(xì)胞中，TRPC1具有SOCs(細(xì)胞因子信號(hào)抑制物)的功能，可受CCE調(diào)節(jié)，[Ca2+]cyt在損傷后腸粘膜上皮的修復(fù)中起重要作用，TRPC-l還可通過(guò)與STIMIL、RShOA等蛋白質(zhì)相互作用影響細(xì)胞遷移[24,25]。

本研究結(jié)果表明，β-桉葉醇能促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的增殖和遷移，β-桉葉醇能促進(jìn)TRPC1mRNA和蛋白表達(dá)，增強(qiáng)TRPC1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+，提高[Ca2+]Cyt的濃度，而Ca2+在上皮細(xì)胞增殖和遷移中發(fā)揮著重要作用[20]，促進(jìn)粘膜損傷后修復(fù)[23]提示β-桉葉醇是通過(guò)促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖和遷移而促進(jìn)損傷后IEC-6細(xì)胞的修復(fù)，因此，β-桉葉醇可能通過(guò)增強(qiáng)TRPC1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量，在粘膜損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用增加細(xì)胞多胺合成，增加TRPC1 mRNA和蛋白表達(dá)，增加Ca2+流入，從而增加[Ca2+]Cyt，促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，這可能是β-桉葉醇促進(jìn)腸黏膜損傷修復(fù)的機(jī)制之一，本實(shí)驗(yàn)除了證實(shí)β-桉葉醇對(duì)腸黏膜的修復(fù)作用外，還部分解釋了β-桉葉醇修復(fù)腸黏膜的機(jī)制。