崔蕾 郭延麗 衛(wèi)培峰 朱麗紅*

(1.咸陽(yáng)市中心醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000;2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046; 3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000)

盆腔炎性疾病指女性上生殖道及其周?chē)M織的發(fā)生感染類(lèi)的疾病，若盆腔炎性疾病沒(méi)有得到及時(shí)正確的治療，則會(huì)發(fā)展成為慢性盆腔炎，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)稱(chēng)為盆腔炎性疾病后遺癥[1]。慢性盆腔炎(chronic pelvic inflammatory disease， CPID)[2]是在女性?xún)?nèi)生殖器及其周?chē)Y(jié)締組織中發(fā)生的一種慢性感染性疾病，例如，子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎、卵巢炎等，盆腔炎是中醫(yī)中常見(jiàn)且困難的婦科類(lèi)別，其特點(diǎn)是病程長(zhǎng)，復(fù)發(fā)率高且難以根治。在古書(shū)醫(yī)籍中，未曾出現(xiàn)過(guò)“盆腔炎”“慢性盆腔炎”或“盆腔炎性疾病后遺癥”等詞，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可將這類(lèi)疾病歸屬于“帶下病”“癥瘕”“腹痛”“月經(jīng)失調(diào)”“不孕”“熱入血室”等范疇[3]。目前，西醫(yī)主要使用抗生素來(lái)治療CPID，激素和理療也有一定的作用，但無(wú)法達(dá)到根治的目的，因而大多數(shù)患者體內(nèi)仍會(huì)殘留少量致病菌，若是使用大量的抗生素，人體會(huì)產(chǎn)生耐藥性，并伴隨著多種不良反應(yīng)[4]。近年來(lái)，中醫(yī)藥顯示出高治愈率，低毒和副作用等優(yōu)點(diǎn)，并引起了越來(lái)越多的關(guān)注[5]。中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)組編《中成藥臨床應(yīng)用指南 感染性疾病分冊(cè)》[6]中將慢性盆腔炎性疾病分為濕熱瘀阻、氣滯血瘀、氣虛血瘀、寒濕瘀阻4個(gè)證型。FKJC由北敗醬、延胡索、香附、紅花和其他中藥組成，可利濕清熱、散結(jié)行氣、補(bǔ)氣血，臨床醫(yī)師常用來(lái)治療CPID且效果明顯[7]，但其治療機(jī)理尚不清楚。在該試驗(yàn)中，建立了CPID大鼠模型，觀察大鼠子宮組織形態(tài)，大鼠血清相關(guān)炎性介質(zhì)及子宮組織中相關(guān)基因表達(dá)的變化，探討FKJC對(duì)CPID患者的療效及作用機(jī)理，從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度進(jìn)行闡述。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)藥物 FKJC，甘肅省西峰制藥有限責(zé)任公司；KFKC，陜西康惠制藥有限公司。FKJC輔以蒸餾水配制成低、中、高，分別為0.27 g/kg，0.54 g/kg，1.08 g/kg的混懸液；KFKC配置成0.65 g/kg的混懸液。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物 雌性SD大鼠65只(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK(冀)2018-0048)。

1.3試劑 南京寧康化工有限公司生產(chǎn)的批號(hào)為20180708的苯酚；南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的ELASA 試劑盒；大鼠腫瘤壞死因子α；上海哈靈生物試劑檢測(cè)中心生產(chǎn)的戊巴比妥鈉；白介素-1β；采血器；將苯酚液化取5 mL加入西黃芪膠1 g和甘油4 mL，最后用蒸餾水定容到20 mL即可得到25 %苯酚膠漿；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2、胰島素樣生長(zhǎng)因子1；購(gòu)買(mǎi)美國(guó)Abcam公司生產(chǎn)的一抗、二抗。

1.4儀器 紹興精博檢測(cè)儀器有限公司生產(chǎn)型號(hào)為4XC的顯微鏡；無(wú)錫明垚化工設(shè)備有限公司生產(chǎn)的石蠟切片機(jī)；韓國(guó) BIONEER 公司生產(chǎn)的PCR儀；北京澎昆博遠(yuǎn)公司生產(chǎn)的凝膠成像系統(tǒng)；日本SANYO 公司生產(chǎn)的超低溫冰箱；深圳亞王萬(wàn)相科技有限公司生產(chǎn)的電泳儀及電泳槽；高速冷凍離心機(jī)(GL10MA)。

1.5方法

1.5.1造模 購(gòu)買(mǎi)65只SD雌性大鼠，喂養(yǎng)1周，隨后，任取55只大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg，將其周?chē)l(fā)剔除，碘伏處理，從下腹正中間，切口直徑0.8 cm～1cm，使子宮暴露，注射器吸取提前制備好的25%苯酚膠漿0.08 mL，將針頭慢慢的插入子宮分叉處，逐層縫合，用碘伏消毒防止感染。隨后將剩余的10只大鼠用相同的方式進(jìn)行麻醉，打開(kāi)腹腔，再使用標(biāo)準(zhǔn)注射器將等量的生理鹽水注入子宮[8]。造模完成14 d后，隨機(jī)選擇其中的五只大鼠，檢驗(yàn)是否造模成功。

1.5.2分組 隨機(jī)分為6組，空白對(duì)照組即假手術(shù)組，模型組， KFKC組，F(xiàn)KJC高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只。

1.5.3給藥方法 分組之后，分別對(duì)陽(yáng)性藥KFKC組(0.65 g/kg)、FKJC高(1.08 g/kg)、中(0.54 g/kg)、低(0.27 g/kg)劑量組，灌胃治療，按10 mL/kg給藥劑量給予假手術(shù)組和模型組等量的生理鹽水作對(duì)照，1次/天，持續(xù)28d。

1.5.4測(cè)定血清中1L-1β和TNF-α的含量 最后一次給藥后，禁食12h天后處理，每千克加入 40毫克的戊巴比妥鈉麻醉，收集腹主動(dòng)脈的血液，靜置半小時(shí)，以3000 r/min離心十分鐘，取上清液，按酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)分別對(duì)血清1L-1β和TNF-α的含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.5觀察大鼠子宮組織 腹主動(dòng)脈收集血液之后，取出卵巢，觀察子宮形態(tài)。記錄其是否正常，將子宮分為兩部分處理，一部分用石蠟包埋切片法，具體步驟參照呂耀中作者的文獻(xiàn)中所采用的方法。對(duì)大鼠CPID模型病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照黃露學(xué)者文獻(xiàn)中的標(biāo)準(zhǔn)[10]。

測(cè)定子宮組織FGF-2和IGF-1蛋白表達(dá)水平 剩余部分子宮組織采用蛋白免疫印跡法(Western blot)法，檢測(cè)FGF-2、IGF-1蛋白表達(dá)水平。具體步驟參照朱蘭[14]文獻(xiàn)中的方法。

1.5.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用(XS)表示，p<0.05，表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1FKJC對(duì)CPID大鼠血清中1L-1β，TNF-α含量的影響 假手術(shù)組與模型組之間存在著顯著性差異，表明建模成功。即模型組1L-1β及TNF-α的含量明顯升高(p<0.05)，經(jīng)給藥治療以后，各治療組相比于模型組均下降(p<0.05)。FKJC各劑量組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。見(jiàn)表1。

表 1 FKJC對(duì)CPID大鼠血清中TNF-α、IL-1水平的影響

2.2FKJC對(duì)CPID大鼠子宮組織病理學(xué)評(píng)分的影響 假手術(shù)組大鼠子宮正常。模型組的子宮組織出現(xiàn)了宮腔縮小，內(nèi)分泌液增多，宮體水腫粗大，末端呈球狀凸起，子宮內(nèi)膜充血，骨盆黏連的癥狀，與模型組比較，F(xiàn)KJC高、中劑量組能改善CPID大鼠的子宮腔壁結(jié)構(gòu)，減輕了內(nèi)膜表面上皮細(xì)胞壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn)以及固有層充血的癥狀。表明用FKJC治療后，子宮充血腫脹的現(xiàn)象明顯減輕。見(jiàn)表2。

表 2 CPID大鼠子宮組織病理學(xué)評(píng)分

2.3FKJC對(duì)CPID大鼠子宮FGF-2、IGF-1蛋白表達(dá)的影響 模型組大鼠的子宮組織IGF-1、 FGF-2蛋白含量顯著增加；與模型組相比，F(xiàn)KJC高、中劑量組FGF-2、IGF-1蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，且這種變化趨勢(shì)在婦可靖膠囊各劑量組表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性，劑量越大，變化越明顯。見(jiàn)表3。

表 3 CPID 大鼠子宮組織中FGF-2、IGF-1蛋白表達(dá)水平

3 討論

慢性盆腔炎(CPID)[12]屬于婦科常見(jiàn)病，發(fā)病率逐年增加?，F(xiàn)代西方醫(yī)學(xué)認(rèn)為[13]，盆腔炎性疾病的病原體有外源性和內(nèi)源性?xún)煞N。內(nèi)源性病原體：主要來(lái)源寄居于陰道內(nèi)的菌群，包括需氧菌及厭氧菌。外源性病原體：中支原體、衣原體感染與輸卵管積水相關(guān)性較大。西醫(yī)常對(duì)癥下藥，主要根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)選用抗生素，殺死或抑制致病菌，此治療措施僅對(duì)急性盆腔炎患者療效顯著，對(duì)CPID的療效較差，安全性較低[14-15]。中醫(yī)學(xué)采用整體觀念，辨證論治，認(rèn)為此病誘因多由濕熱瘀結(jié)、氣滯血瘀、寒濕血瘀、氣虛血瘀、腎虛血瘀等引起。治療也采用辨證論治，如清熱利濕、化瘀止痛，疏肝行氣、活血化瘀，溫經(jīng)通絡(luò)、化瘀止痛或補(bǔ)腎活血、散結(jié)止痛等[16]。近年來(lái)，研究表明，中藥可明顯改善盆腔炎臨床癥狀，且毒副作用較小，優(yōu)于西藥[17]。FKJC[7]是由北敗醬草、延胡索、香附、紅花、柴胡等制成的中成藥，具有利濕清熱、散結(jié)行氣的作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明活血化瘀藥可以改善血液動(dòng)力學(xué)、血液流變學(xué)、抗血栓、抗炎、鎮(zhèn)痛[18]。清熱藥可以抗菌、抗炎，抗病原微生物等[19]。

研究表明[20]，CPID患者不只是感染炎癥，還可能與細(xì)胞因子(TNF-α、1L-1β)的異常表達(dá)密切相關(guān)。TNF-α是由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的一種單核因子，具有雙向調(diào)節(jié)作用。當(dāng)TNF-α大量釋放時(shí)，加速了炎性細(xì)胞的聚集活化，使炎癥加重，當(dāng)TN-α釋放量適中時(shí)，可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，從而抵抗病原體的入侵，阻止炎癥的擴(kuò)散。1L-1β是由膠質(zhì)、內(nèi)皮及神經(jīng)元細(xì)胞合成分泌而來(lái)，可以誘導(dǎo)炎性介質(zhì)產(chǎn)生，使白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附力增強(qiáng)[23]。FGF-2通過(guò)與特異性受體結(jié)合，對(duì)成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞具有強(qiáng)烈的調(diào)節(jié)作用。FGF-2在病理狀態(tài)下，過(guò)度表達(dá)，會(huì)刺激成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活化失常，導(dǎo)致膠原蛋白產(chǎn)生速度大于消耗速度，ECM代謝失衡，沉積于細(xì)胞之間，組織發(fā)生增生纖維化改變[24]。IGF-1是一種在分子結(jié)構(gòu)上與胰島素類(lèi)似的多肽類(lèi)蛋白物質(zhì)。它可以促進(jìn)機(jī)體有絲分裂，參與機(jī)體的新陳代謝等多種代謝途徑[25]。

本研究通過(guò)觀察子宮形態(tài)，結(jié)合病理學(xué)評(píng)分，發(fā)現(xiàn)子宮腫脹、充血及黏連程度有顯著改善。FKJC組大鼠治療后，血清炎性因子1L-1β、TNF-α的含量顯著降低；驗(yàn)證了FKJC對(duì)CPID產(chǎn)生積極的治療效果。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[22]，F(xiàn)GF-2和IGF-1可能參與宮腔黏連的形成，原因在于當(dāng)宮腔黏連加重時(shí)，也會(huì)增加FGF-2和IGF-1在黏連組織中的表達(dá)，成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖和分化就是由于FGF-2過(guò)表達(dá)， IGF-1加速子宮內(nèi)膜纖維化的形成[7]。

綜上所述，F(xiàn)KJC可能通過(guò)降低炎癥組織中FGF-2、IGF-1蛋白表達(dá)水平，從而減輕CPID的癥狀。這為后續(xù)FKJC治療CPID的臨床療效及可能作用機(jī)制提供了理論支持。