陳盛業(yè) 甘宇

沈陽市第七人民醫(yī)院 沈陽 110000

糖尿病足（diabetic foot，DF）是糖尿病常見而嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥，由于周圍神經(jīng)病變、外周血管疾病、合并細(xì)菌感染等多種因素，引起足部軟組織及骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)的破壞與畸形[1-2]，表現(xiàn)為患處缺血、感染、壞疽，可并發(fā)潰瘍、骨髓炎、Charcot關(guān)節(jié)病等[3-5]。目前臨床對于DF的治療原則為控制血糖、抗感染和手術(shù)治療[6-8]，但在臨床很多患者伴有其他合并癥，不符合手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致治療方法局限，影響治療效果。

DF可歸屬于中醫(yī)“脫疽”或“筋疽”范疇?！动兛菩牡眉吩疲骸拔┳惚扯嘟钌俟牵馍倨け　舫跗鸷疅嶙鲊I，堅硬紅腫，疼痛作膿者，屬濕熱，為可治。”[9]當(dāng)代醫(yī)家奚九一將DF分為急性發(fā)作期、好轉(zhuǎn)緩解期和恢復(fù)期三期，急性發(fā)作期患足漫腫灼熱伴全身發(fā)熱，常辨為濕熱證或濕毒證，應(yīng)用清熱利濕解毒之清法治療效果佳[10-11]。糖足1號方由沈陽市第七人民醫(yī)院自備，為《千金翼》中三黃湯基礎(chǔ)上加入苦參而成，功效重在清熱燥濕。研究證實，三黃湯能夠提高DF患者保肢率，緩解潰瘍癥狀，促進(jìn)創(chuàng)面愈合[12]。本文針對本方的分子作用機制進(jìn)行研究，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法對方中藥物的化學(xué)成分進(jìn)行篩選，探求其治療DF的靶點及信號通路，并以動物實驗進(jìn)行驗證，為進(jìn)一步研究驗方的作用機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 糖足1號方有效化學(xué)成分篩選 糖足1號方由黃芩、黃連、黃柏、苦參4味中藥組成。登錄中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php），分別對以上4味中藥的有效成分進(jìn)行查詢，檢索標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為口服生物利用度 （oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18。 OB是指藥物被吸收進(jìn)入人體循環(huán)的速度與程度；DL為類藥性，反映化合物中的特定功能基團(tuán)與已知藥物的相似性，二者對中藥化學(xué)成分活性的評估具有重要意義。

1.2 糖足1號方與DF的共同靶點篩選 應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫找出糖足1號方中關(guān)鍵化學(xué)成分所對應(yīng)的靶點蛋白，通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）進(jìn)行靶點蛋白-人類基因名稱轉(zhuǎn)換，使用基因組注釋數(shù)據(jù) 庫 平 臺（genome annotation database platform，GeneCards）（https://www.genecards.org/）搜索DF所對應(yīng)的疾病靶點基因，將搜索到的靶點基因與藥物靶點進(jìn)行一一映射，得到藥物-疾病靶點基因及與之對應(yīng)的關(guān)鍵化學(xué)成分。

1.3 化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將藥物關(guān)鍵化學(xué)成分與疾病的共同靶點基因整理成為基因列表、化合物列表、網(wǎng)絡(luò)關(guān)系等文件，將上述文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，進(jìn)行圖像可視化處理，將關(guān)鍵化學(xué)成分與共同靶點基因之間的關(guān)系以網(wǎng)絡(luò)圖的形式呈現(xiàn)出來。

1.4 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將糖足1號方與DF的共同靶點蛋白輸入String數(shù)據(jù)庫平臺（https://string-db.org/Version 10.5），選擇研究物種為人類（Homo sapiens），設(shè)置PPI評分＞0.4，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，其中不同顏色代表不同證據(jù)關(guān)系。下載PPI關(guān)系圖和關(guān)系數(shù)據(jù)，篩選出前15位的PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因。

1.5 基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析 通過Bioconductor數(shù)據(jù)庫（http://bioconductor.org/bioc Lite.R）查詢藥物-疾病共同靶點基因的基因身份（identification，ID）。安裝Bioconductor平臺相關(guān)安裝包，設(shè)置P=0.05，q=0.05，進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析，輸出結(jié)果并繪制柱狀圖，再運用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對接 通過有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（PubChem）中的標(biāo)識符（identifier from database of chemical，CID）下載關(guān)鍵化學(xué)成分結(jié)構(gòu)，并通過Chemdraw軟件對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行3D優(yōu)化。通過程序數(shù)據(jù)庫（Program Database File，PDB） （http://www.rcsb.org/）下載靶蛋白的結(jié)構(gòu)，并使用PyMOL軟件進(jìn)行常規(guī)預(yù)處理，隨后使用AutoDock軟件進(jìn)行分子對接，對接參數(shù)均為默認(rèn)值。

1.7 驗證性實驗

1.7.1 實驗動物及分組 30只無特定病原體（specified pathogen free，SPF）級健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號碼：SCXK （遼）2015-0001]，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[實驗動物使用許可證號碼：SYXK（遼）2013-0009]。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法隨機分為3組，每組10只，分別為正常組、模型組、中藥組。需要造模的大鼠（模型組、中藥組）采用高脂飼料喂養(yǎng)2個月，禁食16h后，以45mg·kg-1的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），STZ以0.1mol·L-1、pH為4.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配成10mg·mL-1溶液；正常組以普通飼料喂養(yǎng)2個月，腹腔注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。1周后造模組剔除無多飲、多尿表現(xiàn)，體質(zhì)量無明顯減少，空腹血糖＜16.7mmol·L-1的大鼠。糖尿病造模完成2周后，行股動脈多普勒超聲檢測。選擇造模組中出現(xiàn)動脈粥樣硬化改變的大鼠與正常組大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉50mg·kg-1麻醉，足背部消毒后以印章作3mm×7mm的矩形標(biāo)記，切除其全層皮膚，每天用0.5%碘伏消毒創(chuàng)面。將造模組大鼠分為中藥組和模型組，中藥組大鼠給予糖足1號方藥膏擦涂足背創(chuàng)面，2次/d，共4周；模型組和正常組大鼠不予干預(yù)，觀察4周。

1.7.2 檢測指標(biāo) 各組均于腹腔注射后3、7、14、21d進(jìn)行血糖測定，記錄體質(zhì)量、平均飲水量，觀察墊料濕度粗測尿量；STZ注射后第21天兩組（模型組、中藥組）行雙側(cè)股動脈多普勒檢測，記錄兩組潰瘍愈合時間；潰瘍形成后第10天兩組各隨機選擇1只大鼠，腹主動脈取血，并切取大鼠足背部病變及周圍全層皮膚，以酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測大鼠白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferatoractivated receptor gamma，PPARG）、蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用±s表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖足1號方的有效化學(xué)成分 糖足1號方由黃芩、黃連、黃柏、苦參組成，通過OB≥30%、DL≥0.18標(biāo)準(zhǔn)對各藥物的化學(xué)成分進(jìn)行篩選，共得到132個有效化學(xué)成分，其中黃芩36個、黃連14個、黃柏37個、苦參45個。見表1。

表1-1 糖足1號方的有效化學(xué)成分Tab.1-1 The active chemical composition of Tangzu No.1 prescription

表1-2 糖足1號方的有效化學(xué)成分Tab.1-2 The active chemical composition of Tangzu No.1 prescription

2.2 藥物-疾病共同靶點 打開GeneCards和在線人類孟德爾遺傳（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）數(shù)據(jù)庫，輸入“diabetic foot”，得到疾病靶點基因，篩選出評分≥20的靶點基因共225個，將其與藥物靶點基因進(jìn)行對應(yīng)，得到藥物-疾病共同靶點基因共29個；將共同靶點與藥物有效化學(xué)成分進(jìn)行對應(yīng)，得到糖足1號方治療DF的關(guān)鍵化學(xué)成分共33個。見表2。

表2 藥物-疾病共同靶點基因Tab.2 Drug-disease common target genes

2.3 關(guān)鍵化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 應(yīng)用Cytoscape 3.7.2軟件將藥物-關(guān)鍵化學(xué)成分-疾病-靶點基因網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理。圖中矩陣代表靶點，圓圈代表化合物，其中不同顏色代表化合物來源于不同的藥物。其中藥物活性成分以“degree”表示，排名前5的關(guān)鍵化學(xué)成分為槲皮素（quercetin，MOL000098，degree=28）、漢黃芩素 （wogonin，MOL000173，degree=7）、 黃芩素（baicalein，MOL002714，degree=7）、 脫氫丹參酮ⅡA（dehydrotanshinone Ⅱ A，MOL002651，degree=3）、吳茱萸次堿（rutaecarpine，MOL002662，degree=3）。 見圖1。

圖1 關(guān)鍵化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.1 The key chemical component-target network

2.4 PPI分析 打開String數(shù)據(jù)庫平臺，導(dǎo)入29個共同靶點基因，選擇研究物種為人類，獲取PPI，選擇評分＞0.4的蛋白關(guān)系，并繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見圖2。該網(wǎng)絡(luò)包括29個節(jié)點，226條邊，其中評分≥0.99的互作蛋白為AKT1-NOS3、IGF2-IGFBP3、IL-6-IL-4、CAV1-NOS3、VEGFA-NOS3、IL-1β-CCL2，這些蛋白之間的相互作用在網(wǎng)絡(luò)中非常重要。通過計算每個基因連接節(jié)點的數(shù)目，找出前10個PPI核心基因，分別為AKT1、IL-6、PPARG、NOS3、MMP9、CCL2、VEGFA、MMP2、SERPINE1、ICAM1，這些即為糖足1號方治療DF的核心基因。見圖2、3。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network

圖3 PPI核心基因Fig.3 PPI core genes

2.5 GO功能富集分析 GO由生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3部分組成。富集到的BP包括白細(xì)胞與細(xì)胞黏附的正調(diào)控（positive regulation of leukocyte cell-cell adhesion）、脂多糖應(yīng)答（response to lipopolysaccharide）、白細(xì)胞與細(xì)胞黏附（leukocyte cellcell adhesion）等。見圖4。富集到的CC包括膜筏（membrane raft）、 膜微區(qū)（membrane microdomain）、膜區(qū)（membrane region）等。見圖5。富集到的MF包括細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、細(xì)胞因子活性（cytokine activity）、整合素蛋白結(jié)合（integrin binding）等。 見圖6。

圖4 糖足1號方主要作用靶點BP條形圖Fig.4 The barplot chart of BP of Tangzu No.1 prescription

圖5 糖足1號方主要作用靶點CC條形圖Fig.5 The barplot chart of CC of Tangzu No.1 prescription

圖6 糖足1號方主要作用靶點MF條形圖Fig.6 The barplot chart of MF of Tangzu No.1 prescription

2.6 KEGG通路富集分析 對藥物-疾病重合靶點進(jìn)行KEGG通路富集分析，主要富集的通路包括晚期糖基化終產(chǎn)物-晚期糖基化終產(chǎn)物受體信號通路（advanced glycation end-receptor of advanced glycation end products signaling pathway，AGE-RAGE signaling pathway）、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、腫瘤壞死因子信號通路（tumor necrosis factor signaling pathway，TNF signaling pathway）、瘧疾（malaria）等。 見圖7。

圖7 糖足1號方KEGG通路富集分析條形圖Fig.7 The barplot chart of KEGG pathway enrichment analysis of Tangzu No.1 prescription

2.7 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將得到的藥物-疾病共同靶點和KEGG通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，以繪制網(wǎng)絡(luò)圖，以節(jié)點間的連線數(shù)量確定degree，節(jié)點的形狀越大表示富集越顯著，得到網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點為IL-1β、IL-6、AKT1、FOS、CCL2等。 見圖8。

圖8 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)Fig.8 Target-pathway network

2.8 分子對接 本研究采用排名前3位的關(guān)鍵化學(xué)成分槲皮素（quercetin，MOL000098）、 漢黃芩素（wogonin，MOL000173）、黃芩 素 （baicalein，MOL002714）與PPI核心基因AKT1、IL-6、PPARG分別進(jìn)行對接。見圖9。結(jié)果表明，槲皮素、漢黃芩素、黃芩素與AKT1、IL-6、PPARG的結(jié)合能均低于-5.0kJ·mol-1，表明這些成分與靶點的結(jié)合能力較強，可能是糖足1號方治療DF的關(guān)鍵化學(xué)成分。

圖9 結(jié)合能最低的關(guān)鍵化學(xué)成分-靶點作用模式Fig.9 Interaction between key chemical components-target in lowest docking energy mode

2.9 驗證性研究結(jié)果 與正常組比較，模型組血清IL-6、IL-1β水平明顯升高，創(chuàng)面組織中的PPARG水平明顯下降，AKT1水平明顯上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組血清IL-6、IL-1β水平顯著降低，創(chuàng)面組織PPARG水平明顯上升，AKT1水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清IL-6、IL-1β和創(chuàng)面組織AKT1、PPARG含量的比較Tab.3 Comparison of serum IL-6，IL-1β and wound tissue AKT1 and PPARG levels in each group

3 討論

由于糖尿病發(fā)病率的逐年增加，DF的發(fā)病也有增高趨勢，若不能得到及時治療，DF病情加重會引發(fā)患者致殘、生活能力喪失的風(fēng)險，同時給患者帶來抑郁情緒，嚴(yán)重者危及生命[13]。中醫(yī)古籍中雖無DF這一病名，但早在《靈樞·癰疽篇》就有記載：“發(fā)于足趾，名曰脫疽，其狀赤黑，死不治；不赤黑不死，不衰急斬之，不則死矣?！惫蕦⑵錃w屬于“脫疽”范疇。糖足1號方重用清熱燥濕、瀉火解毒之黃芩、黃連、黃柏、苦參，治療DF臨床療效顯著，故本文進(jìn)一步對其分子機制進(jìn)行探討。

本研究發(fā)現(xiàn)，糖足1號方所含的槲皮素、漢黃芩素、黃芩素、脫氫丹參酮ⅡA、吳茱萸次堿等化學(xué)成分與靶點基因匹配的自由度較高。槲皮素是一種生物類黃酮，在體內(nèi)具有消炎和抗氧化保護(hù)作用，能夠促進(jìn)人體膠原蛋白和纖連蛋白的生成，促進(jìn)關(guān)節(jié)和皮膚創(chuàng)口的愈合，對神經(jīng)組織損傷亦有修復(fù)作用，同時能促進(jìn)全身毛細(xì)血管血液循環(huán)；還有研究證實其具有捕獲自由基，防止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的作用，在抗炎、防治糖尿病并發(fā)癥方面藥理作用較強[14-15]。漢黃芩素具有多種藥理活性，包括抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)等，此外還具有抗癌和利尿作用[16]。黃芩素具有明顯的抗炎、抗菌、解熱作用，對于葡萄球菌、肺炎雙球菌、綠膿桿菌等均有明顯抑制作用，且對多種皮膚致病性真菌抑制力較強；此外還具有抗變態(tài)反應(yīng)、利尿、抗過敏等作用[17-18]。丹參酮ⅡA能夠改善冠狀動脈血液循環(huán)，常被用于糖尿病血管并發(fā)癥的防治中；研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA還能夠清除氧自由基，抑制組胺形成，保護(hù)血管內(nèi)皮[19-20]。吳茱萸次堿能夠抑制活性氧產(chǎn)生和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶激活，體現(xiàn)出較強的抗炎作用；有研究發(fā)現(xiàn)，吳茱萸次堿能抑制金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等細(xì)菌的生長，同時具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的功能[21-22]。

本研究得到的核心基因包括AKT1、IL-1β、IL-6、PPARG、NOS3、MMP9、CCL2等。AKT1是AKT家族成員之一，調(diào)節(jié)包括細(xì)胞代謝、增殖、存活和血管生成等許多生物學(xué)過程，對葡萄糖的攝取具有調(diào)節(jié)作用[23]。IL-1β是強有力的促炎細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)前列腺素合成、T細(xì)胞活化和細(xì)胞因子產(chǎn)生、B細(xì)胞活化和抗體產(chǎn)生以及成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白產(chǎn)生[24]。IL-6是急性期炎癥反應(yīng)的有效誘導(dǎo)劑，在B細(xì)胞最終分化為漿細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，同時參與淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的分化；還能夠能起到增加脂肪分解和改善胰島素抵抗的作用[25]。PPARG能控制脂肪酸的過氧化物酶體β-氧化途徑，是脂肪細(xì)胞分化和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[26]。NOS3屬于一氧化氮合酶，能夠作用于內(nèi)皮細(xì)胞，參與血管平滑肌松弛、血小板激活、血液凝固的過程[27]。MMP9在細(xì)胞外基質(zhì)的局部水解和白細(xì)胞遷移中起著重要作用，還可能參與破骨細(xì)胞的吸收[28]。CCL2趨化因子屬于內(nèi)分泌β家族，可以吸引單核細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞，但對中性粒細(xì)胞或嗜酸性粒細(xì)胞不具有趨化作用[29]。

富集的KEGG信號通路包括AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、TNF信號通路等。AGE-RAGE信號通路能激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB），引起大量黏附分子、促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞和組織損傷，與DF的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[30]。流體剪切應(yīng)力具有抗血小板聚集的作用，還能刺激抑制凝血級聯(lián)反應(yīng)因子的釋放[31]。TNF信號通路可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，亦與抑制細(xì)胞增殖、抗感染和調(diào)節(jié)免疫等作用密切相關(guān)[32]。與上述信號通路匹配自由度較高的基因為IL-1β、IL-6、AKT1、FOS、CCL2等，可見糖足1號方可通過以上靶點蛋白作用于相關(guān)信號通路，發(fā)揮抗炎、抗菌、促進(jìn)組織修復(fù)的作用。

進(jìn)一步進(jìn)行驗證性實驗發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的血清IL-6、IL-1β水平明顯高于正常組，說明IL-6、IL-1β參與了疾病的發(fā)生發(fā)展；而中藥組血清IL-6、IL-1β水平顯著低于模型組，提示糖足1號方能顯著降低血清IL-6、IL-1β水平，減輕DF大鼠的炎癥反應(yīng)。實驗中模型組創(chuàng)面組織的PPARG水平明顯降低，AKT1水平明顯升高；而中藥組創(chuàng)面組織的PPARG水平顯著高于模型組，AKT1水平明顯低于模型組，提示糖足1號方可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、改善細(xì)胞生長和血管生成促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

綜上所述，糖足1號方可通過槲皮素、漢黃芩素、黃芩素、脫氫丹參酮ⅡA等多種有效成分，作用于AKT1、IL-1β、IL-6等多個基因靶點，由AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、TNF信號通路等多個信號通路參與的復(fù)雜作用機制發(fā)揮治療DF的作用。本研究通過若干數(shù)據(jù)庫信息進(jìn)行的挖掘分析，對DF的發(fā)病機制及用藥靶點進(jìn)行了預(yù)測，并進(jìn)行了小樣本的動物實驗驗證，但驗證性實驗僅選取了具有代表性的指標(biāo)，并且未進(jìn)行臨床實驗，未來仍需進(jìn)一步進(jìn)行動物實驗與臨床實驗進(jìn)一步探究糖足1號方的作用機制。