張麗 梁卓菲 張化為 黃文麗 宋小妹 宋蓓

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)， 陜西 咸陽 712046；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712046)

肝纖維化是各種原因引起肝損傷后細(xì)胞的代償反應(yīng)，如長(zhǎng)期無有效治療，可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化和肝癌。而肝纖維化被認(rèn)為是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、可逆的過程，如果在這個(gè)階段適當(dāng)治療，可以有效預(yù)防肝硬化和肝癌發(fā)生[1]。然而目前FDA尚沒有批準(zhǔn)任何一種治療肝纖維化的藥物，因此，尋求一種有效防治肝纖維化的中藥成為一個(gè)迫切解決的問題。

珠子參PanaxjaponicusC．A．Mey．var．major(Burk．)C．Y．WuetK．M．Feng具有一定的保肝作用[2]。前期，本課題組對(duì)珠子參總皂苷進(jìn)行的保肝作用研究表明，珠子參總皂苷對(duì)四氯化碳致大鼠急性或慢性肝損傷都有顯著的保護(hù)作用，且無毒性反應(yīng)[3]。本部分實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)珠子參總皂苷預(yù)防肝纖維化作用進(jìn)行研究，通過觀察肝纖維化大鼠組織的病理變化，血清的各項(xiàng)生化指標(biāo)的變化，探討珠子參總皂苷對(duì)肝纖維化大鼠的預(yù)防保護(hù)作用，為珠子參總皂苷用于肝纖維化的防治提供一定的依據(jù)。

1 材料

1.1藥品及試劑 珠子參總皂苷由本實(shí)驗(yàn)室(陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室)制備[4]，實(shí)驗(yàn)前取粉末適量，用0.5%的羧甲基纖維素溶解成混懸液；秋水仙堿，云南植物藥業(yè)有限公司，以超純水配制成所需濃度；四氯化碳，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，與橄欖油以1：1混合配制成50%CCl4溶液；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒、羥脯氨酸測(cè)定(HYP)試劑盒、透明質(zhì)酸(HA)試劑盒、層粘連蛋白(LN)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體重 200±20 g，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(川) 2015-030。

1.3主要儀器及設(shè)備 病理冰凍切片機(jī)(德國LEICA公司)，低溫高速離心機(jī)(美國BECKMAN公司)，酶標(biāo)儀(美國BIO TEK公司)，激光掃描共聚焦顯微鏡(德國LEICA公司)，PTPS-2011彩色病理圖文分析系統(tǒng)(重慶天海醫(yī)療設(shè)備有限公司)。

2 方法

2.1模型建立 取SD大鼠 48只，隨機(jī)分為正常組(8只)、模型組(8只)、珠子參總皂苷(100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg)和秋水仙堿組(陽性對(duì)照組，0.1 mg/kg)，每組各8只。正常組腹腔注射同體積的橄欖油，剩余各組腹腔注射50%CCl4溶液，2次/w，連續(xù)8 w，注射量為2 mL/kg。正常組以外，剩余各組注射50% CCl4溶液2 w后，在各組大鼠飲水中加入含量為350 mg /L的苯巴比妥，從而增加大鼠肝臟對(duì)CCl4的敏感度。從造模第二周起，各給藥組和陽性對(duì)照組大鼠灌胃給予相應(yīng)的藥物，而正常組和模型組灌胃給予相應(yīng)量的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，1次/d，連續(xù)7 w。

2.2樣本采集與處理 末次給藥第2 d，各組分別用20%氨基甲酸乙酯溶液(1.2 g /kg，ip) 麻醉大鼠，并分離腹腔主動(dòng)脈，用10 mL無抗凝劑的離心管取血，3500 rpm 使其離心15 min，取血清保存于-20℃以備用。取肝臟，并稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)(g /g × 1000)；另取剩余部分肝組織-80℃保存。

2.3病理學(xué)觀察 經(jīng)4.0%多聚甲醛固定2 d的肝組織，脫水，包埋，切片(5 μm)，然后進(jìn)行 HE和Massion染色，每張切片100 倍光鏡下觀察肝組織病理形態(tài)變化，并拍照。

2.4生化指標(biāo)檢測(cè) 按試劑盒說明書標(biāo)示方法測(cè)定血清中ALT 、AST，ELISA 法檢測(cè)SOD、GSH-Px、MDA、 LN、HA水平，酶標(biāo)儀測(cè)定其 OD 值，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用雙波長(zhǎng)比色法，并計(jì)算大鼠血清中各指標(biāo)含量。從-80 ℃冰箱中稱取 50 mg肝組織，采用樣本堿水解法測(cè)定HYP含量，檢測(cè)時(shí)嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1對(duì)大鼠肝臟指數(shù)影響 實(shí)驗(yàn)時(shí)給藥前各組大鼠體重基本均一，然而在造模后，與正常組相比，模型組大鼠體重增長(zhǎng)速度減慢，藥物干預(yù)后各組大鼠體重雖有一定的改變，但無顯著性差異；與正常組相比，模型組大鼠的肝臟指數(shù)顯著升高(p<0.01)；與模型組相比，各劑量給藥組大鼠肝臟指數(shù)的降低均具有顯著性(p<0.01)，結(jié)果如表1所示。

表 1 對(duì)大鼠肝臟指數(shù)的影響

3.2對(duì)大鼠肝纖維化病理組織形態(tài)的影響 如圖1所示為HE染色和Masson 的染色結(jié)果，正常組大鼠具有完整的肝小葉結(jié)構(gòu)，以中央靜脈為中心的肝細(xì)胞向四周成條索狀排列，僅在中央靜脈及肝竇周圍出現(xiàn)極少量藍(lán)色膠原纖維。而模型組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂，周圍炎性細(xì)胞浸潤明顯；纖維組織大量產(chǎn)生，自匯管區(qū)周圍向外延伸，相互連接，形成假小葉結(jié)構(gòu)；同時(shí)可見明顯的脂肪性空泡。和模型組相比，珠子參總皂苷中、高劑量組肝組織病理損傷比模型組明顯減少，而低劑量組肝組織纖維程度低，但比中、高劑量組明顯，且仍伴有大量脂肪性空泡；高劑量組改善大鼠肝纖維化的作用優(yōu)于陽性對(duì)照組。結(jié)果表明：珠子參總皂苷的所有給藥組都使肝纖維化有不同程度的改善，纖維組織增生減少并且著色變淺，陽性對(duì)照組與高劑量組比較，以高劑量組最為明顯。

3.3對(duì)大鼠血清ALT、AST的影響 當(dāng)肝臟受損時(shí)，肝細(xì)胞發(fā)生壞死，ALT、AST大量釋放入血中，血中轉(zhuǎn)氨酶活性增高，因此ALT、AST是肝臟損傷的敏感標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組大鼠血清 ALT、AST 水平顯著升高，與模型組相比，給藥組大鼠血清ALT、AST 水平顯著降低，差異均具有顯著性(p<0.01)。結(jié)果見表2

表 2 對(duì)大鼠血清ALT、AST的影響

3.4對(duì)大鼠肝組織HYP和血清HA、LN的影響 羥脯氨酸(hydroxyproline, HYP)為膠原組織的主要成分之一，透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)和層粘連蛋白(laminin, LN)為細(xì)胞外基質(zhì)主要成分，可較靈敏地反映肝內(nèi)已生成的纖維量及肝細(xì)胞受損狀況[5]。與正常組相比，模型組大鼠肝組織 HYP、血清中HA和LN 含量顯著升高(p<0.01)，而與模型組相比，給藥組中、高劑量大鼠肝組織中HYP含量降低并且具有顯著性(p<0.01)，各劑量組大鼠血清中HA和LN含量均顯著降低(p<0.01)。結(jié)果見表3。

表 3 對(duì)大鼠肝組織HYP，血清HA和LN的影響

3.5對(duì)大鼠血清MDA、SOD和GSH-Px的影響 機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度常常由MDA 的量反映，可以間接地反映出肝細(xì)胞損傷的程度；SOD能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞不受損傷，并反映機(jī)體抗氧化酶類活力；GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶[6]。與正常組相比，模型組 MDA 水平顯著升高(p<0.01)，在給予藥物干預(yù)后，與模型組相比，中、高劑量組MDA 水平顯著降低(p<0.01)，低劑量組無顯著差異；與正常組相比，模型組SOD和GSH-Px的水平顯著降低(p<0.01)，各劑量給藥組均使SOD和GSH-Px 的水平顯著升高(p<0.01)。結(jié)果，見表4。

表 4 對(duì)大鼠血清MDA、SOD和GSH-Px的影響

4 討論

病毒、藥物的誘發(fā)和自身免疫性疾病等很多因素會(huì)導(dǎo)致肝損傷，肝損傷過程中凋亡和壞死的肝細(xì)胞以及其他非實(shí)質(zhì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量細(xì)胞因子和活性氧(ROS)，細(xì)胞因子和ROS能激活肝星狀細(xì)胞，使其大量增殖[7-10]，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度聚集[11-14]，最終形成肝纖維化。本文結(jié)果表明，珠子參總皂苷對(duì)四氯化碳所致大鼠肝纖維化有顯著的預(yù)防保護(hù)作用。

AST和ALT反映肝細(xì)胞的損傷程度[15]，給藥組中大鼠血清中AST和ALT的表達(dá)水平顯著降低，表明珠子參總皂苷有效的保護(hù)了損傷的肝細(xì)胞；HYP在肝纖維化的進(jìn)程中隨著膠原的增加或減少而發(fā)生變化，是評(píng)價(jià)膠原蛋白量與肝纖維化程度的重要指標(biāo)[16]，給藥組大鼠肝組織中HYP含量以及血清中HA和LN含量與模型組相比顯著降低，表明珠子參總皂苷可能通過抑制纖維連接蛋白和膠原蛋白的過度表達(dá)，減輕肝纖維化的程度。CCl4經(jīng)機(jī)體肝微粒體CYPs酶代謝可產(chǎn)生氯自由基，這些自由基可與細(xì)胞膜上的脂質(zhì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致氧化過程的終產(chǎn)物如MDA大量產(chǎn)生[17]。SOD為肝臟內(nèi)最重要的抗氧化劑，在機(jī)體發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)時(shí)可有效清除體內(nèi)的自由基[18]。GSH-Px可將氧化型谷胱甘肽(GSSH)還原為還原型谷胱甘肽(GSH)，增加機(jī)體的抗氧化能力[19-21]。由于CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠體內(nèi)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，因而脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA大量產(chǎn)生而顯著性升高，SOD和GSH-Px這兩種抗氧化酶被大量消耗而表現(xiàn)為顯著性下降。珠子參總皂苷顯著降低大鼠血清中的MDA的水平并且提高血清的抗氧化酶SOD、GSH-Px的水平，說明其能通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和自由基的產(chǎn)生來保護(hù)肝組織。

綜上所述，珠子參總皂苷對(duì)大鼠肝纖維化具有一定的預(yù)防保護(hù)作用，可能通過抑制脂質(zhì)過氧化、減少自由基生成、提高組織的抗氧化能力來發(fā)揮作用。本研究為珠子參總皂苷用于肝纖維化的防治提供一定的依據(jù)。