石全英

摘要：以大豆油為樣品，經(jīng)液-液萃取提取凈化后，采用帶有紫外檢測器的高效液相色譜分析了苯并（a）芘含量，優(yōu)化了大豆油中苯并（a）芘的檢測技術(shù)。研究結(jié)果表明：該方法線性范圍0.10～50 μg/mL （R2=0.9999），檢測限3.90 μg/kg，定量限6.09 μg/kg，加標(biāo)回收率87.90%～98.00%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差1.05%～2.15%。該方法準(zhǔn)確、簡便、經(jīng)濟，適應(yīng)于植物油中苯并（a）芘的定性定量測定。

關(guān)鍵詞：苯并（a）芘；大豆油；優(yōu)化；液相色譜

中圖分類號： TS225

文獻標(biāo)識碼： A 文章編號： 16749944（2015）06026605

1 引言

苯并（a）芘（Benzo（a）pyrene，B（a）P），又稱3，4-苯并芘，屬于多環(huán)芳烴類（PAHs），是一種常見的高活性間接致癌物[1]。近年來，我國出口歐盟和韓國等國家的植物油中多次檢測出苯并（a）芘含量超標(biāo)，2010年“金浩”茶油的超標(biāo)事件再次敲響食用油安全的警鐘[2]。苯并芘可引發(fā)肺癌、胃癌、膀胱癌及消化道癌等多種癌癥[3，4]，苯并芘還具有致畸性和致突變性，它能通過母體經(jīng)胎盤影響子代，從而引起胚胎畸形或死亡以及幼仔免疫功能下降[5，6]。

目前，國內(nèi)外檢測植物油中苯并芘的方法主要有：熒光分析法、高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用、酶聯(lián)免疫吸附法，以上幾種方法靈敏度高[7]。在眾多的方法中，高效液相色譜法憑借其分離效率高，選擇性好，檢測靈敏度高，操作自動化，應(yīng)用范圍廣，被國內(nèi)外研究者廣為應(yīng)用。食用油中苯并（a）的芘檢測主要分為樣品的前處理和分析兩個基本過程。由于植物油中苯并（a）芘具有親油性，含量極微（多為痕量），穩(wěn)定性差，較容易吸附，且樣品基體成分復(fù)雜，存在多種潛在干擾物質(zhì)，如大量甘油三酯和脂肪物質(zhì)，影響苯并（a）芘的直接測定。目前，我國檢測植物油中苯并芘的國標(biāo)（GB/T22509-2008）存在著耗時長、操作復(fù)雜、回收率不穩(wěn)定等問題[8]。所以如何快速、準(zhǔn)確、簡便、經(jīng)濟地檢測出植物油中的苯并（a）芘含量，就成為含量分析工作的重點。

本研究針對現(xiàn)存植物油中苯并（a）芘危害因子檢測方法的不足，進一步探索了大豆油中苯并（a）芘簡便、高效的前處理和檢測方法，將對植物油中苯并（a）芘殘留進行高效的定性定量分析及食用油安全評估具有重要意義。

2 材料與方法

2.1 原料與試劑

2.1.1 實驗材料

一級大豆油，由中糧北海糧油工業(yè)（天津）有限公司提供。

2.1.2 實驗試劑

乙腈（色譜純），天津市北科化學(xué)品有限責(zé)任公司；甲醇（色譜純），天津市康克德科技有限公司；甲酸（分析純），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；磷酸（分析純），天津市北科化學(xué)品有限責(zé)任公司；二甲基亞砜（分析純），天津市北科化學(xué)品有限責(zé)任公司；正己烷（分析純），天津市北科化學(xué)品有限責(zé)任公司；氫氧化鉀（分析純），天津市北科化學(xué)品有限責(zé)任公司；鹽酸（分析純），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

2.2 主要儀器

ProStar高效液相色譜（配325-LC紫外檢測器），美國瓦里安公司； Evolution 300 紫外—可見分光光度計，美國Thermo Scientific公司。

2.3 實驗方法

2.3.1 苯并（a）芘檢測方法

（1）樣品前處理。稱取10g大豆油樣品，用50mL正己烷分?jǐn)?shù)次溶解，加入90%甲酸提取2次后（每次10mL），加入8%磷酸-二甲基亞砜溶液40mL，振搖2min，靜置分層，上層正己烷液中加入40mL二甲基亞砜，棄去上層正己烷溶液，合并兩次二甲基亞砜提取液，加入30mL正己烷反提取1次，棄去正己烷洗液。正己烷洗后的二甲基亞砜提取液中加入70mL體積比為1∶1鹽酸溶液，振搖2min，后用正己烷提取2次，每次40mL，振搖2min，棄去下層，合并兩次正己烷提取液。后用30mL5%氫氧化鉀溶液洗1次，蒸餾水洗2次，每次40mL，棄去水層，后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干，乙腈定容至0.50mL待測。

（2）樣品測定。瓦里安（Varian）色譜柱（Microsorb-MV 100-5 C18，250×4.6 mm×1/4"）；柱溫30℃；流動相：乙腈-水（88∶12，體積比）；流速1.00mL/min；進樣量20μL；檢測波長296nm。

2.3.2 色譜條件的優(yōu)化

（1）檢測波長。取苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)溶液在紫外-可見分光光度計下進行全波長掃描分析，波長范圍200～600 nm，得到苯并（a）芘-乙腈溶液紫外吸收光譜圖，確定苯并（a）芘-乙腈溶液檢測波長。

（2）流動相比例。柱溫30 ℃；流速1.00mL/min；進樣量20μL；檢測波長296nm。流動相比例：乙腈∶水=100∶0～50∶50（體積比），考察流動相比例與樣品分離效果的關(guān)系，確定流動相最佳比例。

（3）流速。柱溫30℃；流動相：乙腈∶水=88∶12（體積比）；進樣量20μL；檢測波長296nm。在0.60～1.60mL/min范圍內(nèi)改變載液流速，考察載液流速對樣品保留時間的影響，確定最佳流速。

2.3.3 苯并（a）芘提取條件的優(yōu)化

（1）提取溶劑及提取次數(shù)的選擇。選取正己烷、環(huán)己烷、異辛烷作為提取溶劑，分別提取1次、2次、3次，計算苯并（a）芘提取效率，確定最佳提取溶劑及相應(yīng)提取次數(shù)。

（2）磷酸-二甲基亞砜溶液最佳濃度的確定。取一定量的磷酸加入二甲基亞砜中，配制不同濃度（0%、4%、6%、8%、10%、12%）的磷酸-二甲基亞砜溶液。稱取1g油樣，用5mL正己烷分?jǐn)?shù)次溶解，分別加入不同濃度的磷酸-二甲基亞砜溶液4mL，振搖2min，靜置分層，觀察破乳效果，確定磷酸-二甲基亞砜溶液最佳濃度。

（3）樣品提取液凈化方法。稱取10g大豆油樣品，用50mL正己烷分?jǐn)?shù)次溶解，加入90%甲酸溶液提取2次（每次10mL），洗去提取液中大部分雜質(zhì)，后按2.3.1方法進行樣品處理與含量測定。對照組油樣經(jīng)正己烷溶解后，不經(jīng)甲酸提取，按2.3.1方法進行操作。對比液相色譜圖譜，分析甲酸凈化效果。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取10mg苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)品，色譜純乙腈溶解，定容至100mL，此溶液約含苯并（a）芘100μg/kg，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4℃避光保存。精密吸取貯備液，配制成0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)溶液。色譜條件：柱溫30℃；乙腈∶水=88∶12（體積比）；流速1.00mL/min；進樣量20μL；檢測波長296nm。每個濃度平行測定3次，以苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，作圖得苯并（a）芘的HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.5 HPLC穩(wěn)定性考察

色譜條件：柱溫30℃；流動相：乙腈∶水=88∶12（體積比）；流速1.00mL/min；進樣量20μL；檢測波長296nm。以0.2μg的苯并（a）芘連續(xù)進樣10次，分別記錄保留時間與峰高，計算保留時間與峰高的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察HPLC穩(wěn)定性。

2.3.6 檢測限與定量限

色譜條件：柱溫30℃；流動相：乙腈∶水=88∶12（體積比）；流速1.00mL/min；進樣量20μL；檢測波長296nm。取某一濃度的苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)品進行色譜分析，對標(biāo)準(zhǔn)品的峰高和噪音的峰高進行多次比較，取平均值，得出3倍和10信噪比時的濃度，即可得出本方法的檢測限與定量限。

2.3.7 精密度實驗

色譜條件：柱溫30℃；流動相：乙腈∶水=88∶12（體積比）；流速1.00mL/min；進樣量20μL；檢測波長296nm。取苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)品（10μg/mL）分別于日內(nèi)和日間（3d）重復(fù)進樣10次，計算其峰面積平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），考察日內(nèi)精密度和日間精密度。

2.3.8 回收率實驗

以不含苯并（a）芘的空白油樣中，加入不同量的苯并（a）芘，配置成不同濃度（7μg/kg、15μg/kg、30μg/kg）的苯并（a）芘加標(biāo)溶液，按2.3.1方法進行樣品處理與含量測定，每個濃度作3平行，計算樣品回收率及平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

W=C1-C2[]C1×100%（1）

式中：W為樣品回收率；C1為添加濃度（μg/kg）；C2為實測濃度（μg/kg）。

2.3.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0 軟件配對t檢驗（P≤0.05）和最小顯著性差異（LSD）對數(shù)據(jù)進行整理統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

3.1.1 檢測波長

苯并（a）芘屬于多環(huán)芳烴類化合物，具有較強的紫外吸收。但關(guān)于其最大吸收波長，很多報道都呈現(xiàn)不一致性。陳皓等[9]分別利用高效液相色譜和超高液相色譜在300nm波長下測定土壤中苯并（a）芘的含量。肖莉[10]和湯加云等[11]在波長254nm條件下，分別對瀝青煙霧和工業(yè)廢水中苯并（a）芘的含量進行分析。田曉玲等[12]測定飼料中的苯并（a）芘的含量時，采用已腈-水（75∶25）為流動相，檢測波長296nm。

本實驗中將苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)溶液在200～600nm下進行波長掃描，得到苯并（a）芘紫外吸收光譜圖。由圖1可見，苯并（a）芘-乙腈溶液在296nm處有最大吸收峰。因此，本實驗選擇296nm作為測定植物油中苯并（a）芘的紫外檢測波長。此波長下，測得苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)色譜圖（10μg/mL）見圖2。

3.1.2 流動相比例

流動相具有運載樣品分子和選擇分離的作用，當(dāng)固定相一定時，流動相的種類和各組分的比例等都嚴(yán)重影響樣品的分離效果。當(dāng)利用紫外檢測器測定目標(biāo)物含量時，應(yīng)避免選擇對紫外光有吸收的溶劑，反相高效液相色譜法測定苯并（a）芘時，常選用作為流動相的溶劑是甲醇和乙腈。當(dāng)利用紫外檢測器檢測時，乙腈產(chǎn)生的噪聲較小，另外，比較甲醇和乙腈在紫外檢測器檢測中的梯度基線時發(fā)現(xiàn)，色譜級乙腈產(chǎn)生較少鬼峰；考察乙腈和水、甲醇和水的混合液的比率與輸液壓力的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，甲醇與水混合產(chǎn)生壓力較高，而同樣的比例乙腈與水混合，流速一定時不在色譜柱上產(chǎn)生多余的壓力；一般情況下，乙腈的洗脫能力強。

綜合考慮溶劑的粘度、紫外吸收的強弱、洗脫效果等條件，本方法選取乙腈為流動相。通過改變流動相比例，得到流動相比例與樣品分離效果關(guān)系，見表1，可以看出，當(dāng)流動相乙腈與水的比例為88∶12時為測定苯并（a）芘的最佳條件。此流動相比例條件下，樣品與苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)品色譜見圖3。

3.2 苯并（a）芘提取條件的優(yōu)化

3.2.1 提取溶劑及提取次數(shù)的選擇

進行苯并（a）芘提取時，樣品溶劑的選擇通常要遵循必須與二甲基亞砜（DMSO）、二甲基亞酰胺（DMF）、硝基甲烷互不相容的原則。因為這三種溶劑對苯并（a）芘或有很強的選擇性，借助苯并（a）芘或多環(huán)芳烴類物質(zhì)在兩個互不混溶的溶劑中分配系數(shù)的不同，反復(fù)分配，使苯并（a）芘或多環(huán)芳烴類物質(zhì)從樣品溶液中濃縮富集于二甲基亞砜或二甲基亞酰胺液中。

本研究選取苯并（a）芘分析中三種較常見的提取溶劑：正己烷、環(huán)己烷、異辛烷，分別進行不同次數(shù)的樣品分析，結(jié)果顯示不同提取溶劑與提取次數(shù)對苯并（a）芘提取率有明顯影響（圖4）。當(dāng)使用環(huán)己烷與異辛烷作為提取溶劑時，隨著提取次數(shù)增多，提取率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，其中樣品經(jīng)過2次提取，已達到90%以上的提取率。當(dāng)使用正己烷提取2次時，其提取率已達97.22%，為三種溶劑中最高的提取率；之后再增加提取次數(shù)，提取率增加并不顯著，甚至出現(xiàn)下降的趨勢，說明經(jīng)過3次，苯并（a）芘已基本提取完全，之后的反復(fù)提取會造成苯并（a）芘的損失。結(jié)合苯并（a）芘提取率與成本因素，本實驗選擇正己烷為提取溶劑，提取次數(shù)為2次。

圖4 不同提取溶劑與提取次數(shù)對苯并（a）芘提取率的影響

3.2.2 磷酸-二甲基亞砜溶液最佳濃度的確定

弓玉紅等[13]報道在二甲基亞砜溶液中加入一定量的磷酸，具有消除混合液中乳化層的作用，且能消除背景物質(zhì)的干擾。本實驗利用不同濃度磷酸-二甲基亞砜溶液（0%～12%）進行樣品提取，研究了不同濃度的磷酸-二甲基亞砜溶液對提取液乳化層破壞程度的影響。由圖5可以看出，隨著磷酸-二甲基亞砜溶液濃度的增加，乳化現(xiàn)象逐漸減輕，當(dāng)加入8%磷酸-二甲基亞砜溶液時，乳化層基本消失。因此，當(dāng)磷酸-二甲基亞砜溶液濃度為8%時，即可達到破乳效果。推測當(dāng)加入磷酸后增加了界面張力，正己烷溶液分層加快。

圖5 不同濃度的磷酸＼|二甲基亞砜溶液對提取液乳化層破壞程度

3.2.3 樣品提取液凈化

過去用柱層、薄層層析或乙?；垖游觯赃_到和其它干擾物的分離，但是步驟繁多，容易造成苯并（a）芘的損失，使回收率不穩(wěn)定；另外工作量大，檢測成本高，因此采用硅膠對樣品進行凈化處理仍有待進一步探索。

本方法在提取前期，利用甲酸溶液將提取液中大部分雜質(zhì)洗去，即可達到一定的凈化效果。由圖6可以看出，不經(jīng)過甲酸處理的樣品在色譜圖上出現(xiàn)了大量雜峰，雜峰峰高較大，且有少量苯并（a）芘；經(jīng)甲酸凈化的樣品，雜峰明顯減少，部分雜峰峰高顯著降低，峰形改善。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

實驗結(jié)果表明，苯并（a）芘含量與峰面積的線性范圍為0.10～50μg/mL；回歸方程為y=3.1999x-0.1897（y為峰面積；x為濃度，μg/mL），相關(guān)系數(shù)為R2=0.9999，線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖7。

圖7 苯并（a）芘含量與峰面積關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.4 HPLC穩(wěn)定性考察

在選定的最佳色譜條件下，以0.20μg的苯并（a）芘連續(xù)進樣10次，分別記錄保留時間與峰高。結(jié)果顯示（表2），保留時間和峰高的均值分別為12.87min和121.14mAU；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.32%和1.75%，表明儀器有著良好的穩(wěn)定性和精密度。

3.5 檢測限與定量限

本實驗以3倍噪音比來確定檢測限，10倍噪音比來確定定量限。進空白樣，以基線3倍和10倍噪聲值在標(biāo)準(zhǔn)曲線查得結(jié)果并計算，得到本方法的檢測限為3.90μg/kg，定量限為6.09μg/kg，實驗結(jié)果表明本方法的靈敏度較高，能滿足實際測定的要求。

3.6 精密度實驗

本實驗在選定的最佳色譜條件下，取苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)品（10μg/mL）分別于日內(nèi)和日間（3d）重復(fù)進樣10次，考察日內(nèi)精密度和日間精密度。結(jié)果如表3所示，日內(nèi)峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.18，1.82%；日間峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.28，2.74%，表明本方法的精密度良好。

3.7 回收率實驗

本實驗以不含苯并（a）芘的空白油樣為樣品，設(shè)計7μg/kg、15μg/kg、30μg/kg三個添加濃度，計算不同濃度苯并（a）芘的回收率，考察方法的準(zhǔn)確度，結(jié)果見表4。從表4中可看出，樣品濃度為7μg/kg、15μg/kg、30μg/kg時，樣品平均回收率為87.90%、97.73%、98.00%，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為2.15%、1.99%、1.05% （n=3），表明該方法具有較高準(zhǔn)確度，能滿足分析要求。

4 結(jié)論

本研究優(yōu)化了大豆油中苯并（a）芘測定技術(shù)，大豆油樣品經(jīng)90%甲酸凈化，后經(jīng)正己烷、8%磷酸-二甲基亞砜溶液等萃取及反萃取純化，經(jīng)HPLC分離苯并（a）芘，采用紫外檢測器測定其含量。對苯并（a）芘測定的提取條件進行優(yōu)化，有效避免提取過程中乳化現(xiàn)象的產(chǎn)生，簡化了樣品提取液凈化過程，操作簡單、快速，便于掌握；同時，該方法采用液液分配及紫外檢測器分析樣品，使分析成本大大降低。方法線性范圍0.10～50μg/mL（R2=0.9999），檢測限3.90μg/kg，定量限6.09μg/kg，加標(biāo)回收率87.90%～98.00%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差1.05%～2.15%。該方法準(zhǔn)確、簡便、經(jīng)濟，適應(yīng)于植物油中苯并（a）芘的定性定量測定。

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