付 江，劉敬莉，柳科軍，，段 磊，蒲 俊，卜 陽，4

（1.湖北省孝感市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，孝感 432000；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院肝膽外科，銀川 750004；4.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院肝膽外科，銀川 750002）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）（簡稱肝癌）目前居于惡性腫瘤發(fā)病率第5位，病死率居第3位[1]。肝癌術(shù)后易復(fù)發(fā)，且對轉(zhuǎn)移缺乏有效治療手段，最終多死于復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。臨床證實(shí)肝癌對分子靶向藥物（索拉非尼等）反應(yīng)不佳，患者生存獲益率有限。免疫檢查點(diǎn)阻斷劑是近年發(fā)展最迅速的免疫治療手段，主要以PD1/PDL1和CTLA4作為治療靶點(diǎn)，通過恢復(fù)受抑制的T細(xì)胞功能達(dá)到殺傷腫瘤的作用[2]，然而研究發(fā)現(xiàn)肝癌抗PD-1應(yīng)答率不到20%[3-4]。因此，從傳統(tǒng)中藥中尋求綜合治療策略，是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代背景下提高肝癌生存獲益率的重要策略之一[5-6]。銀杏葉提取物（ginkgo biloba extract，GBE）是目前臨床使用較廣泛的中藥材之一，其中起主要作用的是黃酮類以及萜內(nèi)酯類等化合物[7-8]。近年研究證實(shí)GBE是血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）特異性受體拮抗劑，競爭性抑制PAF與其受體結(jié)合發(fā)揮作用[9]。然而，GBE與PAF表達(dá)水平的關(guān)系及其對肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響尚不明確。因此，本研究擬檢測GBE含藥血清中PAF水平，進(jìn)而探討GBE含藥血清對肝癌細(xì)胞株增殖、遷移、侵襲的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

GBE制劑（3.5 mg·mL-1）購自悅康藥業(yè)集團(tuán)有限公司；兔抗人E-cadherin、Vimentin、Snail和PCNA抗體均購自美國Abcam公司；鼠抗人βactin購于武漢Proteintech公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔/鼠IgG二抗、PAF小鼠酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、DMEM高糖、TRYPSIN 0.25%EDTA、蘇木素-伊紅染色劑，吉姆薩染液均購自上海威奧生物科技有限公司；Transwell小室購自于美國Corning公司；CCK8細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自日本同仁。

1.2 GBE含藥血清的制備

BALB/c nu裸鼠：雄性，4～6周齡，購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，將裸鼠隨機(jī)分為GBE組［GBE 1 mg·（kg·d）-1，腹腔注射］和對照組（同體積生理鹽水，每天腹腔注射1次），連續(xù)注射2周后眼球取血并800 r·min-1離心獲取血清，0.22 μm針式微孔濾膜過濾除菌并-20℃凍存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)完畢后采用高濃度水合氯醛麻醉裸鼠，經(jīng)頸椎脫位處死。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批同意后實(shí)施。

1.3 ELISA法檢測裸鼠GBE含藥血清中PAF含量

設(shè)空白孔、GBE含藥血清孔、對照血清孔、不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔。GBE含藥血清孔加1∶5稀釋裸鼠GBE含藥血清50 μL，對照孔加1∶5稀釋裸鼠對照組血清50 μL，標(biāo)準(zhǔn)品孔加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品50 μL。實(shí)驗(yàn)按PAF的ELISA試劑盒說明書操作。

1.4 GBE含藥血清處理人肝癌細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞株MHCC97H和Hep3B，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。人肝癌細(xì)胞MHCC97H和Hep3B培養(yǎng)于含1%鏈霉素青霉素、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，將細(xì)胞置于37℃，5% CO2溫育箱中培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期細(xì)胞，細(xì)胞達(dá)80%～90%密度進(jìn)行再傳代或備用。按照50 μL裸鼠血清加入1 mL培養(yǎng)液比例將上述GBE組含藥血清和對照組血清分別加入含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并分別處理人肝癌細(xì)胞株MHCC97H和Hep3B，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞待用。

1.5 CCK8檢測人肝癌細(xì)胞株MHCC97H和Hep3B的增殖

采用GBE含藥血清和對照組血清分別處理人肝癌細(xì)胞株，濃度為10 μL含藥血清加入200 μL含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，對照組血清同比例稀釋，分別處理MHCC97H和Hep3B細(xì)胞24 h、48 h、72 h和96 h，加入CCK8，450 nm測定光密度（OD）值。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測人肝癌細(xì)胞株MHCC97H的遷移能力

采用上述GBE含藥血清和對照組血清處理的人肝癌細(xì)胞株MHCC97H，計(jì)數(shù)并加入6孔板，約5×105個(gè)細(xì)胞/孔，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后采用槍頭進(jìn)行橫線劃痕，而后用胎牛血清洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，放入37℃，5% CO2培養(yǎng)箱，分別于培養(yǎng)24 h和48 h拍照，并測量各組劃痕寬度。

1.7 Transwell法檢測肝癌細(xì)胞株的侵襲和遷移能力

Matrigel膠（購自美國BD公司），4℃過夜解凍，用無血清預(yù)冷的培養(yǎng)液DMEM按1∶8的比例稀釋Matrigel；將80 μL稀釋過的Matrigel加入Transwell小室（上室），4℃孵育4 h使其成凝膠狀；0.25%胰酶-EDTA消化細(xì)胞，用不含血清的培養(yǎng)液DMEM重懸上述經(jīng)GBE含藥血清（或?qū)φ昭澹┨幚砗蟮母伟┘?xì)胞，使其終濃度為6×105/mL；用預(yù)溫的無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌已經(jīng)凝固的Matrigel并在Matrigel上加入100 μL細(xì)胞懸液；下室加入700 μL含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液DMEM，將Transwell小室放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，孵育48 h；吉姆薩染色后40倍鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.8 Western blot檢測肝癌細(xì)胞株增殖及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)

收集細(xì)胞獲得沉淀，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞獲得蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜，封閉，4℃一抗（PCNA、E-cadherin、Vimentin、Snail、β-actin）培養(yǎng)過夜，TBST洗膜后二抗孵育，電化學(xué)發(fā)光法（ECL）曝光，Western blot結(jié)果采用Image J軟件進(jìn)行灰度值評估，目標(biāo)蛋白的半定量數(shù)據(jù)=目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件和Graphpad Prism 7.0繪圖軟件處理。所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)操作，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用配對t檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GBE含藥血清中PAF的含量

ELISA檢測GBE含藥血清和對照組血清中PAF，發(fā)現(xiàn)GBE處理后的裸鼠外周血清中PAF含量為（89.13±18.14）μg·dL-1，對照組為（231.7±26.87）μg·dL-1，GBE組較對照組降低（P＜0.001）。

2.2 GBE含藥血清能夠抑制肝癌細(xì)胞株的增殖

CCK8檢測提示GBE含藥血清處理的肝癌細(xì)胞增殖速度明顯降低。GBE含藥血清處理后96 h，MHCC97H細(xì)胞株GBE組OD值為（0.59±0.25），對照組為（0.99±0.42），GBE組低于對照組（P＜0.001）。Hep3B細(xì)胞株GBE組OD值為（0.56±0.22），對照組為（0.69±0.14），GBE組低于對照組（P＜0.001），見圖1。

圖1 CCK8檢測GBE含藥血清抑制肝癌細(xì)胞株MHCC97H和Hep3B的增殖

2.3 GBE含藥血清能夠抑制肝癌細(xì)胞株的遷移能力

GBE含藥血清及對照血清處理肝癌細(xì)胞MHCC97H 24 h時(shí)，兩組劃痕間隙寬度相近（P＞0.05）；48 h時(shí)GBE組劃痕間隙寬度為（135.80±23.23）μm，對照組為（86.55±14.51）μm，GBE組高于對照組（P=0.0038），見圖2。

圖2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測GBE含藥血清抑制肝癌細(xì)胞株MHCC97H的遷移（×40）

2.4 GBE含藥血清能夠抑制肝癌細(xì)胞株的侵襲能力

Transwell檢測結(jié)果顯示，與對照血清組比較，GBE含藥血清組穿透Transwell小室基底膜的肝癌細(xì)胞數(shù)目減少。GBE組的MHCC97H細(xì)胞穿膜數(shù)為（11.25±2.98）個(gè)，對照組為（29.01±7.26）個(gè)，GBE組低于對照組（P=0.004）；GBE組的Hep3B細(xì)胞穿膜數(shù)為（14.25±5.56）個(gè)，對照組為（42.75±8.53）個(gè)，GBE組亦低于對照組（P=0.0014），見圖3。

圖3 Transwell法檢測GBE含藥血清對肝癌細(xì)胞株侵襲力的影響（×40）

2.5 GBE含藥血清改變肝癌細(xì)胞株的MET及增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blot檢測GBE組的Hep3B細(xì)胞PCNA相對表達(dá)量為（0.24±0.06），對照組為（0.48±0.07），GBE組低于對照組（P=0.0105）；Hep3B細(xì)胞的GBE組Vimentin（0.17±0.04）和Snail（0.42±0.06）的相對表達(dá)量低于對照組的Vimentin（0.31±0.04）和Snail（0.71±0.07）（P=0.021，0.006）；Hep3B的GBE組的E-cadherin相對表達(dá)量為（0.18±0.02），對照組為（0.11±0.04），GBE組高于對照組（P=0.0451）。

Western blot檢測GBE組的MHCC97H細(xì)胞PCNA相對表達(dá)量為（0.09±0.03），對照組為（0.15±0.03），GBE組低于對照組（P=0.0474）；MHCC97H細(xì)胞的GBE組Vimentin（0.21±0.03）和Snail（0.35±0.13）的相對表達(dá)量低于對照組的Vimentin（0.32±0.04）和Snail（0.47±0.10）（P=0.012，0.034）；Hep3B的GBE組的E-cadherin相對表達(dá)量為（0.23±0.04），對照組為（0.13±0.02），GBE組高于對照組（P=0.0139）。

Western blot檢測結(jié)果提示：GBE含藥血清處理兩種肝癌細(xì)胞株的細(xì)胞增殖能力降低與細(xì)胞PCNA表達(dá)降低有關(guān)，肝癌細(xì)胞株的MET改變與E-cadherin表達(dá)升高，Vimentin和Snail表達(dá)降低有關(guān)，見圖4。

圖4 Western blot檢測GBE含藥血清對肝癌細(xì)胞株增殖和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是患者病死的重要原因，而腫瘤細(xì)胞持續(xù)增殖、血管新生及侵襲轉(zhuǎn)移是腫瘤惡性進(jìn)展的首要條件。雖然近年來在肝癌的發(fā)病機(jī)制、新輔助化療及免疫治療方面的研究取得了不少進(jìn)展，但仍未找到有效的抑制肝癌惡性進(jìn)展的治療方法。因此，傳統(tǒng)中藥在腫瘤綜合治療中的應(yīng)用便成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。近年來研究證實(shí)GBE具有抗腫瘤生理活性，在抗氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化凋亡、調(diào)控腫瘤細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和抑制血管生成等方面具有顯著的療效[10]。早期國內(nèi)外研究者已經(jīng)明確了GBE在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、前列腺癌及肝癌中具有良好的抗腫瘤作用[11-13]。GBE能夠通過調(diào)控NF-κB信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用，抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力[14]。Pretner等[15]發(fā)現(xiàn)GBE可以抑制乳腺癌及前列腺癌中外周型苯二氮卓受體的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。楊濤等[16]研究表明GBE可以明顯抑制黃曲霉毒素B1誘發(fā)大鼠HCC的作用，主要是抑制肝細(xì)胞增生性病變，降低肝癌的發(fā)生率。另外，銀杏葉注射液可以抑制肝癌H22荷瘤小鼠的腫瘤細(xì)胞增殖能力和腫瘤的毛細(xì)血管新生，同時(shí)增強(qiáng)環(huán)磷酰胺的抗腫瘤能力[17]。同既往研究結(jié)果一致，本研究應(yīng)用GBE腹腔注射的裸鼠含藥血清處理肝癌細(xì)胞株MHCC97H和Hep3B，結(jié)果表明GBE含藥血清能夠明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腫瘤侵襲和早期轉(zhuǎn)移的重要過程，癌細(xì)胞能夠通過激活EMT促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，腫瘤中EMT水平升高表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力增加，同時(shí)腫瘤細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)降低，Vimentin、Snail1和Twist的表達(dá)升高，具備EMT表達(dá)特征的腫瘤預(yù)后較差；但是腫瘤細(xì)胞在侵襲轉(zhuǎn)移的整個(gè)過程中，會(huì)出現(xiàn)從EMT到MET的逆轉(zhuǎn)，癌細(xì)胞通過MET能夠獲得上皮表型和黏附能力，最終有利于腫瘤歸巢，抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[18]。另外，細(xì)胞增殖異常是腫瘤生物侵襲性的重要指標(biāo)之一，增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表達(dá)水平升高在一定程度上決定了惡性腫瘤的不良預(yù)后[19-20]。在本研究中，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與對照血清處理組相比，GBE含藥血清處理組肝癌細(xì)胞（MHCC97H和Hep3B）后，E-cadherin表達(dá)明顯升高，而Vimentin和Snail表達(dá)明顯降低，呈現(xiàn)MET改變。同時(shí)，GBE含藥血清處理后，PCNA表達(dá)顯著降低，細(xì)胞增殖能力降低。提示GBE含藥血清具有抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的能力，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞EMT改變，抑制肝癌的惡性進(jìn)展。

已有大量研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯衍生物等多種銀杏葉提取成份均是血小板活化因子受體（platelet activating factor receptor，PAFR）的特異性拮抗劑[21-23]。GBE能夠通過抑制PAF/PAFR通路發(fā)揮抗血小板作用[24]。Ye等[25]研究發(fā)現(xiàn)GBE能夠抑制PAF陽性的卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，從而抑制卵巢癌的惡性進(jìn)展。PAF作為最強(qiáng)的血小板聚集誘導(dǎo)劑，在極低濃度下能夠通過與特異性G蛋白受體結(jié)合，進(jìn)而介導(dǎo)炎性反應(yīng)、腫瘤的發(fā)生及其他疾病。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞本身能夠產(chǎn)生大量PAF，從而激活循環(huán)血中的血小板，促進(jìn)血小板與腫瘤細(xì)胞聚集和黏附[26-27]。Bussolati等[28]發(fā)現(xiàn)PAF能夠通過增加乳腺腫瘤細(xì)胞的侵襲力、增殖力和激活血管生成因子的反應(yīng)來加快腫瘤的發(fā)展。Aponte等[29]發(fā)現(xiàn)PAF在PAFR陽性的卵巢細(xì)胞中顯著誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和侵襲，而PARF的拮抗劑可以抑制這一作用。也有研究表明GBE可通過作用于靶細(xì)胞膜上的受體，競爭性抑制PAF與其受體結(jié)合，從而減輕細(xì)胞毒性[30]。而我們推測，GBE可能還具備下調(diào)PAF的作用，為了進(jìn)一步探究GBE在抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的可能機(jī)制，本文采用ELISA檢測GBE處理BALB/c小鼠血清和對照組血清，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GBE處理后的小鼠外周血清中PAF含量較對照組顯著降低。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，GBE含藥血清的作用與其中PAF水平降低有關(guān)，其作用機(jī)制可能是GBE含藥血清中PAF水平下降，從而競爭性抑制PAF對血小板的激活，降低血小板與腫瘤組織細(xì)胞的黏附能力，改善了腫瘤細(xì)胞的惡性潛質(zhì)。

綜上所述，銀杏葉提取物能夠較好地抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，相關(guān)蛋白檢測提示其可能通過逆轉(zhuǎn)EMT發(fā)揮作用，其相關(guān)抗腫瘤作用可能與GBE降低外周循環(huán)血中的PAF含量有關(guān)。因此有理由推測，GBE可能成為肝癌治療的輔助藥物，應(yīng)進(jìn)一步深入研究其作用和機(jī)制，為肝癌的臨床全身化療聯(lián)合傳統(tǒng)中藥治療提供理論依據(jù)。