周利娟 武正華 汪碩聞 繆文清 包婺平 包愛華 范國榮

摘 要 目的：建立測(cè)定人血漿中安羅替尼質(zhì)量濃度的方法并應(yīng)用于臨床。方法：以醋酸銨為鹽析助劑，以乙腈為溶劑，采用鹽析輔助液液萃取對(duì)血漿樣品進(jìn)行前處理;以伏立康唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）測(cè)定。色譜柱為Waters X Bridge C18，流動(dòng)相為0.2%甲酸水溶液-乙腈（梯度洗脫），流速為1 mL/min，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，分流比為3 ∶ 7;離子源為電噴霧離子源，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行正離子掃描，用于定量分析的離子對(duì)分別為m/z 408.3→339.3（安羅替尼）、m/z 350.2→281.3（內(nèi)標(biāo)）。結(jié)果：安羅替尼檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為0.2～200 ng/mL（R2=0.996 7）;定量下限為0.2 ng/mL;日內(nèi)、日間精密度試驗(yàn)的RSD均小于12%（n=6或n=3）;準(zhǔn)確度為90.92%～108.00%（n=6或n=3）;平均提取回收率為87.51%～100.00%（RSD<8%，n=6）;平均基質(zhì)效應(yīng)為96.66%～99.93%（RSD<5%，n=6）。3例使用安羅替尼治療的非小細(xì)胞肺癌患者體內(nèi)的血藥濃度為8.74～65.60 ng/mL。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)，可用于非小細(xì)胞癌患者體內(nèi)安羅替尼的血藥濃度監(jiān)測(cè)。

關(guān)鍵詞 安羅替尼;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù);鹽析輔助液液萃取;治療藥物監(jiān)測(cè)

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for concentration determination of anlotinib in human plasma and apply it in the clinic. METHODS： The plasma samples were pretreated by salting-out assisted with liquid-liquid extraction with ammonium acetate as salting out assistant and acetonitrile as solvent. Using voriconazole as internal standard， LC-MS/MS method was adopted. The separation was performed on Waters X Bridge C18 column with mobile phase consisting of 0.2% formic acid solution- acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 1 mL/min. The column temperature was set at 40 ℃， and sample size was 10 μL. The split ratio was 3 ∶ 7. The electrospray ion source and multiple reaction monitoring mode were used for the analysis. The ion pair of anlotinib and internal standard under positive ion mode were m/z 408.3→339.3 and m/z 350.2→281.3， respectively. RESULTS： Anlotinib showed a good linear relationship in the concentration range of 0.2-200 ng/mL （R2>0.996 7）. The lowest limit of quantitation was 0.2 ng/mL. Intra-day and inter-day RSDs were no more than 12% （n=6 or n=3）. Accuracies were 90.92%-108.00% （n=6 or n=3）. The average extraction recoveries were 87.51%-100.00%（RSD<8%，n=6）. The average matrix effects were 96.66%-99.93%（RSD<5%，n=6）. The plasma concentration of 3 patients with NSCLC treated with anlotinib was 8.74-65.60 ng/mL. CONCLUSIONS： The method is simple， accurate and specific， and is suitable for the plasma concentration monitoring of anlotinib in NSCLC patients.

KEYWORDS ? Anlotinib; LC-MS/MS; Salting-out assisted liquid-liquid extraction; Therapeutic drug monitoring

鹽酸安羅替尼是我國自主研發(fā)的一種新型口服酪氨酸激酶抑制劑，能夠有效抑制血管內(nèi)皮生長因子受體、血小板衍生生長因子受體、纖維母細(xì)胞生長因子受體、干細(xì)胞因子受體（c-Kit）等激酶，具有抗腫瘤血管生成、抑制腫瘤生長的雙重作用[1-2]。基于ALTER 0303研究（安羅替尼治療晚期非小細(xì)胞肺癌患者的Ⅲ期臨床研究）的良好結(jié)果，國家食品藥品監(jiān)督管理局于2018年5月8日正式批準(zhǔn)安羅替尼單藥用于晚期非小細(xì)胞肺癌患者的三線及以上治療。有研究表明，安羅替尼的藥動(dòng)學(xué)特征與其他酪氨酸激酶抑制劑類似，即經(jīng)肝藥酶代謝，其血漿蛋白結(jié)合率較高、消除半衰期較長，長期連續(xù)使用后藥物在體內(nèi)有明顯的蓄積，且個(gè)體間表現(xiàn)出較大的藥動(dòng)學(xué)差異[3-4];此外，該藥在我國上市時(shí)間短，臨床用藥經(jīng)驗(yàn)有限，且其對(duì)細(xì)胞色素P450酶（包括CYP2D1、CYP3A1、CYP3A2）有顯著誘導(dǎo)作用，在長期使用過程中，可能與食物、配伍藥物發(fā)生相互作用[5]。關(guān)于安羅替尼致不良反應(yīng)已經(jīng)有大量文獻(xiàn)報(bào)道[6-7]，但目前尚未有研究探索安羅替尼血漿濃度與療效之間的相關(guān)性，且缺乏穩(wěn)定、可靠的血藥濃度定量檢測(cè)方法。因此，為對(duì)腫瘤患者進(jìn)行安羅替尼治療藥物監(jiān)測(cè)（TDM）、為濃度-效應(yīng)等相關(guān)性研究提供檢測(cè)技術(shù)支持、保證藥物使用的安全性和有效性，有必要建立相關(guān)的定量分析方法。

目前，關(guān)于安羅替尼的分析檢測(cè)方法，國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道有限，且在現(xiàn)有的大多數(shù)安羅替尼療效及安全性評(píng)價(jià)研究中均未進(jìn)行相關(guān)定量分析[3，8-10]，僅有少數(shù)國內(nèi)學(xué)者建立了測(cè)定人血漿中安羅替尼濃度的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS），并將其用于研究安羅替尼膠囊在我國成年腫瘤患者體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征[11]。該法雖然操作簡(jiǎn)單，但由于血漿內(nèi)源性物質(zhì)較復(fù)雜，隨著進(jìn)樣次數(shù)的增多會(huì)造成檢測(cè)系統(tǒng)壓力過高、分析重現(xiàn)性差、色譜柱損壞、靈敏度降低等現(xiàn)象，故應(yīng)用受限[12]。Zhong等[3]在測(cè)定安羅替尼含量時(shí)，使用乙酸乙酯進(jìn)行液液萃取，需要用氮?dú)饬鞔蹈刹?fù)溶，步驟繁瑣且耗時(shí)。鹽析輔助液液萃取是利用鹽析作用將水溶性有機(jī)溶劑（如乙腈）從血漿或水相中分離出來，可用于提取藥物和代謝物，尤其適用于親水性化合物的分析[13]。在進(jìn)行鹽析輔助液液萃取時(shí)，僅需要向樣品中加入高濃度的鹽和水溶性有機(jī)試劑，經(jīng)過渦旋離心后即可取上清液進(jìn)樣分析，與傳統(tǒng)的液液萃取和固相萃取相比，不僅步驟少、耗時(shí)短，而且環(huán)保、經(jīng)濟(jì);與直接蛋白沉淀相比，可獲得基質(zhì)成分更為單一的提取物[13]。基于此，本研究首次建立了基于鹽析輔助液液萃取聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)測(cè)定腫瘤患者血漿中安羅替尼濃度的方法，旨在為該藥的TDM及臨床個(gè)體化應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料

1.1 主要儀器

本文所用主要儀器包括LC-20A型液相色譜系統(tǒng)及配備的LC-20AD型二元泵、DGU-20A3型脫氣機(jī)、SIL-20A型自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20AC型柱溫箱（日本Shimadzu公司），API 4000型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀及配備的電噴霧電離源（ESI）和Analyst Software 1.6工作站（美國AB Sciex公司），SCILOGEX MX-S型渦旋混合器（美國Scilogex公司），Sorvall Legend Micro 21R型冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司），SK5200H型超聲儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司），TD4型低速臺(tái)式離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司），XS205 Dual Range型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），Hi-Tech型水純化系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

本文所用主要藥品和試劑包括安羅替尼對(duì)照品（加拿大TRC公司，批號(hào)6-RTU-81-1，純度95%）、伏立康唑?qū)φ掌罚ù筮B美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)J1211AS，純度>99%）等;乙腈為色譜純，醋酸、甲酸等為分析純，水為自制的去離子超純水（18.2 MΩ）。

1.3 血漿樣品來源

1.3.1 空白血漿 選擇上海市第一人民醫(yī)院作體檢的健康體檢者，在其開展血常規(guī)等檢查時(shí)征得其知情同意后采集靜脈血。上述血樣經(jīng)處理后作為空白血漿，用于定量分析的方法學(xué)考察。

1.3.2 患者血漿 患者血漿樣本由上海市第一人民醫(yī)院呼吸科提供，分別為3例使用安羅替尼的患者服藥前后的血漿樣品?；颊叩陌擦_替尼用藥劑量為12 mg/d，連續(xù)服用2周，停藥1周，即3周（21天）為1個(gè)療程。本研究已經(jīng)通過了醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（編號(hào)為2019-N-021），患者均已知情同意。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 貯備液 精密稱取安羅替尼對(duì)照品10.0 mg、伏立康唑（內(nèi)標(biāo)）對(duì)照品10.0 mg，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL的安羅替尼貯備液和內(nèi)標(biāo)貯備液，于-40 ℃冰箱保存，備用。

2.1.2 工作液 將“2.1.1”項(xiàng)下安羅替尼貯備液用80%甲醇逐級(jí)稀釋，配制成安羅替尼質(zhì)量濃度分別為4 000、2 000、400、80、40、8、4 ng/mL的系列工作溶液;同法配制安羅替尼質(zhì)量濃度分別為3 200、160、8、4 ng/mL的系列質(zhì)控工作液。將“2.1.1”項(xiàng)下伏立康唑貯備液用乙腈稀釋，配制成質(zhì)量濃度為200 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。上述溶液均置于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和質(zhì)控樣品溶液 精密量取“2.1.2”項(xiàng)下各系列工作液和質(zhì)控工作液適量，用空白血漿稀釋20倍，制成安羅替尼質(zhì)量濃度分別為200、100、20、4、2、0.4、0.2 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和質(zhì)量濃度分別為160、8、0.4、0.2 ng/mL的高、中、低質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品溶液和定量下限（LLOQ）質(zhì)量濃度血漿樣品溶液。

2.2 待測(cè)血漿樣品前處理

精密吸取待測(cè)血漿樣品50 μL，置于1.5 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液（200 ng/mL）5 μL，渦旋混勻;加入醋酸銨溶液（5 mol/L）50 μL，渦旋混勻1 min;加入乙腈100 μL，再渦旋混勻3 min，于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上層清液進(jìn)樣分析。

2.3 色譜條件與質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Waters X Bridge C18（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）;以0.2%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～0.5 min，20%B→80%B;0.5～3 min，80%B;3～3.1 min，80%B→20%B;3.1～5.0 min，20%B）;流速為1 mL/min;柱溫為40 ℃;進(jìn)樣量為10 μL;柱后用三通3 ∶ 7分流，3/10進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源為ESI，檢測(cè)模式為正離子模式，選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式（MRM）進(jìn)行一/二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)。氣簾氣為25 psi，碰撞氣為10 psi，霧化氣為50 psi，輔助氣為45 psi，噴霧電壓為5 500 V，離子源溫度為500 ℃;用于定量分析的離子對(duì)分別為m/z 408.3→339.3（安羅替尼，去簇電壓90 V，入口電壓10 V，碰撞電壓33 V，出口電壓15 V）、m/z 350.2→281.3（內(nèi)標(biāo)，去簇電壓90 V，入口電壓10 V，碰撞電壓27 V，出口電壓15 V），駐留時(shí)間均為200 ms。

2.4 專屬性考察

取空白血漿、空白血漿+安羅替尼（0.2 ng/mL）、患者3服藥前0.5 h的血漿樣品各適量，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析;同時(shí)，設(shè)置不加內(nèi)標(biāo)且同法處理的空白血漿為參照，考察方法的專屬性。結(jié)果，血漿樣品中安羅替尼和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別約為2.4、2.8 min;色譜峰峰形良好，血漿樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)和其他物質(zhì)均不干擾安羅替尼和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，表明該方法專屬性較好。安羅替尼的典型MRM圖見圖1。

2.5 殘留評(píng)估

取“2.1.3”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為200 ng/mL的安羅替尼標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析;隨后，取空白血漿適量，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析以評(píng)估殘留。結(jié)果，在該分析條件下，血漿樣品中安羅替尼及內(nèi)標(biāo)伏立康唑均無殘留。

2.6 線性關(guān)系和定量下限考察

取“2.1.3”項(xiàng)下質(zhì)量濃度分別為200、100、20、4、2、0.4、0.2 ng/mL的安羅替尼標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以安羅替尼的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、安羅替尼與內(nèi)標(biāo)伏立康唑的峰面積比值（y）為縱坐標(biāo)，采用最小加權(quán)二乘法以1/x2為權(quán)重因子進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，得安羅替尼回歸方程為y=0.081 8x+0.014 2（R2=0.996 7），其檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為0.2～200 ng/mL，定量下限為0.2 ng/mL。

2.7 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取“2.1.3”項(xiàng)下低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品溶液和定量下限質(zhì)量濃度血漿樣品溶液適量，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，考察日內(nèi)精密度;連續(xù)測(cè)定3天，考察日間精密度。以實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度的比值來表示準(zhǔn)確度。結(jié)果，安羅替尼各質(zhì)量濃度樣品的日內(nèi)RSD為0.81%～10.27%（n=6），日間RSD為3.91%～8.64%（n=3），準(zhǔn)確度為90.92%～108.00%（n=6或n=3），表明該方法的精密度和準(zhǔn)確度均良好，詳見表1。

2.8 提取回收率試驗(yàn)

取“2.1.3”項(xiàng)下低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品溶液，各平行6份，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄待測(cè)成分峰面積（A1）;另取空白血漿，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后，加入“2.1.2”項(xiàng)下低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控工作液適量（使最終質(zhì)量濃度與質(zhì)控樣品溶液對(duì)應(yīng)），按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄待測(cè)成分峰面積（A2）;按A1/A2×100%計(jì)算提取回收率。結(jié)果，安羅替尼各質(zhì)量濃度樣品的平均提取回收率為87.51%～100.00%（RSD<8%，n=6），表明提取方法對(duì)樣品定量分析的影響較小，詳見表2。

2.9 基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)

分別取6份不同來源的空白血漿各50 μL，按“2.2”項(xiàng)下方法處理，取上清液，即得空白基質(zhì)。向此空白基質(zhì)中加入“2.1.2”項(xiàng)下低、高質(zhì)量濃度質(zhì)控工作液適量（使最終質(zhì)量濃度與“2.7”項(xiàng)下低、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品溶液對(duì)應(yīng)），各平行6份，按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄待測(cè)成分峰面積（B1）。另取“2.1.2”項(xiàng)下低、高質(zhì)量濃度質(zhì)控工作液，用乙腈稀釋，制成與上述質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)的安羅替尼對(duì)照品溶液，各平行6份，按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄待測(cè)成分峰面積（B2）。以B1/B2×100%計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果，安羅替尼各質(zhì)量濃度樣品的平均基質(zhì)效應(yīng)為96.66%～99.93%（RSD<5%，n=6），表明在該檢測(cè)條件下，基質(zhì)對(duì)待測(cè)物定量分析的影響可以忽略，詳見表3。

2.10 穩(wěn)定性考察

取“2.1.3”項(xiàng)下低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品溶液，各平行6份，考察其在室溫放置12 h、按“2.2”項(xiàng)下方法處理后在進(jìn)樣器放置24 h、反復(fù)凍融3次（-40～24 ℃）和-40 ℃放置30天的穩(wěn)定性。結(jié)果，安羅替尼各質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品在上述條件下放置的準(zhǔn)確度為88.83%～106.19%，RSD為2.60%～11.24%（n=6），表明各樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好。

2.11 非小細(xì)胞肺癌患者體內(nèi)安羅替尼血藥濃度的檢測(cè)

采用上述鹽析輔助液液萃取結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)檢測(cè)3例非小細(xì)胞肺癌患者體內(nèi)安羅替尼的血藥濃度。其中，女性2例、男性1例，年齡56～62歲。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，患者及家屬均知情且簽署知情同意書。取患者血漿樣品50 μL，平行2份，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。根據(jù)當(dāng)日隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿中安羅替尼的質(zhì)量濃度，結(jié)果以平均值表示。其中，患者1為接受安羅替尼治療的第1個(gè)療程，抽血時(shí)間為該療程的第3天;患者2和患者3均為接受安羅替尼治療的第3個(gè)療程，抽血時(shí)間分別為該療程的第3天和第7天。結(jié)果，3例患者血藥濃度檢測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)[4]報(bào)道基本一致，詳見表4。

3 討論

3.1 LC-MS/MS 條件的優(yōu)化

本研究前期考察了乙腈、甲醇作為有機(jī)相以及不同濃度甲酸水溶液作為水相對(duì)待測(cè)成分色譜峰峰形和響應(yīng)值的影響。結(jié)果，當(dāng)以乙腈作為有機(jī)相時(shí)，待測(cè)成分的響應(yīng)值明顯高于以甲醇作為有機(jī)相時(shí);在水相中加入甲酸可以提高安羅替尼的響應(yīng)值，并可以使出峰時(shí)間提前;且當(dāng)在水相中加入體積分?jǐn)?shù)為0.2%的甲酸時(shí)，待測(cè)成分的色譜峰峰形較好且響應(yīng)較強(qiáng)。

本課題組選取了兩種不同的色譜分析柱，分別是Waters X Bridge C18（100 mm×4.6 mm，3.5 μm）和Agilent Zorbax SB AQ（150 mm×4.6 mm，5 μm）。雖然Agilent Zorbax SB AQ也可以獲得較好的色譜峰峰形和響應(yīng)值，但是所用分析時(shí)間較長，因此本研究選擇了峰形好且分析時(shí)間更短（共5 min）的Waters X Bridge C18作為分析柱。

此外，本課題組還考察了柱溫（25、30、35、40、45 ℃）對(duì)待測(cè)成分色譜峰峰形和響應(yīng)值的影響。結(jié)果，當(dāng)柱溫為40 ℃時(shí)，待測(cè)成分的響應(yīng)值高且峰形好，故最終確定柱溫為40 ℃。

3.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇

文獻(xiàn)中報(bào)道的酪氨酸激酶抑制劑的定量檢測(cè)方法大多以同位素作為內(nèi)標(biāo)，但是同位素價(jià)格昂貴且不易獲得[10-11]。伏立康唑是在腫瘤患者中較少使用的抗真菌藥物，不僅在本研究所建的檢測(cè)條件下與待測(cè)成分有相似的色譜行為，而且也不會(huì)與待測(cè)成分檢測(cè)通道產(chǎn)生串?dāng)_現(xiàn)象，因此本研究選擇伏立康唑作為內(nèi)標(biāo)。

3.3 血漿樣品前處理方法的選擇

關(guān)于小分子酪氨酸激酶抑制劑生物樣品的前處理方法，學(xué)者大多采用蛋白沉淀、液液萃取等[11，14]。但是血漿中含有大量的磷脂和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，若僅經(jīng)簡(jiǎn)單的蛋白沉淀處理，殘余的磷脂和蛋白會(huì)隨著進(jìn)樣次數(shù)的增加而對(duì)色譜柱造成損傷，從而使檢測(cè)的靈敏度降低;然而以液液萃取作為生物樣品前處理方法，存在操作繁瑣、耗時(shí)長、人力和試劑消耗量較大等不足，其實(shí)際應(yīng)用較為受限[13]。本研究基于醫(yī)院臨床監(jiān)測(cè)樣本量大和時(shí)效性要求高等特點(diǎn)，采用鹽析輔助液液萃取的方法對(duì)血漿樣品進(jìn)行前處理，該方法步驟和蛋白沉淀一樣簡(jiǎn)單，僅需要在乙腈蛋白沉淀的基礎(chǔ)上向血漿樣品中加入5 mol/L的醋酸銨溶液，無需氮?dú)饬鞔蹈?，僅通過渦旋離心便可獲得基質(zhì)成分相對(duì)更為單一的樣品;同時(shí)，由于乙腈與血漿分相，既實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品的濃縮，又提高了檢測(cè)的靈敏度[13]。此外，本研究前處理過程中單個(gè)樣品的乙腈使用量僅為100 μL，相較于傳統(tǒng)的液液萃取減少了有機(jī)溶劑的使用量，故此法是一種經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的前處理方法。在鹽析助劑的選擇上，本研究選擇了醋酸銨。相較于氯化鈉等其他無機(jī)鹽，醋酸銨具有揮發(fā)性，對(duì)質(zhì)譜的影響更小。同時(shí)，筆者在研究過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)醋酸銨溶液濃度為5 mol/L、體積為50 μL時(shí)，乙腈與血漿分層更加明顯，故最終確定了“2.2”項(xiàng)下的血漿樣品前處理方法。

3.4 方法建立的必要性及結(jié)果分析

酪氨酸激酶抑制劑口服給藥的方式使這類藥物的藥動(dòng)學(xué)特征較為復(fù)雜。個(gè)體間藥動(dòng)學(xué)及療效的差異易受到藥物靶點(diǎn)遺傳異質(zhì)性、肝藥酶及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因多態(tài)性、患者治療依從性、配伍藥物相互作用等因素的影響，已經(jīng)有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶抑制劑血藥濃度與療效或毒性之間存在關(guān)聯(lián)[15-19]。

TDM可通過測(cè)定患者血漿中藥物的濃度，并將結(jié)果與臨床指南或目標(biāo)水平進(jìn)行比較，以實(shí)現(xiàn)個(gè)體化給藥，達(dá)到藥物療效與毒性之間的平衡[20]。2017年美國藥師協(xié)會(huì)對(duì)大量的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行總結(jié)，匯編了《腫瘤治療中激酶抑制劑治療藥物監(jiān)測(cè)實(shí)踐指南》，推動(dòng)了酪氨酸激酶抑制劑TDM的臨床實(shí)踐[21]。

安羅替尼上市時(shí)間短，臨床用藥經(jīng)驗(yàn)不足，尚未有研究報(bào)道其血藥濃度與效應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)。雖然，其現(xiàn)有治療方案為服藥2周、停藥1周，抗腫瘤效果好且毒性可控，但長期安全性及療效數(shù)據(jù)有限[4]。本研究將所建方法應(yīng)用于3例服用安羅替尼患者的血藥濃度的檢測(cè)，同時(shí)在其治療過程中均未發(fā)現(xiàn)相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生。由于安羅替尼為非小細(xì)胞肺癌患者的三線用藥方案，臨床使用時(shí)間較短，因此本課題組收集到的臨床樣本量有限，加之抽血時(shí)間點(diǎn)不一致，故無法評(píng)價(jià)藥物的效果并明確其有效治療窗。因此，未來尚需進(jìn)一步進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)踐，收集一定量的患者樣本后，進(jìn)行血藥濃度-效果關(guān)聯(lián)性分析，為今后安羅替尼的TDM提供依據(jù)。

4 結(jié)語

綜上所述，本研究建立了基于鹽析輔助液液萃取結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)測(cè)定腫瘤患者血漿中安羅替尼濃度的分析方法;該方法所用血漿量少，不僅操作簡(jiǎn)單，還可以獲得成分相對(duì)的單一的基質(zhì)，且靈敏度高、精密度和準(zhǔn)確度良好、專屬性強(qiáng)，符合生物樣品中藥物定量分析方法學(xué)驗(yàn)證的基本要求[22]，可用于臨床開展安羅替尼的TDM。

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（收稿日期：2021-01-11 修回日期：2021-04-08）

（編輯：張?jiān)拢?/p>