朱文倩，張學(xué)明

(吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 動物胚胎工程吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130062)

精原細(xì)胞在睪丸中通過有絲分裂、減數(shù)分裂和變態(tài)發(fā)育成為分化完全的精子后并未完全成熟，需經(jīng)直精小管、睪丸網(wǎng)、輸出小管進(jìn)入附睪管，循附睪頭、體、尾移行，與附睪管腔的微環(huán)境相互作用，進(jìn)一步發(fā)生形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，獲得運(yùn)動能力、透明帶固著能力、精卵識別和結(jié)合能力，完成成熟過程并靜息儲存于附睪尾[1]。

1 附睪的結(jié)構(gòu)

1.1 輸出小管和附睪管附睪起源于胚胎中腎管(沃爾夫管)的形成，直至分化為迂曲的管腔[2]，主要由輸出小管、附睪管和管間結(jié)締組織構(gòu)成，附著于睪丸的上端和后緣，可分為頭、體和尾3個(gè)區(qū)段[3]，在小鼠、大鼠等種屬，附睪頭部近端還有起始段。其中，頭部和體部分別調(diào)控早期和晚期的精子成熟，而尾部主要是成熟精子的儲存部位[4-5]。附睪管黏膜上皮為假復(fù)層纖毛柱狀上皮，一般包含主細(xì)胞、基細(xì)胞、亮細(xì)胞、頂細(xì)胞(狹窄細(xì)胞)等亞型細(xì)胞[6]。主細(xì)胞是附睪上皮中主要的細(xì)胞類型，占上皮細(xì)胞數(shù)量比例的80%左右，存在于附睪的各個(gè)區(qū)段，胞質(zhì)中含有豐富的細(xì)胞器和分泌囊泡[7]，有活躍的內(nèi)吞作用，參與管腔大部分蛋白的合成與分泌[4]?；?xì)胞呈圓錐形，位于上皮的基底膜，大鼠基細(xì)胞通過形態(tài)改變可調(diào)節(jié)管腔的體積和管壁壓力，表明其對附睪管腔結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用[7]。亮細(xì)胞體積較大，分布于附睪各個(gè)區(qū)段，在人、大鼠等種屬中均有發(fā)現(xiàn)，能吞噬精子碎屑，清潔管腔環(huán)境[7]。頂細(xì)胞數(shù)量很少；其頂部寬、體部窄，胞核位于頂部；細(xì)胞頂端腔面呈圓頂狀，有短而少的微絨毛；胞質(zhì)中含有許多大而不規(guī)則的線粒體，其他細(xì)胞器不發(fā)達(dá)。頂細(xì)胞和亮細(xì)胞的頂質(zhì)區(qū)表達(dá)液泡質(zhì)子泵ATP酶(V-ATPase)[6]，可依賴分解ATP產(chǎn)生的能量作為動力，泵出質(zhì)子H+參與維持管腔內(nèi)的酸化環(huán)境[8]。此外，附睪上皮基膜外側(cè)還包繞有平滑肌層，參與精子運(yùn)輸[9]。

1.2 血-附睪屏障血-附睪屏障(blood-epididymis barrier,BEB)是存在于附睪管內(nèi)與管壁外結(jié)締組織中毛細(xì)血管間可調(diào)節(jié)物質(zhì)進(jìn)出、提供精子成熟微環(huán)境、阻止管內(nèi)自體免疫反應(yīng)發(fā)生的結(jié)構(gòu)(圖1)[10]。其結(jié)構(gòu)和功能包括形態(tài)結(jié)構(gòu)(物理性)、生理功能(滲透性)和免疫屏障3個(gè)方面。

圖1 附睪上皮結(jié)構(gòu)模式圖

BEB的組織學(xué)構(gòu)成主要是附睪上皮及其細(xì)胞連接(特別是緊密連接tight junction,TJ)、基膜、平滑肌、毛細(xì)血管內(nèi)皮及其基膜。電鏡研究顯示，附睪上皮間存在的網(wǎng)狀TJ可有效阻止辣根過氧化物酶、鑭等分子進(jìn)入管腔；小鼠管外平滑肌半透膜則可阻止碳顆粒、鑭等分子進(jìn)入85%～90%的管腔內(nèi)。附睪上皮游離面和基底面的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)分子進(jìn)出管內(nèi)，形成特定微環(huán)境。BEB滲透屏障的結(jié)構(gòu)在精子成熟過程中呈動態(tài)變化，但上皮細(xì)胞間連接的完整性基本不變。BEB的免疫屏障功能主要是隔絕精子抗體、限制免疫球蛋白和免疫細(xì)胞進(jìn)入管腔，從而保護(hù)精子免受自身免疫系統(tǒng)的攻擊。正常條件下，單核吞噬細(xì)胞(mononuclear phagocytes,MPs)、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞在附睪管外結(jié)締組織中廣泛存在，但管內(nèi)未見存在；同樣，管內(nèi)也未檢測到大部分的免疫球蛋白。即使管外發(fā)生炎癥，管內(nèi)微環(huán)境仍能保持一定穩(wěn)定性。

2 附睪的功能

2.1 轉(zhuǎn)運(yùn)作用輸出小管上皮由單層立方細(xì)胞和柱狀纖毛細(xì)胞交替排列，纖毛細(xì)胞游離面有長纖毛伸入管腔，非纖毛細(xì)胞腔面凸向管腔，有微絨毛。這些特化結(jié)構(gòu)的擺動參與精子的轉(zhuǎn)運(yùn)[11]。延時(shí)成像監(jiān)測發(fā)現(xiàn)附睪頭部和體部管壁呈規(guī)律性和階段性收縮模式，調(diào)控精子在附睪管中轉(zhuǎn)運(yùn)的時(shí)間，確保精子結(jié)構(gòu)和功能的完善[12]。大鼠附睪頭部還存在5-羥色胺能系統(tǒng)，可作為神經(jīng)遞質(zhì)介導(dǎo)附睪平滑肌的收縮活動，參與調(diào)節(jié)精子轉(zhuǎn)運(yùn)[13]。附睪精子的轉(zhuǎn)運(yùn)同樣受旁分泌或內(nèi)分泌因子的調(diào)控，催產(chǎn)素、去甲腎上腺素等可增強(qiáng)附睪平滑肌收縮[12]，而cGMP信號則對附睪管平滑肌具有松弛作用[9]；在附睪尾部，平滑肌層受節(jié)后交感神經(jīng)纖維支配，促進(jìn)附睪精子向輸精管方向的轉(zhuǎn)運(yùn)[14]。上述研究表明，附睪內(nèi)精子的轉(zhuǎn)運(yùn)受到特化纖毛和微絨毛擺動及平滑肌收縮的協(xié)同調(diào)控，形成從睪丸向附睪的液體流，推動精子的遷移[15]。

2.2 重吸收作用研究表明，約95%睪丸網(wǎng)內(nèi)液體的重吸收主要是通過附睪頭部輸出小管的上皮細(xì)胞完成的[15]。蛋白質(zhì)量濃度在附睪初始段約為4 g/L，而在附睪尾部可增至50～60 g/L[16]，表明附睪存在可觀的重吸收能力。水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是一類同源性的內(nèi)在膜蛋白，在細(xì)胞膜上形成特異性水轉(zhuǎn)運(yùn)孔道，驅(qū)動水和中性溶質(zhì)分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[17]，維持機(jī)體水和電解質(zhì)平衡。AQP1/9是輸出小管和附睪管中最豐富的水通道蛋白，在附睪的分泌和重吸收過程中發(fā)揮重要作用[18]。AQP1在絕大部分哺乳動物包括人的輸出小管、附睪起始段上皮細(xì)胞的頂質(zhì)膜和附睪頭部非纖毛細(xì)胞的微絨毛中均有分布[18-19]，參與精子成熟過程中睪丸網(wǎng)液體的大量重吸收。AQP9在附睪各區(qū)段主細(xì)胞的頂部均有表達(dá)[19-20]，但在附睪頭部和尾部的表達(dá)較高。這表明附睪各區(qū)段重吸收能力存在差異，頭部是附睪的主要重吸收部位，而尾部是成熟精子及液體濃縮、儲存的部位[17]。因此AQP1/9的表達(dá)和調(diào)節(jié)與附睪的重吸收作用密切相關(guān)。

2.3 免疫作用附睪上皮的MPs包括樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等專職抗原呈遞細(xì)胞[21]，在起始段，CD11c+CX3CR1+上皮細(xì)胞的長突起可直接獲得管腔中的抗原，參與附睪的免疫監(jiān)視[22-23]。成年小鼠附睪單側(cè)輸出小管結(jié)扎后，引起附睪起始段上皮細(xì)胞迅速凋亡，原位檢測發(fā)現(xiàn)附睪上皮中CD11c+CX3CR1+的MPs通過表型和形態(tài)的改變及時(shí)吞噬凋亡細(xì)胞和炎性碎屑，維持BEB的TJs結(jié)構(gòu)的完整性[21]。應(yīng)用家系全外顯子組測序技術(shù)在梗阻性無精子癥患者的附睪TJs編碼基因CLDN2中發(fā)現(xiàn)了一種新的功能獲得性錯(cuò)義變體，該突變位點(diǎn)與家系中顯示的X連鎖遺傳模式相一致，皆因附睪上皮細(xì)胞間TJs被破壞，干擾了BEB的正常功能，引發(fā)附睪上皮炎癥性碎屑脫落，造成機(jī)械性梗阻[24]。上述研究表明，附睪上皮細(xì)胞形態(tài)和功能的正常維持對BEB的免疫防御作用至關(guān)重要[22]，附睪上皮結(jié)構(gòu)改變或附睪管腔阻塞都有可能導(dǎo)致雄性不育。

2.4 修飾作用精子在睪丸中完成形態(tài)分化后進(jìn)入附睪，穿行過程中被連續(xù)修飾，包括精子胞漿小滴(cytoplasmic droplet,CD)的移行、精子胞漿和頂體形態(tài)變化、精子核染色質(zhì)的濃縮、精子質(zhì)膜表面蛋白構(gòu)象的改變等[25-26]。

2.4.1精子形態(tài)變化 CD是精子進(jìn)入附睪前經(jīng)支持細(xì)胞吞噬胞質(zhì)后的殘余體[27]，與精子滲透調(diào)節(jié)和運(yùn)動有關(guān)。由于精子中缺少滲透調(diào)節(jié)的細(xì)胞器，位于中段的CD參與調(diào)控水和滲透物質(zhì)的運(yùn)輸，介導(dǎo)調(diào)節(jié)性容積減小或增大的過程[28]，成為精子滲透調(diào)節(jié)的主要場所[29]。研究發(fā)現(xiàn)，來源于附睪頭部的精子，CD位于精子頭-頸連接中段的近端；而在附睪尾部或輸精管獲得的精子，CD位于精子鞭毛中段的末端，表明精子在附睪內(nèi)移行的過程中，CD逐漸從精子頸部向尾部轉(zhuǎn)運(yùn)；且精子CD的缺失或異位可引起精子活力降低或形態(tài)改變，導(dǎo)致雄性不育[30]。因此，該結(jié)構(gòu)在精子運(yùn)動、超激活運(yùn)動和頂體反應(yīng)等過程中發(fā)揮重要作用，可能成為研究雄性避孕的理想藥物靶標(biāo)。

2.4.2精子表面蛋白變化 附睪小體是附睪上皮細(xì)胞以頂漿分泌方式產(chǎn)生的納米膜狀囊泡[5]，通過轉(zhuǎn)運(yùn)精子成熟和受精所需的蛋白促進(jìn)精子成熟。附睪小體能包裹多種附睪上皮區(qū)域性的分泌蛋白并將其轉(zhuǎn)移至精子[25]。在分子水平上，附睪中精子生理功能的改變與磷酸化級聯(lián)反應(yīng)的激活相關(guān)，通過激活cAMP/PKA通路介導(dǎo)酪氨酸磷酸化的增加，與精子獲能密切相關(guān)[31]。其中，cSrc是參與該過程的酪氨酸激酶，由附睪小體釋放并遞送至精子。另外，小泛素相關(guān)修飾蛋白(small ubiquitin-related modifier,SUMO)可與雄激素受體AR結(jié)合，參與細(xì)胞周期、分化和凋亡的調(diào)控[32]。消除AR的SUMO化引起附睪內(nèi)117個(gè)基因差異表達(dá)，其中受雄激素調(diào)控的同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子Pem/Rhox5和絲氨酸肽酶抑制因子Spink2/5/11表達(dá)降低，導(dǎo)致附睪精子成熟障礙、精子活力降低和精卵結(jié)合能力受損[33]。這表明AR的SUMO化能特異性調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，維持正常附睪功能和精子成熟。

2.4.3附睪分泌蛋白與精子成熟 P34H是由附睪上皮細(xì)胞分泌并通過糖基磷脂酰肌醇錨定于精子頂體部位的膜蛋白，與倉鼠附睪蛋白P26H具有較高的同源性。P34H/P26H與附睪小體的筏膜結(jié)構(gòu)域密切相關(guān)，介導(dǎo)精子與透明帶的結(jié)合，是附睪精子成熟的標(biāo)志之一，低水平的P34H與雄性不育有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，倉鼠附睪頭部精子中未檢測到P26H，而附睪尾部精子則顯著表達(dá)該分子，表明P34H/P26H是在附睪精子轉(zhuǎn)運(yùn)過程中轉(zhuǎn)移至精子表面的[25]。

富含半胱氨酸分泌蛋白(cysteine rich secretory proteins,CRISP)中CRISP1/4是由附睪上皮合成分泌的雄激素依賴蛋白，參與附睪中精子成熟的轉(zhuǎn)運(yùn)過程和調(diào)控精子超活化運(yùn)動等[34]。研究發(fā)現(xiàn)，CRISP1/4單敲小鼠可育，但雙敲小鼠則表現(xiàn)為附睪多個(gè)區(qū)段的上皮細(xì)胞損傷，且管內(nèi)pH顯著升高，表明CRISP1/4的同源蛋白間存在補(bǔ)償機(jī)制，參與調(diào)控附睪上皮細(xì)胞的分化，維持精子成熟和儲存所需的管內(nèi)pH酸化水平[34]；CRISP1也參與調(diào)控Ca2+信號通路，在精子獲得前向運(yùn)動、精子超活化運(yùn)動和精卵結(jié)合能力的過程中發(fā)揮重要作用[35]。

2.5 保護(hù)作用活性氧(reactive oxygen species,ROS)是細(xì)胞氧化還原代謝的副產(chǎn)物，適量ROS通過調(diào)節(jié)附睪中cAMP水平在精子成熟、獲能和頂體反應(yīng)等過程中起核心作用，過量ROS會引起精子質(zhì)膜不飽和脂肪酸鏈過度氧化交聯(lián)，損害精子功能，影響雄性生育力。?；撬崾歉讲G液中主要的游離氨基酸，是重要的滲透調(diào)節(jié)器和抗氧化劑，對精子具有滲透調(diào)節(jié)、保持Ca2+動態(tài)平衡、防止脂質(zhì)過氧化的作用[36]。半胱氨酸雙加氧酶(cysteine dioxygenase,CDO)是合成牛磺酸的關(guān)鍵酶，CDO-/-小鼠的附睪液和精子中牛磺酸水平嚴(yán)重降低，精子因滲透調(diào)節(jié)能力的降低引起鞭毛形態(tài)改變，導(dǎo)致受精率降低[36]。此外，?；撬徇€通過提高過氧化酶的活性防止線粒體產(chǎn)生自由基引起精子的氧化應(yīng)激。谷胱甘肽過氧化物酶5(glutathione peroxidase-5,GPX5)是在附睪中特異性表達(dá)的抗氧化酶，參與調(diào)節(jié)附睪微環(huán)境中的ROS濃度[37]。精子在附睪轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，GPX5與精子膜結(jié)合保護(hù)精子免受脂質(zhì)過氧化損傷，以維持精子DNA的完整性和穩(wěn)定性，抑制附睪尾部精子頂體反應(yīng)過早發(fā)生的同時(shí)，協(xié)調(diào)精核谷胱甘肽過氧化物酶-4(snGPx4)發(fā)揮穩(wěn)定核染色質(zhì)和維持其致密化的作用[38]，并通過附睪小體泛素轉(zhuǎn)移來幫助消除功能缺陷的精子[31]，保證精子正常的發(fā)育、成熟[37]。

2.6 儲存作用附睪的精子儲存作用雖已習(xí)為人知，但有關(guān)人、靈長類和試驗(yàn)動物方面尚缺乏最新文獻(xiàn)資料。與哺乳動物相比，爬行動物精子在附睪儲存的時(shí)間更長，由于爬行動物特殊的生殖習(xí)性，使精子發(fā)生與排卵時(shí)間相互錯(cuò)位。這對于比較研究哺乳類包括男性附睪的精子儲存作用可能有借鑒意義。研究發(fā)現(xiàn)，中華鱉附睪中的精子含有較多的胞質(zhì)[39]，且雌性輸卵管中也觀察到未成熟的精子，表明其附睪精子的成熟度較低，所以附睪在爬行動物中主要起儲存精子作用。中華鱉的生精活動隨季節(jié)變化，精子發(fā)生的各個(gè)階段早在冬季來臨之前完成[40]，之后儲存于附睪中直至次年繁殖季節(jié)[39-41]。中華鱉附睪外泌體由上皮纖毛細(xì)胞、腺體細(xì)胞通過頂漿分泌方式和多泡體釋放至管腔，介導(dǎo)細(xì)胞間的通訊。其特異性標(biāo)記物CD63在精子儲存期間的表達(dá)顯著高于繁殖期，表明附睪外泌體可能參與精子的儲存過程[42]。此外，免疫調(diào)節(jié)也是影響精子在附睪儲存的重要因素。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一類重要的介導(dǎo)免疫反應(yīng)的分子。研究發(fā)現(xiàn)，TLR2/4在中華鱉附睪各區(qū)段和精子中均有表達(dá)[43]，TLR2/4在儲存期和繁殖期精子中的分布位置差異不大，但TLR4在儲存期和繁殖期附睪尾部的表達(dá)顯著高于頭部和體部，表明TLR2/4可能在維持附睪微環(huán)境和保護(hù)精子免受外源微生物感染方面發(fā)揮作用。

3 總結(jié)與展望

附睪及附睪精子成熟具有重要的研究價(jià)值，了解附睪的結(jié)構(gòu)和功能，闡明精子成熟過程中的復(fù)雜機(jī)制，將為揭示附睪源性雄性不育疾病的遺傳及發(fā)生機(jī)理奠定良好的理論基礎(chǔ)，對實(shí)現(xiàn)雄性生育力的調(diào)節(jié)和精子受精率的提升具有指導(dǎo)意義。