高鵬 周鳳蕊 劉俊華 李廣明

鄭州市第六人民醫(yī)院 鄭州 450015

自身免疫性肝炎 （autoimmune hepatitis，AIH）是由于機(jī)體自身免疫反應(yīng)攻擊肝組織所致的非病毒性、藥物性或酒精性肝病。AIH病程遷延，治療難度大，如延誤治療可發(fā)展為肝硬化、肝衰竭，導(dǎo)致門(mén)脈高壓與肝功能不全[1]。目前AIH治療以糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑為主，可在一定程度上改善生化指標(biāo)、減輕肝臟炎癥，防止肝損傷，但患者容易產(chǎn)生耐藥性，且藥物毒副作用大，停藥后面臨著較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。近年來(lái)，中草藥在改善AIH癥狀及延緩病情發(fā)展方面表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢(shì)，大批基礎(chǔ)研究致力于挖掘中藥及其提取物在AIH治療方面的作用。刺五加多糖（A-canthopanacis senticosi polysaccharides，ASPS）提取自五加科植物刺五加，具有誘導(dǎo)干擾素生成、抗氧化、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等作用[4]。既往研究表明，ASPS可改善小鼠鎮(zhèn)痛模型炎癥狀況，調(diào)節(jié)免疫器官指數(shù)及免疫細(xì)胞因子水平，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[5]，但目前關(guān)于其對(duì)AIH的治療作用及相關(guān)機(jī)制研究尚少。鑒于此，本研究通過(guò)建立AIH小鼠模型，研究ASPS對(duì)AIH肝損傷的改善作用并探討相關(guān)機(jī)制，為ASPS應(yīng)用于AIH的臨床治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)雄性C57BL/6小鼠120只，體質(zhì)量（18±1）g，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)碼：SCXK（京）2019-0011]。所有小鼠所處環(huán)境溫度20～25℃，通風(fēng)良好，飼養(yǎng)于河南中檢檢測(cè)技術(shù)有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)碼：SYXK（豫）2018-0006]。

1.2 藥物、主要試劑和儀器 ASPS購(gòu)于西安首禾生物科技有限公司（批號(hào)：SH-01-05）；潑尼松龍購(gòu)于華潤(rùn)紫竹藥業(yè)有限公司（國(guó)藥準(zhǔn)字：H11020374）；弗氏完全佐劑購(gòu)于美國(guó)Chondrex公司（批號(hào)：7008）；卡介苗購(gòu)于陜西醫(yī)藥控股集團(tuán)生物制品有限公司（國(guó)藥準(zhǔn)字：S10960096）；天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司（批號(hào)：YE01915）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海澤葉生物科技有限公司 （批號(hào)：ZY-ALT-Mu）；白介素-22（interleukin-22，IL-22）酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司 （批號(hào)：M2200）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒均購(gòu)于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司（批號(hào)：E-EL-R0019c、E-ELR0015c）；Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）多抗、髓樣細(xì)胞分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）單抗均購(gòu)于武漢菲恩生物科技有限公司（批號(hào)：FNab08727、FNab09835）； 核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、磷酸化核因子-κB（phosphorylation-nuclear factor-κB，p-NF-κB）單抗均購(gòu)于武漢益普生物科技有限公司（批號(hào)：ATA33868、ATA33869）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)于上海研卉生物科技有限公司（批號(hào)：E030120）。

UniCel DxC 800全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)于美國(guó)Beckman Coulter有限公司；Synergy H4全功能酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Bio Tek公司；Cytomics FC 500流式細(xì)胞儀為美國(guó)Beckman Coulter有限公司產(chǎn)品；DSX100光學(xué)顯微鏡購(gòu)于日本奧林巴斯株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 模型建立及分組 參照文獻(xiàn)[6]建立小鼠AIH模型。選取C57BL/6小鼠60只，頸椎脫臼處死，分離肝臟，剪碎肝組織，以0.9%氯化鈉溶液洗去血液，3 000r/min離心20min，離心半徑12cm，采用瓊脂糖凝膠6B分離上清液，收集第一峰，即獲取肝特異性膜脂蛋白（liver specific membrane lipoprotein，LSP）。 采用0.9%氯化鈉溶液將LSP稀釋至25g·L-1，每次免疫時(shí)將其與弗氏完全佐劑等比例混合，充分研磨至乳白色后，滴加5mg·mL-1卡介苗繼續(xù)研磨。取C57BL/6小鼠50只，采用新鮮制備的免疫劑腹腔注射，0.2mL/次，1次/周，共注射4次。尾靜脈采血1mL，離心后采用間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence，IIF）檢測(cè)小鼠血清中抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）、抗平滑肌抗體（smooth muscle antibody，SMA）水平，以?xún)烧呔鶠殛?yáng)性為建模成功的標(biāo)準(zhǔn)。ANA陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：以Hep-2細(xì)胞為抗原包被，分裂間期細(xì)胞核可觀察到均勻熒光，分裂期細(xì)胞濃縮染色體可觀察到更強(qiáng)的均勻熒光。SMA陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：小鼠平滑肌細(xì)胞可觀察到為明亮的黃綠色熒光。將42只建模成功的小鼠隨機(jī)分為AIH組（10只）、ASPS低劑量組（10只）、ASPS高劑量組（11只）、潑尼松龍組（11只）。其余10只小鼠不進(jìn)行處理，設(shè)為健康組。

1.3.2 干預(yù)方式 末次免疫注射后第2天，ASPS低、高劑量組分別以50、100mg·kg-1的ASPS （溶于0.9%氯化鈉溶液5mL中）灌胃[7]，1次/d；潑尼松龍組采用潑尼松龍9mg·kg-1（溶于0.9%氯化鈉溶液5mL中）灌胃，1次/d；健康組與AIH組均等量0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d。各組均連續(xù)干預(yù)7d。

1.3.3 取材方式 取材前晚禁食，末次給藥后4h，各組小鼠尾靜脈采血1mL，其中0.5mL新鮮血液用于外周血Th22細(xì)胞水平檢測(cè)，其余0.5mL經(jīng)3 500r/min離心15min，離心半徑12cm，分離血清冰箱保存。取血后小鼠脫頸處死，冰盤(pán)上分離肝組織，冷凍保存用于后續(xù)研究。

1.3.4 血清AST、ALT水平檢測(cè) 取冰箱保存的血清，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清AST、ALT水平，根據(jù)小鼠AST、ALT試劑盒說(shuō)明書(shū)要求嚴(yán)格設(shè)計(jì)檢測(cè)步驟。

1.3.5 血清IL-22、TNF-α、IL-6水平檢測(cè) 取冰箱保存的血清，采用ELISA法檢測(cè)血清IL-22、TNF-α、IL-6水平，嚴(yán)格按照小鼠IL-22、TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm波長(zhǎng)處吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度和吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-22、TNF-α、IL-6水平。

1.3.6 外周血Th22細(xì)胞水平檢測(cè) 取新鮮血液1mL，加入淋巴細(xì)胞分離液后離心，制備成單個(gè)核細(xì)胞懸液，離心后經(jīng)磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）重懸，每管取100μL，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為2×105個(gè)/管，每管中加入異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate isomer，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的抗CD4抗體1.5μL及別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，APC）標(biāo)記的抗IL-22抗體1.5μL，4℃避光孵育25min，PBS洗滌。破膜后以陰性對(duì)照管設(shè)門(mén)，以多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th22細(xì)胞占比。

1.3.7 肝組織病理變化觀察 取約5mm×5mm×5mm大小冷凍保存的肝組織，40%中性甲醛固定，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，烘干后二甲苯脫蠟、乙醇水化，HE染色，中性樹(shù)脂封片，光鏡下觀察肝組織病理變化。

1.3.8 肝組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表達(dá)檢測(cè) 取冷凍保存的肝組織40mg，充分研磨后移至離心管，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解30min，12 000r/min離心15min，離心半徑8cm，蛋白定量后取40μg待檢測(cè)樣本與上樣緩沖液混合，100℃水浴5min，12 000r/min離心15min，離心半徑8m，取上清液，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，加入兔抗鼠TLR4多抗，MyD88、p-NF-κB p65、NF-κB p65單抗（稀釋比例均為1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜，含有Tween的Tris緩沖鹽溶液（Tris-buffered saline and 0.1%Tween-20，TBST）洗膜3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例1∶8 000），室溫孵育2h，TBST洗滌3次，加入顯色劑暗室中曝光、顯影，以凝膠成像系統(tǒng)掃描、分析灰度值，以目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參β-actin條帶灰度值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量，并計(jì)算p-NF-κB p65/NF-κB p65的比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，多樣本資料組間比較采用單因素方差分析，如Levene檢驗(yàn)方差齊，采用單因素方差分析比較總均值，再用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）-t進(jìn)行兩兩比較；如Levene檢驗(yàn)方差不齊，改用welch檢驗(yàn)比較總體均值，再用Dunnett T3檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況比較 健康組小鼠飲食正常、動(dòng)作敏捷，毛發(fā)黑亮有光澤；AIH小鼠食欲不振、行動(dòng)遲緩、精神不佳，喜弓背，毛發(fā)粗亂無(wú)光澤。見(jiàn)圖1。

圖1 健康組和AIH組小鼠外觀比較Fig.1 Comparison of appearance in healthy group and AIH group

2.2 各組小鼠血清AST、ALT水平比較 各組間總體比較，血清AST、ALT水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。與健康組比較，AIH組、ASPS低、高劑量組和潑尼松龍組血清AST、ALT水平均升高（P＜0.05）；與AIH組比較，ASPS低、高劑量組和潑尼松龍組血清AST、ALT水平均降低（P＜0.05）；與ASPS低劑量組比較，ASPS高劑量組和潑尼松龍組血清AST、ALT水平均降低（P＜0.05）；ASPS高劑量組、潑尼松龍組血清AST、ALT水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清AST、ALT水平比較（±s，U·L-1）Tab.1 Comparison of serum AST and ALT levels in each group（±s，U·L-1）

表1 各組小鼠血清AST、ALT水平比較（±s，U·L-1）Tab.1 Comparison of serum AST and ALT levels in each group（±s，U·L-1）

注：與健康組比較，*P＜0.05；與AIH組比較，#P＜0.05；與ASPS低劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with healthy group，*P＜0.05;compared with AIH group，#P＜0.05;compared with ASPS low dose group，△P＜0.05

組別 n AST ALT健康組 10 145.68±22.72 49.86±11.32 AIH 組 10 457.91±68.91* 386.51±46.29*ASPS 低劑量組 10 365.29±45.70*# 309.95±37.74*#ASPS高劑量組 11 235.32±31.65*#△ 194.30±30.65*#△潑尼松龍組 11 226.87±25.43*#△ 185.38±20.01*#△F值 88.387 168.064 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 各組小鼠血清IL-22、TNF-α、IL-6水平比較 各組間總體比較，血清IL-22、TNF-α、IL-6水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。 與健康組比較，AIH組、ASPS低、高劑量組和潑尼松龍組血清IL-22、TNF-α、IL-6水平均升高（P＜0.05）；與AIH組比較，ASPS低、高劑量組和潑尼松龍組血清IL-22、TNF-α、IL-6水平均降低（P＜0.05）；與ASPS低劑量組比較，ASPS高劑量組和潑尼松龍組血清IL-22、TNF-α、IL-6水平均降低（P＜0.05）；ASPS高劑量組、潑尼松龍組血清IL-22、TNF-α、IL-6水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血清IL-22、TNF-α、IL-6水平比較（±s，pg·mL-1）Tab.2 Comparison of serum IL-22，TNF-α and IL-6 levels in each group（±s，pg·mL-1）

表2 各組小鼠血清IL-22、TNF-α、IL-6水平比較（±s，pg·mL-1）Tab.2 Comparison of serum IL-22，TNF-α and IL-6 levels in each group（±s，pg·mL-1）

注：與健康組比較，*P＜0.05；與AIH組比較，#P＜0.05；與ASPS低劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with healthy group，*P＜0.05;compared with AIH group，#P＜0.05;compared with ASPS low dose group，△P＜0.05

組別 n IL-22 TNF-α IL-6健康組 10 0.03±0.01 19.09±2.52 85.23±12.47 AIH 組 10 0.15±0.03* 88.93±10.20* 264.19±32.54*ASPS 低劑量組 10 0.10±0.02*# 52.54±8.61*# 201.35±28.30*#ASPS 高劑量組 11 0.06±.02*#△ 33.74±6.30*#△ 160.92±24.10*#△潑尼松龍組 11 0.05±.01*#△ 30.32±5.63*#△ 152.35±18.87*#△F值 61.332 150.205 74.539 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 各組小鼠Th22細(xì)胞比例比較 各組間總體比較，CD4＋T淋巴細(xì)胞中Th22細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；與健康組比較，AIH組、ASPS低、高劑量組和潑尼松龍組Th22細(xì)胞比例均升高（P＜0.05）；與AIH組比較，ASPS低、高劑量組和潑尼松龍組Th22細(xì)胞比例均降低（P＜0.05）；與ASPS低劑量組比較，ASPS高劑量組和潑尼松龍組Th22細(xì)胞比例均降低（P＜0.05）；ASPS高劑量組、潑尼松龍組Th22細(xì)胞比例比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見(jiàn)表3、圖2。

圖2 各組CD4＋T淋巴細(xì)胞中Th22細(xì)胞比例Fig.2 The proportion of Th22 cells in CD4+T lymphocytes in each group

表3 各組小鼠Th22細(xì)胞比例比較（±s，%）Tab.3 Comparison of Th22 cell proportions in each group（±s，%）

表3 各組小鼠Th22細(xì)胞比例比較（±s，%）Tab.3 Comparison of Th22 cell proportions in each group（±s，%）

注：與健康組比較，*P＜0.05；與AIH組比較，#P＜0.05；與ASPS低劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with healthy group，*P＜0.05;compared with AIH group，#P＜0.05;compared with ASPS low dose group，△P＜0.05

組別n Th22細(xì)胞比例健康組 10 1.07±0.23 AIH 組 10 2.86±0.45*ASPS低劑量組 10 2.21±0.39*#ASPS 高劑量組 11 1.62±0.38*#△潑尼松龍組 11 1.60±0.35*#△F值 34.941 P值 ＜0.001

2.5 各組小鼠肝組織病理變化比較 HE染色結(jié)果顯示，健康組肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、完整，匯管區(qū)域正常；AIH組肝細(xì)胞明顯水腫，肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，可觀察到大面積小灶樣壞死，且存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；ASPS低、高劑量組和潑尼松龍組干預(yù)后小灶樣壞死面積縮小，肝小葉結(jié)構(gòu)較為完整，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，其中ASPS高劑量組和潑尼松龍組改善作用較為明顯。見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠肝組織病理變化（HE染色，100×）Fig.3 Pathological changes of liver tissue in each group（HE staining，100×）

2.6 各組小鼠肝組織TLR4、MyD88蛋白表達(dá)及p-NF-κB p65/NF-κB p65比較 各組間總體比較，肝組織TLR4、MyD88蛋白相對(duì)表達(dá)量，p-NF-κB p65/NF-κB p65差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。與健康組比較，AIH組、ASPS低、高劑量組和潑尼松龍組肝組織TLR4、MyD88蛋白相對(duì)表達(dá)量，p-NF-κB p65/NF-κB p65均升高（P＜0.05）；與AIH組比較，ASPS低、高劑量組和潑尼松龍組肝組織TLR4、MyD88蛋白相對(duì)表達(dá)量，p-NF-κB p65/NF-κB p65均降低 （P＜0.05）；與ASPS低劑量組比較，ASPS高劑量組和潑尼松龍組肝組織TLR4、MyD88蛋白相對(duì)表達(dá)量，p-NF-κB p65/NF-κB p65均降低 （P＜0.05）；ASPS高劑量組和潑尼松龍組肝組織TLR4、MyD88蛋白相對(duì)表達(dá)量，p-NF-κB p65/NF-κB p65比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。 見(jiàn)表4、圖4。

圖4 各組TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.4 Protein expression results of TLR4，MyD88，NF-κB p65，p-NF-κB p65 in each group

表4 各組小鼠肝組織TLR4、MyD88蛋白表達(dá)及p-NF-κB p65/NF-κB p65比較（±s）Tab.4 Comparison of relative expression levels of TLR4，MyD88 and NF-κB proteins in liver tissues in each group（±s）

表4 各組小鼠肝組織TLR4、MyD88蛋白表達(dá)及p-NF-κB p65/NF-κB p65比較（±s）Tab.4 Comparison of relative expression levels of TLR4，MyD88 and NF-κB proteins in liver tissues in each group（±s）

注：與健康組比較，*P＜0.05；與AIH組比較，#P＜0.05；與ASPS低劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with healthy group，*P＜0.05;compared with AIH group，#P＜0.05;compared with ASPS low dose group，△P＜0.05

組別 n TLR4 MyD88 p-NF-κB p65/NF-κB p65健康組 10 0.11±0.02 0.12±0.03 0.14±0.02 AIH 組 10 1.12±0.24* 1.08±0.19* 0.87±0.19*ASPS 低劑量組 10 0.69±0.08*# 0.79±0.09*# 0.69±0.08*#ASPS 高劑量組 11 0.35±0.04*#△ 0.42±0.06*#△ 0.32±0.04*#△潑尼松龍組 11 0.33±0.05*#△ 0.41±0.05*#△ 0.35±0.04*#△F值 118.949 141.733 91.015 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

AIH是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性肝病，以血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高，SMA、ANA等自身抗體陽(yáng)性等為主要臨床特征。AIH病理學(xué)特征主要為匯管區(qū)及門(mén)靜脈巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)并侵入周?chē)螌?shí)質(zhì)，導(dǎo)致肝門(mén)周?chē)伴g隔周?chē)?、重度小葉性界板炎癥及壞死[8-9]。研究顯示，細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、自身抗原抗體反應(yīng)等多種因素均可激活T淋巴細(xì)胞，介導(dǎo)免疫反應(yīng)，攻擊肝臟組織；并能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞合成、釋放多種炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致肝臟炎性損傷[10]。但目前臨床尚未完全闡明AIH的病因與發(fā)病機(jī)制，通常認(rèn)為與遺傳基因易感、免疫調(diào)節(jié)及效應(yīng)機(jī)制密切相關(guān)[11]。目前AIH最常用的治療方案為糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑，具有較強(qiáng)的免疫抑制及抗炎功效，但長(zhǎng)期用藥毒副作用較強(qiáng)，患者依從性不佳。近年來(lái)，中藥因副作用小、安全性高，在肝病的臨床治療中逐漸受到關(guān)注。

Th22細(xì)胞是新發(fā)現(xiàn)的一種獨(dú)立的輔助性T淋巴細(xì)胞亞群，主要通過(guò)釋放效應(yīng)細(xì)胞因子IL-22發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。Ma等[12]報(bào)道指出，AIH患者Th22細(xì)胞數(shù)量與血清IL-22水平均顯著增加，且與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，提示Th22細(xì)胞與IL-22與AIH發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。多糖作為構(gòu)成生命體的基本物質(zhì)之一，亦是一種重要的天然活性成分。既往研究認(rèn)為，多糖通常通過(guò)抑制黏附因子、趨化因子及炎癥發(fā)展過(guò)程中關(guān)鍵酶的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞因子生成，實(shí)現(xiàn)抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用[13]。作為五加科植物刺五加的活性成分之一，ASPS由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖等成分組成，具有生物活性廣泛、毒性低等優(yōu)勢(shì)，在臨床疾病的治療中表現(xiàn)出較大的潛力。孫守坤等[14]采用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)法建立免疫抑制小鼠模型，經(jīng)刺五加酸性多糖干預(yù)后，小鼠免疫器官臟器指數(shù)、外周血白細(xì)胞數(shù)量、炎癥因子水平和脾淋巴細(xì)胞增殖能力等均得到顯著改善，提示刺五加酸性多糖可顯著增強(qiáng)免疫抑制小鼠的免疫功能。本研究結(jié)果提示，AIH組、ASPS低、高劑量組血清AST、ALT、IL-22、TNF-α、IL-6水平以及CD4＋T淋巴細(xì)胞中Th22細(xì)胞占比依次降低；AIH組肝細(xì)胞明顯水腫，肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，可觀察到大面積小灶樣壞死及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，ASPS低、高劑量組和潑尼松龍組肝組織病理變化有所改善，其中ASPS高劑量組和潑尼松龍組改善作用較為明顯，提示ASPS可改善AIH小鼠肝功能，減輕炎癥反應(yīng)及病理變化，其作用呈劑量依賴(lài)性。

Toll樣受體屬Ⅰ型跨膜糖蛋白，是一種天然免疫模式識(shí)別受體，TLR4是Toll樣受體家族重要成員，主要表達(dá)在免疫細(xì)胞表面，在機(jī)體固有免疫系統(tǒng)激活及抗病原微生物免疫中扮演著重要角色。MyD88是TLR4的銜接蛋白，TLR4可經(jīng)MyD88依賴(lài)途徑被激活，進(jìn)而活化MyD88蛋白，誘導(dǎo)下游因子NF-κB轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，NF-κB發(fā)生磷酸化后進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6等炎癥介質(zhì)，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，參與自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。Chi等[15]認(rèn)為，TLR2/4配體放大的肝臟炎癥，是IL-6、IL-12等炎癥因子持續(xù)表達(dá)及AIH發(fā)生、發(fā)展的重要因素。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，TLR4途徑可能是ASPS降低Lewis荷瘤小鼠外周血中炎癥因子水平、發(fā)揮腫瘤抑制及免疫調(diào)節(jié)作用的通路之一，推測(cè)ASPS對(duì)該通路具有調(diào)節(jié)作用[16]。Li等[17]在研究ASPS介導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的潛在機(jī)制及信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，ASPS可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬作用，可能成為潛在的免疫增強(qiáng)劑，并確定TLR4是ASPS的主要受體。上述研究均提示ASPS對(duì)TLR4信號(hào)通路可能具有調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示，ASPS高劑量組和潑尼松龍組肝組織TLR4、MyD88蛋白相對(duì)表達(dá)量，p-NF-κB p65/NF-κB p65比例低于AIH組和ASPS低劑量組，而ASPS低劑量組低于AIH組，提示ASPS可能通過(guò)抑制TLR4/MyD88信號(hào)通路，發(fā)揮保護(hù)AIH小鼠肝功能、減輕炎癥反應(yīng)及病理變化、調(diào)節(jié)Th22細(xì)胞比例的作用。

綜上所述，ASPS可保護(hù)AIH小鼠肝功能，減輕炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)Th22細(xì)胞比例，改善肝組織病理變化，其作用呈劑量依賴(lài)性，推測(cè)其分子機(jī)制與抑制TLR4/MyD88信號(hào)通路有關(guān)。