杜建輝,劉松,2*,陸信曜,陳堅*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122) 2(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122)

微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase,TGase)是工業(yè)中常用的工具酶,能夠催化?；w進行脫酰胺和?；D(zhuǎn)移,進而形成共價鍵以完成分子交聯(lián)[1]。目前市場上食品級TGase來源于茂原鏈霉菌(Streptomycesmobaraenesis),因具有非鈣離子依賴、發(fā)酵成本低等優(yōu)勢而備受市場青睞[2]。近些年隨著對TGase催化特異性的研究,其在紡織、制藥和材料加工等非食品領(lǐng)域的應(yīng)用也廣受關(guān)注[3-5]。

隨著S.mobaraenesisTGase在工業(yè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,其較差的熱穩(wěn)定性也成為亟待解決的問題。目前,已有隨機突變、DNA改組和飽和突變?yōu)榛A(chǔ)的定向進化提高TGase熱穩(wěn)定性的報道[6-8]。其中,突變體MS(S2P-S23V-Y24 N-S199A-K294L)是目前熱穩(wěn)定性較優(yōu)的TGase突變體[9]。與氫鍵等因素相比,二硫鍵可以降低蛋白質(zhì)中未折疊多肽鏈的熵以提升穩(wěn)定性,是影響熱穩(wěn)定性的最重要因素[10]。理性設(shè)計形成蛋白質(zhì)分子內(nèi)部二硫鍵也是提高酶穩(wěn)定性的重要手段。ZHANG等[11]對一種嗜熱植酸酶理性設(shè)計引入了8組二硫鍵,其中最佳一組突變體60 ℃半衰期提升了3.8倍,同時表現(xiàn)出更強的抗胰蛋白酶及胃蛋白酶降解能力；朱方劍[12]通過理性設(shè)計在角質(zhì)酶中引入二硫鍵成功獲得一個熱穩(wěn)定性顯著提高的突變體,該突變體70 ℃處理10 min殘余酶活是野生型的1.5倍,80 ℃半衰期可達16 h；王睿等[13]通過理性設(shè)計在脂肪酶中引入二硫鍵,最佳一組突變體60 ℃半衰期較原始酶延長了3.5倍,Tm提高4.2 ℃。

本研究以突變體MS為基礎(chǔ),通過對野生型TGase結(jié)構(gòu)進行虛擬突變和能量優(yōu)化獲得了MS的模擬構(gòu)象。應(yīng)用Disulfide by design 2.0線上分析軟件對潛在的二硫鍵成鍵突變體進行預(yù)測,選擇12對二硫鍵突變體,利用大腸桿菌(Escherichiacoli)進行表達、純化及酶學(xué)性質(zhì)分析,并對相關(guān)突變體蛋白機理進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

所用大腸桿菌E.coliJM109和E.coliBL21(DE3)由本實驗室保存。E.coliJM109作為克隆宿主,E.coliBL21(DE3)作為構(gòu)建質(zhì)粒的表達宿主。編碼突變體MS(S2P-S23V-Y24 N-S199A-K294L)基因由蘇州金唯智(GENEWIZ)合成,并通過酶切位點BlpI、NdeI克隆至的pET-22b(+),得到質(zhì)粒pET-22b(+)/pro-MS。編碼硫氧還原蛋白TrxA的質(zhì)粒pET-48b由本實驗室保存。

1.1.2 實驗試劑

DNA工具酶及磷酸化試劑盒(Blunting Kination Ligation Kit),Takara大連寶生物公司;中性蛋白酶,北京索萊寶科技有限公司;5 mL鎳離子親和層析柱、5 mL G-25凝膠層析柱,江蘇千純生物科技有限公司;Bradford蛋白濃度測定試劑盒,碧云天生物技術(shù)公司;CBZ-Gln-Gly,Sigma-Aldrich中國;一步克隆試劑盒(Vazyme ClonExpress II One Step Cloning Kit C112),諾唯贊;其他分子生物學(xué)試劑,大連寶生物公司。

1.1.3 培養(yǎng)基與緩沖液

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L,固體培養(yǎng)基添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的瓊脂粉。

TB培養(yǎng)基：酵母提取物24 g/L、胰蛋白胨12 g/L、K2HPO4·3H2O 12.84 g/L、KH2PO42.31 g/L,甘油4 mL/L。

TGase活化液：50 mmol/L Tris-HCl,100 mmol/L NaCl,2 mmol/L CaCl2,1 mmol/L還原型谷胱甘肽、200 g/L中性蛋白酶,調(diào)節(jié)pH至7.0。

純化緩沖液A液：50 mmol/L Tris-HCl,100 mmol/L NaCl,25 mmol/L咪唑,調(diào)節(jié)pH至7.8。

洗脫緩沖液B液：50 mmol/L Tris-HCl,100 mmol/L NaCl,500 mmol/L咪唑,調(diào)節(jié)pH至7.8。

脫鹽緩沖液C液：50 mmol/L Tris-HCl,調(diào)節(jié)pH至7.8。

二硫鍵還原緩沖液：0.1 mol/L Tris-HCl,8 mol/L脲素,調(diào)節(jié)pH至7.0。

酶活測試底物：200 mmol/L Tris-HCl,100 mmol/L羥胺,10 mmol/L還原型谷胱甘肽,30 mmol/L CBZ-Gln-Gly,調(diào)節(jié)pH至6.0。

酶活力測試終止液：將120 g/L三氯乙酸、3 mmol/L HCl、50 g/L FeCl3·6H2O(溶于0.1 mol/L HCl)等體積混合均勻,避光保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 軟件分析

通過I-TASSER (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER) 線上服務(wù)器根據(jù)野生型成熟TGase構(gòu)象(PDB：1iu4)對突變體MS構(gòu)象建模[14]。在此基礎(chǔ)上,通過Rosetta-StructureRelax模塊對MS構(gòu)象進行優(yōu)化。將獲得的最終構(gòu)象上傳至Disulfide by design 2.0(http://cptweb.cpt.wayne.edu/DbD2/)線上服務(wù)器進行二硫鍵突變預(yù)測[15]。對預(yù)測得到的55個突變體根據(jù)能量分組,即能量由高到低每9個分為一組(最后一組10個)。在各分組中抽取2個作為實驗對象,進行突變后驗證。

1.2.2 突變體的構(gòu)建

通過一步克隆構(gòu)建表達載體pET-22b(+)/TrxA-pro-MS(圖1-a)。以trxa-f和trxa-r為引物,通過PCR從質(zhì)粒pET-48b擴增得到TrxA片段。以vec-f和vec-r為引物,通過PCR從pET-22b/pro-MS擴增得到pET-22b/pro-MS開環(huán)片段。開環(huán)片段溶液經(jīng)DpnI消化后,與TrxA片段通過一步克隆試劑盒連接,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109,提取質(zhì)粒測序,篩選得到序列正確的表達載體pET-22b(+)/TrxA-pro-MS。

以ms-s1-f/ms-s1-r、ms-s2-f/ms-s2-r、ms-s3-f/ms-s3-r、ms-s4-f/ms-s4-r、ms-s5-f/ms-s5-r、ms-s6-f/ms-s6-r、ms-s7-f/ms-s7-r和ms-s8-f/ms-s8-r為引物對pET-22b(+)/TrxA-pro-MS進行PCR擴增,分別得到含有MS-P244C-E249C、MS-S293C-N297C、MS-E182C-G185C、MS-A136C-N149C、MS-D118C-K121C、MS-A136C-L150C、MS-L154C-R162C和MS-D86C-R89C的突變基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI消化后回收,用磷酸化試劑盒連接后轉(zhuǎn)化E.coliJM109并提取質(zhì)粒測序驗證。以pET-22b(+)/TrxA-pro-MS為模板,通過一步克隆法構(gòu)建二硫鍵突變體MS-Q206C-I240C、MS-G110C-Y217C、MS-P22C-Q328C和MS-A130C-A195C。膠回收PCR產(chǎn)物并將含有同源臂的片段試劑盒連接,轉(zhuǎn)化E.coliJM109并提取質(zhì)粒測序驗證。測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3),獲得突變體生產(chǎn)菌株。本研究所使用的引物見表1。

表1 本研究所使用的引物

1.2.3 突變體的誘導(dǎo)表達

陽性轉(zhuǎn)化子接入氨芐青霉素濃度為0.1 g/L的LB培養(yǎng)基中,37 ℃過夜培養(yǎng)10 h后以2%接種量接于相同質(zhì)量濃度抗性的TB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至OD600=1.0時加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達,20 ℃培養(yǎng)40 h。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物回收

發(fā)酵液6 000×g離心10 min,收集沉淀以脫鹽溶液C液重懸,冰上預(yù)冷后超聲破碎20 min,10 000×g離心20 min,取上清液添加1/5體積TGase活化液,37 ℃水浴孵育30 min后10 000×g離心25 min,收集上清液用于純化。

1.2.5 TGase的純化、脫鹽及蛋白濃度測定

蛋白純化采用鎳柱通過純化緩沖液A液進行平衡,以V(純化緩沖液A)∶V(洗脫緩沖液B液)=7∶3的比例對蛋白樣品進行洗脫?；厥盏鞍缀笸ㄟ^G-25凝膠柱使用脫鹽溶液C液對樣品進行脫鹽。蛋白濃度采用Bradford(碧云天)試劑盒進行測定。

1.2.6 酶活測定

比色法測定TGase酶活力[16],定義1單位TGase酶活力為37 ℃條件每下1 min生成1 μmolL-谷氨酸 γ-單羥肟酸[17]的酶量。

1.2.7 酶半衰期測定

酶溶液稀釋至0.5 g/L,60 ℃水浴,0～10 min內(nèi)每1 min取樣,10～40 min內(nèi)每隔2 min取樣,取出的樣品置于10 ℃水浴冷敷。對所取樣品進行酶活力測定,通過Original 2018-Exponential-ExpDec1對殘余酶活力百分比進行非線性擬合,獲得擬合公式(1)后計算出酶活力下降至初始的50%所對應(yīng)的時間即為半衰期。

(1)

1.2.8 巰基滴定法檢測二硫鍵生成

將蛋白樣品(非還原態(tài)TGase)用二硫鍵還原緩沖液稀釋至0.3 g/L,取2 mL TGase樣品與50 μL β-巰基乙醇混合,37 ℃熱處理1 h得到還原態(tài)TGase樣品,加入2 mL 三氯乙酸繼續(xù)孵育1 h后14 000×g離心10 min,取沉淀加入2 mL緩沖液溶液復(fù)溶得到還原態(tài)TGase。取1 mL還原態(tài)及非還原態(tài)TGase加入15 μL 2-對硝基苯甲酸,室溫放置20 min檢測412 nm處吸收光。根據(jù)公式(2)計算二硫鍵數(shù)量:

(2)

式中：n,二硫鍵數(shù)量；Ncys,半胱氨酸殘基數(shù)量；A412reduced,還原態(tài)TGase樣品在412 nm處吸光值；A412non-reduced,非還原態(tài)TGase樣品在412 nm處吸光值。

1.2.9 熔解溫度分析

稀釋TGase純蛋白溶液(溶劑為Tris-HCl,pH=8.0)至質(zhì)量濃度為2 g/L,通過差示掃描量熱法進行熔解溫度測試。以蛋白所在溶劑作為內(nèi)參,掃描溫度從40～90 ℃、升溫速率為1 ℃/min,壓力為303.975 kPa。

1.2.10 動力學(xué)參數(shù)測定

TGase樣品液稀釋至0.05 g/L,配制10份含不同濃度CBZ-Gln-Gly的底物溶液A(CBZ-Gln-Gly含量分別為3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 mmol/L)。測定37 ℃反應(yīng)10 min后各底物溶液A中CBZ-Gln-Gly的轉(zhuǎn)化量,通過Origin 2018-Growth/Sigmodial-Hill非線性擬合獲得Km和Vmax值,以酶濃度換算獲得kcat值及Km/kcat值獲得酶催化效率。

1.2.11 酶-底物分子對接

以S.mobaraenesisTGase晶體結(jié)構(gòu)(PDB:1iu4)為模板,通過Discovery studio 2016 Macromolecule-Design Protein-Build Mutants模塊分別構(gòu)建MS及MS-P22C-Q328C結(jié)構(gòu),利用Minimization模塊中的Smart minimizer對模擬結(jié)果進行能量最小化處理。底物CBZ-Gln-Gly構(gòu)象從PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Z-Gln-Gly)獲得,并通過Discovery studio 2016轉(zhuǎn)為pdb文件。應(yīng)用AutodockTools-1.5.6(ADT)分別對底物與酶進行柔性對接,對接盒子設(shè)定為50×50×50 ang。采用ADT對結(jié)果進行聚類分析,最終對接構(gòu)象選擇依據(jù)如下：(1)對接構(gòu)象來源于大類；(2)底物CBZ-Gln-Gly的4-氨基甲?；鶊F需與酶分子中β-SH基團滿足距離小于3；(3)對接構(gòu)象在對應(yīng)聚類中能量最低。

1.2.12 分子動力學(xué)模擬

應(yīng)用Gromacs-2020分別對能量優(yōu)化后的MS和MS-P22C-Q328C構(gòu)象進行力場化和溶劑化處理,應(yīng)用溶劑為水、力場為54a7、分子邊界為1.2 nm[18]。之后對體系進行能量最小化、升溫平衡(達到330 K),并進行10 ns的動力學(xué)模擬,溫度設(shè)定為330 K,對動力學(xué)模擬過程中的蛋白總體RMSD和各氨基酸RMSF進行分析,以獲得突變位點對蛋白結(jié)構(gòu)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變位點的選擇及突變體的表達

使用I-TASSER對MS突變體建模,通過Rossetta的StructureRelax進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,最終獲得的MS構(gòu)象與野生型TGase構(gòu)象RMSD相差為0.813。通過Disulfide by design 2.0對該結(jié)構(gòu)進行二硫鍵突變模擬,結(jié)果給出55組可能形成二硫鍵的突變對。一般認(rèn)為,二硫鍵成鍵自由能在一定程度上影響突變體的熱穩(wěn)定性[19]。基于二硫鍵成鍵自由能的大小,將預(yù)測的55個二硫鍵突變體排序分為6組(表2)。前5組每組包含9個突變體,第6組包含10個突變體。每組抽取2個,共12個二硫鍵突變體(圖1-b),以保證其代表性。

表2 基于成鍵能量對預(yù)測的二硫鍵突變體進行分組

a-突變體pET-22b/TrxA-pro-MS表達框;b-含二硫鍵突變體純化后電泳圖

由于大腸桿菌E.coliBL21不利于二硫鍵的形成,故本研究在構(gòu)建TGase表達框時選擇硫氧還原蛋白TrxA與pro-TGase進行共表達以促進二硫鍵的形成及TGase的正確折疊(圖1-a)。對挑選出的12對突變體進行構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及搖瓶發(fā)酵,對獲得的重組菌胞內(nèi)可溶TGase進行體外活化及鎳柱純化得到TGase純蛋白。SDS-PAGE分析顯示,純化后的TGase蛋白條帶均一(圖1-b)。

2.2 高熱穩(wěn)定型TGase 突變體的初篩及二硫鍵驗證

熱穩(wěn)定性分析顯示,突變體MS于60 ℃水浴處理20 min后殘余酶活力32.9%。對12對突變體進行熱穩(wěn)定性實驗,共有6對突變體殘余酶活力有所升高。其中,突變體D118C-K121C、P244C-E249C和P22C-Q328C殘余酶活力分別為58.36%、56.45%和62.86%,相較于MS分別提升了77.39%、71.58%和91.06%。突變體MS-P244C-E249C和MS-P22C-Q328C的比酶活略有下降(圖2)。

圖2 TGase突變體初始比酶活力及熱處理 (60 ℃ 20 min)后殘余酶活力

對熱穩(wěn)定性提升最明顯的3對突變體,進行二硫鍵還原反應(yīng)測定。結(jié)果如圖3所示,橫坐標(biāo)表示突變體,縱坐標(biāo)表示二硫鍵的數(shù)量,3種突變體均成功形成了分子內(nèi)二硫鍵。后續(xù)實驗中,以熱穩(wěn)定性提升最高的突變體MS-P22C-Q328C為研究對象,研究其穩(wěn)定性提升狀態(tài)、催化效率變化及穩(wěn)定性提升機制。

圖3 突變體二硫鍵測定

2.3 TGase突變體MS-P22C-Q328C酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 突變體MS-P22C-Q328C半衰期和溫度穩(wěn)定性測定

為進一步研究TGase突變體MS-P22C-Q328C的穩(wěn)定性提升效果,進行半衰期及熔解溫度測定。2種蛋白在60 ℃水浴前5 min內(nèi)殘余酶活力下降均比較快,之后殘余酶活力百分比差距逐漸增大(圖4-a)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),突變體MS-P22C-Q328C的t1/2(60 ℃)達到了34.61 min,較MS(11.31 min)提升了2.06倍。差示掃描熱量測定,發(fā)現(xiàn)MS-P22C-Q328C的tm相較于MS提高了1.06 ℃(圖4-b)。

a-TGase突變體的半衰期曲線;b-TGase突變體的熔解溫度曲線

2.3.2 突變體MS-P22C-Q328C酶促反應(yīng)動力學(xué)測定

本研究分別測試了TGase突變體MS及MS-P22C-Q328C的酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)。通過梯度稀釋得到含不同濃度CBZ-Gln-Gly的底物溶液A,測試TGase突變體對不同濃度CBZ-Gln-Gly的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),MS對于低濃度CBZ-Gln-Gly具有較高的轉(zhuǎn)化效果,即Km值較低,而在實際催化效率上,即kcat差距不是很明顯(表3)。結(jié)果表明突變體的底物結(jié)合能力受到了一定的影響。

表3 TGase突變體的酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)測定

2.3.3 突變體MS-P22C-Q328C突變位點分析

基于S.mobaraenesisTGase晶體結(jié)構(gòu),分別構(gòu)建了MS和MS-P22C-Q328C的模擬結(jié)構(gòu)。如圖5所示,MS-P22C-Q328C分子中的二硫鍵位于酶分子長Loop結(jié)構(gòu)上。研究表明,強化蛋白質(zhì)分子的loop區(qū)域的剛性可顯著提高其熱穩(wěn)定性[20]。因此,在突變體MS-P22C-Q328C中,二硫鍵可能限制了Loop環(huán)擺動,從而提高了其熱穩(wěn)定性[21]。值得注意的是,該Loop結(jié)構(gòu)位于底物進入酶分子的通道[1],其剛性的增強可能影響了酶與底物結(jié)合,導(dǎo)致了MS-P22C-Q328C底物親和力和活性的下降的下降(表3)。

a-MS結(jié)構(gòu);b-MS-P22C-Q328C結(jié)構(gòu)

為進一步解釋突變體MS-P22C-Q328C較MS活性下降的原因,以CBZ-Gln-Gly為底物進行對接分析。如圖6-a和圖6-b所示,MS及MS-P22C-Q328C與底物的結(jié)合能分別為-17.96和-17.50 kJ/mol,表明前者較后者與底物結(jié)合更緊密。事實上,MS與CBZ-Gln-Gly對接時CBZ基團指向酶分子的催化三聯(lián)體(C64-D255-H274)(圖6-c)。在MS-P22C-Q328C中,底物分子的CBZ基團則指向催化三聯(lián)體(圖6-d)。因此,MS-P22C-Q328C中二硫鍵可能改變了其底物結(jié)方式,降低了結(jié)合力。

a-MS與底物對接聚類分析;b-MS-P22C-Q328C與底物對接聚類分析;c-MS與底物對接最終構(gòu)象;d-MS-P22C-Q328C與底物對接最終構(gòu)象

2.3.4 突變體MS-P22C-Q328C分子動力學(xué)模擬

分子動力學(xué)模擬作為反映蛋白分子運動的一個重要方法,可以用來解釋蛋白穩(wěn)定性成因、蛋白與底物對接機制等。通過分子動力學(xué)中的升溫動力學(xué)分析TGase突變體在體系中運動的情況,基于MS對突變體MS-P22C-Q328C進行建模,并對兩者同時進行能量最小化處理和熱量平衡。后在330 K條件下進行動力學(xué)模擬10 ns。經(jīng)動力學(xué)模擬后觀察TGase突變體的RMSD變化,發(fā)現(xiàn)突變體MS-P22C-Q328C的RMSD整體變化低于MS,說明其在高溫狀態(tài)下剛性更強,不易于變性(圖7-a)。通過對動力學(xué)模擬過程中,TGase突變體的各氨基酸位移變化分析,發(fā)現(xiàn)突變體MS-P22C-Q328C蛋白中區(qū)域15-32及311-330中氨基酸整體位移降低,即RMSF低于MS(圖7-b)。因此,可以推斷突變氨基酸對P22C-Q328C可有效地提高區(qū)域的剛性程度,從而提高蛋白整體穩(wěn)定性。

a-TGase突變體動力學(xué)模擬過程中RMSD變化曲線;b-TGase突變體動力學(xué)模擬過程中RMSF變化曲線

通過對突變體MS-P22C-Q328C進行的酶學(xué)性質(zhì)測定、分子結(jié)構(gòu)分析及分子動力學(xué)模擬,可以認(rèn)為發(fā)生在突變體MS結(jié)構(gòu)中Loop環(huán)上P22C-Q328C兩處突變形成了二硫鍵,從而在一定程度上提升了TGase的剛性,有效提高了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性,同時保留了大部分的催化活性(MS-P22C-Q328C比酶活力為43.36 U/mg,相比于MS的50.01 U/mg僅降低13.29%)。

3 結(jié)論

為進一步提高TGase的熱穩(wěn)定性,基于高穩(wěn)定性TGase突變體MS構(gòu)建了酶分子內(nèi)二硫鍵,共獲得了3個穩(wěn)定性明顯提升的二硫鍵突變體。60 ℃處理20 min,P244C-E249C、D118C-K121C和P22C-Q328C殘余酶活力分為56.45%,58.36%和62.86%。其中,MS-P22C-Q328C較MSt1/2(60 ℃)提高2.06倍,tm提高1.06 ℃。值得注意的是,P244C-E249C、D118C-K121C和P22C-Q328C成鍵自由能分別為25.16、11.80和14.90 kJ/mol。突變體二硫鍵成鍵自由能大小與蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的相關(guān)性不明顯。

在理性設(shè)計二硫鍵的過程中,除了考慮二硫鍵成鍵自由能的大小,還需要結(jié)合可能形成二硫鍵的突變位點空間位置的距離(即成鍵后側(cè)鏈偏轉(zhuǎn)角度)以及原始氨基酸的柔性[15]。在預(yù)測二硫鍵過程中,成鍵自由能并不是影響突變體熱穩(wěn)定性的主要因素。隨機抽取不同成鍵自由能的二硫鍵突變體進行構(gòu)建后,發(fā)現(xiàn)最終對于TGase穩(wěn)定性提高較明顯的二硫鍵突變體成鍵能適中,后續(xù)的基于構(gòu)建分子內(nèi)二硫鍵提升蛋白穩(wěn)定性過程中還有其他重要因素有待挖掘。