陳 雪，王 瑞，張勝森，郭青青，李加納

西南大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400715

甘藍(lán)型油菜是我國重要的油菜作物[1]，存在明顯的雜種優(yōu)勢.雜種優(yōu)勢利用的途徑包括化學(xué)殺雄[2]、波里馬不育[3]、蘿卜質(zhì)不育[4]、顯性核不育[5]、自交不親和性[6]、細(xì)胞質(zhì)+細(xì)胞核雙重不育[7-8]和隱性核不育[9-10]等，隱性核不育因其恢復(fù)源廣泛且配組自由成為雜種優(yōu)勢利用的主要途徑.但隱性核不育存在需與臨保系搭配使用這一問題，讓其利用受到很大限制.

遺傳多樣性分析是種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和雜種優(yōu)勢利用的基礎(chǔ).隨著高通量測序技術(shù)和功能基因組學(xué)的發(fā)展，SNP芯片為作物種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析提供了新的技術(shù)手段，目前已有甘藍(lán)型油菜SNP芯片應(yīng)用于聚類分析和基因定位研究[11-12].本文以西南大學(xué)油菜生物學(xué)團(tuán)隊(duì)選育出的39份甘藍(lán)型油菜隱性核三系臨保系為材料，通過武漢雙綠源創(chuàng)芯科技研究院有限公司提供的油菜50K SNP芯片分析評(píng)價(jià)其遺傳多樣性，為臨保系配制隱性核不育提供準(zhǔn)確的遺傳背景指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)材料39份，為西南大學(xué)油菜生物學(xué)選育的甘藍(lán)型油菜隱性核三系臨保系.

1.2 方 法

1.2.1 播種與取樣

2018年10月初將材料播種于重慶市北碚區(qū)西南大學(xué)歇馬油菜基地試驗(yàn)田，于苗期摘取每份臨保系材料生長大小一致的3個(gè)單株的幼嫩葉置于2 mL離心管中，-20 ℃冰箱保存.

1.2.2 DNA提取

用CTAB法[13]提取DNA，用1.0%瓊脂糖電泳檢查DNA的質(zhì)量，用Nanodrop核酸蛋白質(zhì)分析儀檢測DNA的濃度，并將DNA濃度稀釋成50 ng/L，-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.3 SNP芯片分析

使用油菜50K高通量芯片對(duì)39份臨保系的每份材料進(jìn)行DNA光學(xué)掃描，通過光學(xué)設(shè)備掃描“紅”或“綠”和“有”或“無”來區(qū)分一個(gè)SNP位點(diǎn).此SNP芯片檢測通量大，幾十個(gè)位點(diǎn)可以通過1次檢測完成，并且具有高達(dá)99.9%以上的檢測準(zhǔn)確性.

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

在R3.5.0環(huán)境下使用CMplot包(https：//github.com/YinLiLin/R-CMplot)對(duì)臨保系所有SNP位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)各染色體SNP密度；基于neighbor-joining算法使用MEGA5[14]軟件對(duì)39個(gè)臨保系SNP標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析；Lee等[15]在2014年開發(fā)出SNPhylo流程(http：//chibba.pgml.uga.edu/snphylo/)，BASH命令行一步執(zhí)行生成遺傳進(jìn)化樹.39個(gè)臨保系SNP標(biāo)記數(shù)據(jù)文件通過選擇參數(shù)提取具有代表性的SNP位點(diǎn)，MUSCLE多重比較，DANML制作最大似然樹得到進(jìn)化樹圖像.

2 結(jié)果與分析

2.1 表型觀察與統(tǒng)計(jì)

39份甘藍(lán)型油菜臨保系在品質(zhì)、角果長度、種子顏色、花瓣顏色、抗倒、株型和生育期等方面不盡一致，其簡易表型觀察如表1.RW01-RW21品質(zhì)為低芥酸低硫苷，花瓣顏色為典型黃色.RW22-RW39材料中，RW22為低芥酸高硫苷，RW37為高芥酸高硫苷，其余品質(zhì)都為高芥酸低硫苷，而花瓣色澤為白花、粉白色、粉桃色、桃紅色不等.這些臨保系的隱性上位基因和隱性不育基因處于隱性純合狀態(tài)，其他遺傳背景通過各種育種手段和技術(shù)發(fā)生了重組和交換.

表1 39份甘藍(lán)型油菜隱性核三系臨保系簡易表型觀察

2.2 SNP密度分布

利用武漢雙綠源創(chuàng)芯科技研究院有限公司的油菜50K SNP芯片對(duì)39份臨保系材料進(jìn)行基因型鑒定，共鑒定出25 401個(gè)高質(zhì)量的SNP標(biāo)記，使用CMplot R包繪制19條染色體SNP密度分布圖(圖1).結(jié)果顯示，SNP標(biāo)記并非在染色體上均勻分布，染色體Chr11和Chr14出現(xiàn)SNP標(biāo)記數(shù)大于113個(gè)/Mb，而幾乎每條染色體都存在SNP標(biāo)記空缺的現(xiàn)象.

圖1 SNP密度分布圖

2.3 MEGA5分析39份臨保系遺傳多樣性

利用生物學(xué)軟件MEGA5和SNP標(biāo)記數(shù)據(jù)文件，基于neighbor-joining算法對(duì)39份臨保系進(jìn)行聚類分析(圖2).在0.3閾值下，39份材料可聚成A，B，C，D 4個(gè)大類，A類群只包括RW22，為黑籽粉花臨保系；B類群體包括19份材料，除RW03，RW13兩個(gè)角果極短的黃籽黃花材料外，其余為高芥酸、非黃花臨保系；C類群體包括10份材料，為低芥酸低硫苷、黃籽黃花臨保系；D類群體包括9份材料，為低芥酸、抗倒伏黃花臨保系.因此，聚類分析可用于區(qū)別花色和品質(zhì)性狀，也可應(yīng)用于甘藍(lán)型油菜臨保系遺傳背景和性狀之間的比較和評(píng)價(jià).

圖2 39份甘藍(lán)型油菜臨保系聚類圖

2.4 SNPhylo分析39份臨保系遺傳多樣性

利用生物學(xué)軟件SNPhylo分析SNP位點(diǎn)數(shù)據(jù)，構(gòu)建39份臨保系材料的遺傳進(jìn)化樹(圖3).進(jìn)化樹顯示出5個(gè)主干分支，RW03，RW13和RW22分布在中心節(jié)點(diǎn)附近.低芥酸低硫苷和黃花臨保系分布在兩個(gè)主干分支上，一個(gè)分支上有RW01，RW15，RW20，RW14，RW18，RW19，RW17等，另一個(gè)主干分支上有RW02，RW07，RW10，RW06等.同一主干分支的臨保系遺傳背景最為接近，其分布距離反映出臨保系之間的遺傳距離.而高芥酸非黃花臨保系分布在另外2個(gè)分支上.RW28，RW23，RW35，RW26，RW27，R38，RW25在同一分支上分散.RW31，RW24，RW30和RW32，RW37以及RW34，RW39，RW36分別處于同一個(gè)主干分支下的3個(gè)次生分支上.此外，還有一主干分支上分布著RW29和RW33.遺傳進(jìn)化樹可區(qū)分品質(zhì)性狀和花瓣顏色性狀，但對(duì)種子顏色、抗倒等其他性狀不能區(qū)分.與聚類分析結(jié)果一致，但遺傳進(jìn)化樹與聚類圖相比較更為形象直觀，材料的遺傳親緣關(guān)系反映尤為充分.

圖3 39個(gè)甘藍(lán)型油菜臨保系遺傳進(jìn)化樹

3 討論和結(jié)論

利用SSR，AFLP，SNP，SCAR等各種標(biāo)記方法，甘藍(lán)型油菜遺傳多樣性分析已在黃籽油菜[16]、隱性核不育[17]、雜交親本評(píng)價(jià)、油菜區(qū)試指紋圖譜[18]等方面做了很多研究工作.甘藍(lán)型油菜隱性核三系臨保系在選育策略[19-20]、分子標(biāo)記[21-22]、專利和應(yīng)用[23]等方面也取得了多項(xiàng)成果，但利用SNP芯片分析甘藍(lán)型油菜隱性核三系臨保系遺傳多樣性還未有文獻(xiàn)報(bào)道.本研究利用50K油菜芯片SNP對(duì)39份甘藍(lán)型油菜臨保系材料進(jìn)行遺傳分析，結(jié)果表明臨保系材料間具有較好的遺傳多樣性.根據(jù)SNP數(shù)據(jù)繪制染色體SNP密度分布圖，SNP標(biāo)記基本覆蓋了整個(gè)染色體組，但并非均勻分布，甚至每條染色體都出現(xiàn)SNP標(biāo)記空缺現(xiàn)象，表明武漢雙綠源創(chuàng)芯科技研究院有限公司開發(fā)的油菜50K SNP芯片設(shè)計(jì)不夠完善，也說明臨保系材料數(shù)量太少，遺傳變異類型不夠豐富.

對(duì)39份臨保系材料的聚類結(jié)果表明，表型為粉白色、抗倒伏、株型性狀優(yōu)異的臨保系材料RW32和RW37優(yōu)先聚集到一起；表型為粉桃色、葉片大、花期晚的臨保系材料RW34，RW36也優(yōu)先聚集到一起，這充分說明SNP芯片揭示的遺傳多樣性和性狀基本一致，可以充分反映材料之間的遺傳差異.在該研究中，臨保系RW22單獨(dú)聚為一類，與其他材料具有明顯的遺傳特異性，而在表型上該材料確實(shí)具有黑籽、粉花等非常特殊的農(nóng)藝性狀，需要對(duì)該特異種質(zhì)資源加以保存和利用.由此可見，SNP聚類結(jié)果能較好地反映材料間的親緣關(guān)系，可為種質(zhì)資源的利用提供參考.