張文圣，楊洋，盧依剛，鄧新喜，萬濱，張卓，李勛剛

(九江市第一人民醫(yī)院，江西 九江 332000)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一。近年來，全世界死于膀胱癌的人數(shù)逐年增加[1]。美國2017年報道的數(shù)據(jù)顯示大約有79 000多例新發(fā)膀胱癌病例，其中死亡人數(shù)約為16 870 例[2]。膀胱癌的治療在臨床實踐中仍然面臨許多挑戰(zhàn)，治療后患者預(yù)后不理想。當(dāng)前，手術(shù)聯(lián)合放化療是膀胱癌的主要治療方式。近年來，腫瘤免疫療法的飛速發(fā)展從根本上改變了臨床抗腫瘤方式，為治療腫瘤打開了新的大門。美國癌癥研究中心在2016年年度報告中表示，免疫療法被評為既往癌癥相關(guān)研究重要進(jìn)展[3]。免疫檢查點(diǎn)包括PD-1/PD-L1，CTLA-4，BTLA，Tim-3等，屬于免疫抑制分子的一種，通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)來保護(hù)正常的組織。PD-1免疫檢查點(diǎn)特異性強(qiáng)，分布廣泛，作用持久，近年來已廣泛用于腫瘤免疫治療的研究[4]，研究熱點(diǎn)集中于免疫學(xué)檢查點(diǎn)抑制劑。大量研究證實，對于卵巢癌、膀胱癌、腎細(xì)胞癌、惡性黑色素瘤、宮頸癌等惡性腫瘤的治療，PD-1免疫檢查點(diǎn)抑制劑均有效。Durvalumab屬人源化PD-1 IgGlk單克隆抗體，可與PD-1蛋白結(jié)合，進(jìn)而影響T細(xì)胞表面CD80與PD-1的結(jié)合，從而解除對免疫應(yīng)答的抑制，使腫瘤細(xì)胞逃避T細(xì)胞追殺時，不能利用PD-L1/PD-1途徑逃脫追殺[5-6]。也有報道[7]稱PD-L1蛋白單克隆抗體對缺乏PD-L1表達(dá)但沒有檢測到毒性的相鄰癌細(xì)胞具有一定的細(xì)胞殺傷作用以及旁觀者殺傷作用。

吉西他濱(GEM)是抑制DNA合成的抗癌藥物，可抑制抗脫氧胞苷核苷酸代謝過程，屬脫氧胞苷類似物[8]。GEM可在一定條件下，在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為具有一定活性的三磷酸核苷、二磷酸核苷，發(fā)揮其殺傷腫瘤細(xì)胞的作用；并可干擾DNA聚合酶工作過程，影響DNA正常配對，進(jìn)而影響DNA合成進(jìn)程、抑制腫瘤細(xì)胞生長。GEM應(yīng)用于人體內(nèi)治療可增強(qiáng)自身作用強(qiáng)度，進(jìn)一步增強(qiáng)其藥物活性[9-10]。GEM具有低毒性的特點(diǎn)，在與其他化療藥物合用時，毒性反應(yīng)、藥物交叉耐藥性均無疊加作用，因此被廣泛用于膀胱癌術(shù)后灌注治療及其他惡性腫瘤治療中。本研究旨在分析PD-1免疫檢查點(diǎn)抑制劑Durvalumab對吉西他濱誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡的作用，從而為膀胱癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人膀胱癌T24細(xì)胞培養(yǎng)方法：常規(guī)傳代培養(yǎng)于1640細(xì)胞培養(yǎng)基(10%胎牛血清)，培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2；實驗正式開始時間為對數(shù)生長期。將其分為對照組、吉西他濱組和吉西他濱+Durvalumab組。

1.2.2 定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測Caspase-3基因的表達(dá)

采用定量聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR)檢測Caspase-3基因的表達(dá)，3組均嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說明書操作，達(dá)到時間后對處理的細(xì)胞進(jìn)行收集，按照Trizol法步驟提取總的RNA，之后取出1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，Q-PCR法擴(kuò)增cDNA片段。Q-PCR反應(yīng)體系：Mix10μL，primer F0.4μL，primer R0.4μL，Rox 0.4 μL，CDNA 2 μL，ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5min；94 ℃ 15s，60 ℃1min，共循環(huán)40次，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測Caspase-3蛋白的表達(dá)

細(xì)胞處理完成后以胰酶消化，收集細(xì)胞于1.5 mL離心管中，1 200 r/min離心5 min，取下層細(xì)胞，行2次清洗[1 mL磷酸緩沖液(PBS)]，1 200 r/min離心5 min，取下層細(xì)胞，加裂解和提取緩沖液(RIPA)漩渦震蕩，然后行30 min冰浴(4 ℃)，離心(12 000 r/min，15 min)，轉(zhuǎn)移上清到1.5 mL離心管中，用雙辛酸(BCA)定量。加入6×Lodding buffer，混勻，煮沸(100 ℃，5 min)。準(zhǔn)備電泳凝膠，結(jié)合最終定量，取樣量為50 μg，80 V跑至濃縮膠底部，后設(shè)置120 V直至跑至凝膠底部；轉(zhuǎn)膜(300 mA，1.5 h)，脫脂奶粉(TBST)封閉(含有5%BSA)，兔單抗Caspase-3(1∶2 000)，鼠單抗β-actin(1∶1 000)，4 ℃反應(yīng)，過夜，后搖床上行3次TBST清洗(每次5 min)；行室溫孵育(羊抗兔和羊抗鼠二抗(1∶3 000)，行3次TBST清洗(每次5 min)，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色；掃描分析儀以化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行。

1.2.4 細(xì)胞代謝活性比色法檢測細(xì)胞的增殖能力

正常培養(yǎng)T24細(xì)胞，使細(xì)胞密度超過80%，將濃度調(diào)整為5×104/mL，接種96孔培養(yǎng)板，每孔150 μL，等待細(xì)胞黏附好，然后開始稀釋藥物，細(xì)胞處理方法與之前相同。另外，陰性對照為未添加藥物的正常組，并且將沒有細(xì)胞的培養(yǎng)基用作為空白對照。每組有6個復(fù)合孔。用細(xì)胞代謝活性比色法(MTT)檢測藥物對細(xì)胞活性的影響，到達(dá)作用時間后，每個孔均加入10 μL 5 g/L MTT溶液，再培養(yǎng)3 h，在觀察過程中，用移液管小心吸出培養(yǎng)液，每個孔加150 μL二甲基亞砜(DMSO)；吸光度波長為490 nm，計算細(xì)胞抑制率。

1.2.5 膜聯(lián)蛋白V凋亡檢測試劑雙染法檢測細(xì)胞凋亡

用膜聯(lián)蛋白V凋亡檢測試劑(AnnexinV-FITC/PI)雙染法檢測細(xì)胞凋亡。將細(xì)胞在六孔板中分組接種，并用藥物處理，到達(dá)作用時間后收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，取3×105個細(xì)胞，加入195 μL結(jié)合液重懸細(xì)胞，之后加入5 μL AnnexinV-FITC，混勻，在黑暗中于室溫下孵育10 min，然后離心并丟棄上清液。加入200 μL結(jié)合溶液使細(xì)胞輕柔地重懸，加入20 μL PI充分混合，將樣品包裹在錫箔中，并于1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1 Q-PCR法檢測Caspase-3的基因表達(dá)量

吉西他濱+Durvalumab組Caspase-3基因表達(dá)水平明顯高于吉西他濱組和對照組，且對照組為最低(P<0.001；P<0.01)，說明Durvalumab可以促進(jìn)吉西他濱對T24的凋亡作用(見圖1)。

**表示吉西他濱+Durvalumab組與對照組比較，P<0.01；***表示吉西他濱組與對照組比較P<0.001

2.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測Caspase-3蛋白的表達(dá)水平

吉西他濱+Durvalumab組Caspase-3蛋白的表達(dá)水平明顯高于吉西他濱組和對照組，而對照組與吉西他濱組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明Durvalumab可以促進(jìn)吉西他濱對T24的凋亡作用(見圖2和圖3)。

圖2 各組Caspase-3蛋白表達(dá)水平

***表示吉西他濱+Durvalumab組分別與對照組和吉西他濱組比較，P均<0.001

2.3 MTT法檢測三組T24細(xì)胞的增值能力

吉西他濱組和吉西他濱+Durvalumab組與對照組相比細(xì)胞增殖水平明顯降低，且吉西他濱+Durvalumab組為最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001；P<0.01)(見圖4)。

**表示吉西他濱+Durvalumab組與對照組比較，P<0.01，***表示吉西他濱+Durvalumab組與吉西他濱比較P<0.001

2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡

吉西他濱+Durvalumab組凋亡表達(dá)水平明顯高于吉西他濱組和對照組，吉西他濱組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖5和圖6)。

圖5 藥物處理后三組細(xì)胞的凋亡水平

***表示吉西他濱+Durvalumab組與對照組比較，吉西他濱組與對照組比較，P均<0.001

3 討 論

近年來，膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤，其發(fā)病率和病死率逐年升高，且具有高復(fù)發(fā)率和高進(jìn)展率。多項研究證實[11-12]，膀胱癌與免疫逃逸密切相關(guān)，膀胱癌免疫逃逸的原因是多個負(fù)性共刺激分子(免疫檢查點(diǎn))(例如PD-1)的異常表達(dá)，導(dǎo)致特異性T細(xì)胞應(yīng)答下調(diào)，造成腫瘤細(xì)胞逃逸?；瘜W(xué)療法是治療膀胱癌的一種重要手段。Kilani等[13]發(fā)現(xiàn)吉西他濱有選擇地對人和小鼠膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。吉西他濱是一種嘧啶核苷酸類似物，已被廣泛用于膀胱癌，尤其肌層浸潤性膀胱癌的化學(xué)療法已經(jīng)將吉西他濱列為一線治療方案。但目前腫瘤化療治療中，患者耐藥性提升是影響化療效果和腫瘤控制能力的重要因素，因此如何減輕化療藥物耐藥性、提升藥物敏感性是腫瘤治療領(lǐng)域研究重點(diǎn)。免疫檢查點(diǎn)分子是機(jī)體調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和建立對自身抗原免疫耐受的重要“剎車”分子，其中PD-1為研究熱點(diǎn)。PD-1屬免疫制劑受體，由凋亡性T細(xì)胞雜交瘤消減雜交獲得，其表達(dá)情況與T淋巴細(xì)胞免疫缺陷密切相關(guān)。當(dāng)PD-1與它的配體PD-L1結(jié)合時，可以激活負(fù)調(diào)節(jié)途徑，抑制T細(xì)胞增殖，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞。臨床研究發(fā)現(xiàn)，除晚期膀胱癌外，PD-1免疫檢查點(diǎn)抑制劑用于其他部位腫瘤也可獲得理想療效，甚至可超過晚期膀胱癌的治療效果。PD-1抗體的直接靶點(diǎn)是PD-1，PD-1是最直接的預(yù)測指標(biāo)，具有非常好的預(yù)測效果，但是目前利用PD-1作為檢測指標(biāo)，在組織中還存在一些技術(shù)性的問題。本研究表明，在對膀胱癌T24細(xì)胞凋亡干預(yù)中(吉西他濱誘導(dǎo))，PD-1免疫檢查點(diǎn)抑制劑Durvalumab對其具有促進(jìn)作用。腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng)期間，其腫瘤抗原的呈遞過程需依靠免疫系統(tǒng)，并激活特異性T細(xì)胞，以應(yīng)對免疫殺傷作用。T淋巴細(xì)胞工作過程需接受共刺激信號、抗原呈遞信號完成激活過程，而共刺激信號參與人體免疫反應(yīng)需依靠向淋巴細(xì)胞提供調(diào)節(jié)信號(陰性或陽性)。人體共刺激分子中，PD-1/PD-L1是關(guān)鍵分子，其中PD-1表達(dá)于不同活化后T細(xì)胞表面，PD-L1可以在諸如造血細(xì)胞和胰島的組織和器官表面上以及各種人類實體腫瘤細(xì)胞的表面上表達(dá)，通過探索免疫檢查點(diǎn)PD-1對癌癥治療的相關(guān)影響，可為癌癥的早期根治及用藥方案提供理論依據(jù)。

癌癥免疫療法使我們了解了惡性腫瘤的治療方法，并為癌癥患者帶來了希望。雖然在膀胱癌免疫抑制劑研究中效果顯著，但仍有許多未知領(lǐng)域有待探索。我們不僅要探索其深度，而且必須擴(kuò)大研究寬度。在接下來相關(guān)研究中，我們應(yīng)積極探索更多免疫檢查點(diǎn)，以研發(fā)、探索更具特異性的腫瘤治療藥物。