鄭爽 何麗清 儲(chǔ)開博

山西中醫(yī)藥大學(xué) 山西，晉中 030619

小青龍湯是《傷寒論》中治療外寒里飲的經(jīng)典方劑，臨床多用于治療肺系疾病[1]。除此之外，小青龍湯在臨床上也可治療與肺、脾、腎三臟相關(guān)的水液代謝疾病，例如痰飲、水腫、泄瀉等[2]，也有醫(yī)家運(yùn)用小青龍湯治療慢性腎臟疾病的相關(guān)案例[3-4]。

慢性腎小球腎炎（chronic glomerulonephritis，CGN），簡稱慢性腎炎，是臨床常見的慢性腎臟病，以蛋白尿、血尿、水腫等為基本癥狀[5]，具有起病隱匿、病程遷延的特點(diǎn)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚無有效方法根治。CGN在中醫(yī)沒有專門的病名，根據(jù)臨床癥狀的不同，可將其歸為“尿血”“水腫”“痰飲”等范疇，中藥治療歷史悠久，而且效果顯著。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一概念由英國藥理學(xué)家Andrew于2007年提出，是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，通過網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)分析藥物、基因、疾病之間的復(fù)雜關(guān)系。在臨床上面對(duì)復(fù)雜疾病時(shí)，從網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)角度審視藥物的作用能夠?yàn)閷ふ抑委煼椒ㄌ峁┬碌囊暯荹6]。

通過文獻(xiàn)查閱，筆者了解到目前對(duì)于小青龍湯的研究多集中于肺系疾病，有少部分文獻(xiàn)報(bào)道小青龍湯對(duì)CGN具有治療作用，但相關(guān)的臨床以及實(shí)驗(yàn)研究均較少，其藥理作用與作用機(jī)制尚未明確。本文旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，從分子水平上闡明小青龍湯的化合物成分靶點(diǎn)與CGN的疾病靶點(diǎn)之間的潛在關(guān)系，預(yù)測小青龍湯治療CGN的潛在作用靶點(diǎn)，為進(jìn)一步深入研究小青龍湯治療CGN的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 對(duì)象和方法

1.1 小青龍湯化學(xué)成分與靶點(diǎn)的收集 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP） （https://tcmspw.com/tcmsp.php），分別以“麻黃、桂枝、芍藥、干姜、細(xì)辛、半夏、五味子、甘草”為關(guān)鍵詞，檢索小青龍湯組方中藥物的化學(xué)成分。以藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18為篩選條件進(jìn)行篩選，得到小青龍湯的候選化合物以及這些成分所作用的靶點(diǎn)，重復(fù)靶點(diǎn)僅保留1個(gè)。

1.2 小青龍湯治療CGN的潛在靶點(diǎn)的獲取 以“chronic glomerulonephritis”為檢索詞，分別從在線人類孟德爾遺傳（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）數(shù)據(jù)庫、基因組注釋數(shù)據(jù)平臺(tái)（genome annotation database platform，Genecard）中搜索已報(bào)道的CGN的相關(guān)基因，去除重復(fù)基因和假陽性基因，將收集到的基因與上述成分靶點(diǎn)上傳至韋恩圖2.1（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）進(jìn)行匹配分析，得到小青龍湯治療CGN相關(guān)的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 預(yù)測潛在核心成分以及核心靶點(diǎn) 將小青龍湯治療CGN的潛在作用成分與靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。通過軟件分析節(jié)點(diǎn)自由度（Degree），對(duì)各節(jié)點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選出小青龍湯治療CGN的核心成分與核心靶點(diǎn)。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用（protein protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將小青龍湯的核心作用靶點(diǎn)上傳至String 11.0平臺(tái)（https://string-db.org）得到核心靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 潛在作用靶點(diǎn)的通路富集分析 將小青龍湯治療CGN的潛在作用靶點(diǎn)上傳至生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫DAVID（https://david.ncifcrf.gov/），進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號(hào)通路富集分析，GO分析包括生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）。 以P＜0.01為篩選條件篩選GO條目，以P＜0.05為條件篩選KEGG條目，最后將GO和KEGG富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 小青龍湯藥物化合物和靶點(diǎn)的篩選 在TCMSP中檢索小青龍湯中8味中藥的化合物及其對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)，得到1 534種化合物，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18篩選后去掉重復(fù)化學(xué)成分，得到小青龍湯的有效化合物149種，作用靶點(diǎn)288個(gè)。

2.2 小青龍湯治療CGN潛在靶點(diǎn)的獲取 通過數(shù)據(jù)庫檢索，得到CGN相關(guān)基因共有2 425個(gè)。通過與小青龍湯的288個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，篩選出154個(gè)可能與治療CGN相關(guān)的作用靶點(diǎn)。見圖1。

圖1 小青龍湯與CGN靶點(diǎn)的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of Xiaoqinglong Decoction and CGN

2.3 預(yù)測潛在核心成分以及核心靶點(diǎn) 通過Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。見圖2。圖中菱形節(jié)點(diǎn)代表小青龍湯治療CGN的核心化合物，圓形節(jié)點(diǎn)代表小青龍湯治療CGN的核心靶點(diǎn)，顏色深淺表示Degree大小，顏色越深則Degree值越大。以化合物和靶點(diǎn)為節(jié)點(diǎn)（Node），相互關(guān)系為邊（Edge），利用軟件分析各個(gè)節(jié)點(diǎn)的自由度（Degree）進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯A(yù)測小青龍湯治療CGN的核心成分與核心靶點(diǎn)，共篩選出40個(gè)潛在核心成分和40個(gè)潛在核心靶點(diǎn)。部分信息見表1。

表1 部分小青龍湯治療CGN核心化合物及其所對(duì)應(yīng)的核心靶點(diǎn)Tab.1 Some core components and related targets of Xiaoqinglong Decoction Treating CGN

圖2 小青龍湯治療CGN的“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 The component-target network diagram of Xiaoqinglong Decoction and CGN

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將小青龍湯治療CGN的核心靶點(diǎn)導(dǎo)入String 11.0平臺(tái)，在線構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見圖3。網(wǎng)絡(luò)中有40個(gè)節(jié)點(diǎn)發(fā)生相互作用，相互作用的邊有155條，平均自由度（Degree）為7.75。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network diagram

2.5 潛在靶點(diǎn)的GO、KEGG富集分析 將小青龍湯治療CGN的潛在核心靶點(diǎn)導(dǎo)入生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫DAVID 6.7在線進(jìn)行GO富集分析，共獲得GO條目279條，其中BP 275條、CC 31條、MF 46條。 以P＜0.01為條件進(jìn)行篩選，對(duì)前10項(xiàng)進(jìn)行可視化。見圖4。小青龍湯治療CGN涉及血管生成、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的正調(diào)控、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路、類固醇激素受體活性、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1（extracellular regulated protein kinases 1，ERK1）和ERK2級(jí)聯(lián)的正調(diào)控等過程。

圖4 GO功能分析可視化結(jié)果Fig.4 Visualization result of GO

將小青龍湯治療CGN的潛在核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.7進(jìn)行KEGG通路富集分析，得到KEGG通路條目89條，以P＜0.05為條件，對(duì)前25條通路進(jìn)行可視化分析。見圖5。KEGG通路富集分析結(jié)果中包括血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶 B （phosphatidylinositide 3-kinases-protein kinase B，PI3K-Akt）信號(hào)通路和Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）信號(hào)通路等，說明小青龍湯治療CGN的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)這些信號(hào)通路相關(guān)。

圖5 KEGG通路富集分析可視化結(jié)果Fig.5 Visualization result of KEGG pathway

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為CGN的病位主要在肺脾腎三臟。脾主運(yùn)化，脾氣虧虛，則不能運(yùn)化水濕；腎主水，腎氣虧虛，則不能氣化水濕、宣通水氣。根據(jù)五行生克的原理，肺屬金能生水，為腎水之母，子病治母是中醫(yī)的治法之一；且肺主氣行治節(jié)，明代張介賓[7]認(rèn)為，水腫“蓋水為至陰，故其本在腎；水化于氣，故其標(biāo)在肺”。肺主宣發(fā)肅降，能夠肅降水液，下輸至腎與膀胱，肺失宣降導(dǎo)致氣機(jī)不調(diào)，精微不升，出現(xiàn)蛋白尿和尿血等癥狀。CGN在中醫(yī)屬“尿血”“水腫”“痰飲”等范疇，《金匱要略》中提出“痰飲”“水腫”可通過發(fā)汗、利尿等方法治療。小青龍湯主治外寒里飲證，以麻黃、桂枝為君，發(fā)

汗散寒解表、溫陽化氣，以化腎水；細(xì)辛、干姜為臣，助麻桂解表的同時(shí)亦能溫腎行水；白芍五味子味酸收斂，以免辛散肺氣太過，亦為臣；半夏為使，降氣散水飲；甘草為佐使，益氣和中、調(diào)和諸藥。故CGN辨證外寒里飲兼有水腫時(shí)，可用小青龍湯治療。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度分析，CGN合并感染，誘發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，日久造成腎損傷，引發(fā)或加重CGN[8]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，小青龍湯治療CGN寒飲蘊(yùn)肺證大鼠，能夠降低大鼠尿蛋白水平，保護(hù)腎功能，防止腎組織病理變化，故小青龍湯治療CGN有充足的理論依據(jù)[9]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種通過綜合分析和篩選各種基因、蛋白、藥物數(shù)據(jù)庫，利用網(wǎng)絡(luò)分析軟件構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)揭示三者之間關(guān)聯(lián)的藥理研究方法[10]。中藥治療CGN所具有的整體性、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，適合應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進(jìn)行研究，因此本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探討了小青龍湯治療CGN的潛在作用機(jī)制。

本研究通過構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，找到了小青龍湯治療CGN的潛在核心化合物，這些化合物均能作用于多個(gè)靶點(diǎn)，包括槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、 豆甾醇 （stigmasterol）、β-谷甾醇 （βsitosterol）、柚皮素（naringenin）、木犀草素（luteolin）、黃芩苷（baicalein）、卡維?。–avidine）、隱品堿（cryptopin）、花旗松素（taxifolin）等。其中β-谷甾醇為麻黃、桂枝、白芍、干姜、半夏的活性成分，山奈酚在麻黃、白芍、細(xì)辛、甘草中均有分布，豆甾醇在麻黃、半夏中分布，兒茶素在麻黃、桂枝、白芍中分布，花旗松素為麻黃、桂枝的活性成分，可以看出君藥麻黃、桂枝中含有多種相同的化合物，由此筆者認(rèn)為麻黃、桂枝解表散寒、溫化陽氣的功效可能與這些化合物有關(guān)。槲皮素是一種黃酮醇類化合物，其作用機(jī)制可能是通過抑制表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）磷酸化激活過程，進(jìn)而抑制其下游蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（protein kinase B/mammalian target of rapamycin，AKT/mTOR）通路的信號(hào)傳導(dǎo)，同時(shí)抑制該通路下游的增殖相關(guān)基因VEGF[11]。實(shí)驗(yàn)研究表明，槲皮素能夠減輕高糖條件下人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[12]，也能夠減輕放射性對(duì)比劑引起的腎損傷，起到保護(hù)腎臟的作用[13]。山奈酚也被證實(shí)能夠抑制人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡[14]。β-谷甾醇可能通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1） 和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB） 失活，從而發(fā)揮抗炎作用[15]。柚皮素則通過抑制半胱天冬酶-3（caspase-3，CASP3）等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制腎小球系膜細(xì)胞凋亡[16]。木犀草素能夠減輕單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟的炎癥反應(yīng)，改善腎功能[17]。黃芩苷可能通過調(diào)控TLR2/4信號(hào)通路和線粒體應(yīng)激，抑制促炎反應(yīng)和線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而減輕腎臟缺血再灌注造成的損傷[18]。綜合分析提示，小青龍湯通過各組成藥物之間的協(xié)同作用，多靶點(diǎn)而并非單一靶點(diǎn)治療CGN，其核心成分能夠通過調(diào)節(jié)相關(guān)通路，從而減輕腎臟炎癥反應(yīng)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，緩解腎損傷。

通過分析PPI網(wǎng)絡(luò)以及“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)一步確定了40個(gè)核心靶點(diǎn)，包括前列腺素G/H合酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、CASP3、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase 2，NOS2）、雄激素受體（androgen receptor，AR）、絲裂原活化蛋白激酶14（mitogenactivated protein kinase 14，MAPK14）。 PTGS2也被稱為環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase，COX-2）。 研究證實(shí)，COX-2是前列腺素合成的關(guān)鍵誘導(dǎo)酶，參與炎癥反應(yīng)、血管緊張度維持、電解質(zhì)平衡和腎素釋放過程，且與蛋白尿誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷有關(guān)[19]。Yang等[20]研究證實(shí)，CASP3能夠?qū)δI纖維化以及微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡起到調(diào)節(jié)作用。腎小球系膜細(xì)胞的增殖失控是腎臟疾病的共同特征，ESR1作為樞紐蛋白在腎小球膜細(xì)胞增殖中具有重要作用，目前被認(rèn)為是腎臟疾病的潛在靶標(biāo)之一[21]。AR在許多細(xì)胞和組織中廣泛表達(dá)，研究表明AR可能通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子/缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子-2α（vascular endothelial growth factor/hypoxia-inducible transcription factor-2α，VEGF/HIF-2α）信號(hào)通路的信號(hào)傳導(dǎo)來促進(jìn)腎癌細(xì)胞遷移[22]。MAPK14參與多種信號(hào)通路的過程，與細(xì)胞增殖分化以及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。研究表明，MAPK14在腎小管細(xì)胞炎癥和增殖反應(yīng)的調(diào)節(jié)中具有重要作用，通過促進(jìn)炎癥和細(xì)胞死亡，導(dǎo)致急性腎損傷[23]。

GO及KEGG富集分析結(jié)果顯示，小青龍湯治療CGN主要涉及血管生成、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的正調(diào)控、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路、類固醇激素受體活性、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶的正調(diào)控等過程，參與調(diào)控的信號(hào)通路包括VEGF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路和TLR信號(hào)通路，表明小青龍湯的多種活性化合物通過參與調(diào)控多種信號(hào)通路，協(xié)同發(fā)揮療效。VEGF信號(hào)通路通過抑制足細(xì)胞中VEGF和Nephrin蛋白的表達(dá)，造成蛋白尿[24]。抑制HIF-1信號(hào)通路能夠改善腎間質(zhì)纖維化大鼠腎功能，緩解腎組織腎小球硬化[25]。TNF信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路則能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[26]。

綜上所述，本次研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)化、可視化的特征，初步研究小青龍湯治療CGN潛在的作用機(jī)制，找到了其治療機(jī)制中的核心化合物與核心靶點(diǎn)，分析了相關(guān)生物過程和信號(hào)通路，但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于數(shù)據(jù)庫的綜合分析和篩選，并未進(jìn)行實(shí)際的實(shí)驗(yàn)研究，故本研究的結(jié)論仍需要進(jìn)一步的體外和體內(nèi)研究加以證明。