趙超敏+岳振峰+吳暉+歐陽姍+賴富饒?ばこ鹿?+張毅+康海寧+華紅慧

摘 要 建立了黃油中雌酮、α 雌二醇、β雌二醇、雌三醇、睪酮、表睪酮、孕酮和丙酸睪酮8種類固醇激素的凝膠滲透色譜（GPC） 液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜（LC MS/MS）檢測(cè)方法。樣品用乙酸乙酯 環(huán)己烷（1∶1，V/V）提取，提取液經(jīng)GPC柱凈化除脂，GPC濃縮液采用C18色譜柱（100 mm×2.0 mm i.d.， 3.0 μm）分離，以乙腈和水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，電噴霧電離多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行定性和定量分析。8種類固醇激素以基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量，藥物在1.0～20.0 μg/kg線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999；方法檢出限（S/N=3）為0.04～0.30 μg/kg，定量限LOQs（S/N=10）為1.0 μg/kg；添加水平為1.0， 2.0， 4.0 μg/kg時(shí)，回收率范圍在64.1%～110%之間；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于11%。結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確、可靠，滿足黃油中8種類固醇激素的檢測(cè)分析要求。

關(guān)鍵詞 雌性激素； 雄性激素； 孕激素； 黃油； 液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜； 凝膠滲透色譜

1 引 言

激素分析一直是診斷類固醇激素合成和代謝紊亂的重要手段[1]。動(dòng)物源食品中激素殘留的檢測(cè)經(jīng)常被報(bào)道，因?yàn)榧に乜杀挥糜谛竽翗I(yè)以提高飼料轉(zhuǎn)化率，達(dá)到促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、動(dòng)物的同期發(fā)情及增加體重和育肥等目的，如雌二醇和睪酮等[2]。動(dòng)物源食品中的激素殘留通過食物鏈進(jìn)入人體會(huì)產(chǎn)生健康危害，如生長(zhǎng)發(fā)育障礙、出生缺陷和生長(zhǎng)發(fā)育缺陷等[3]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部176號(hào)[4]、193號(hào)[5]和235號(hào)公告[6]明確規(guī)定，在動(dòng)物食品中不得檢出雌二醇和丙酸睪酮等激素類藥物，許多國(guó)家和地區(qū)已禁止某些類固醇激素作為動(dòng)物促生長(zhǎng)劑[7]。黃油主要由甘油三酯（98%）、甘油二酯、單甘油酯和游離脂肪酸組成，已確定的脂肪酸約有500種，其它組分包括磷脂、腦苷脂、固醇、脂溶性維生素（VA， VD和VE）、色素（胡蘿卜素）、礦物質(zhì)和風(fēng)味組分等。其中亞油酸的異構(gòu)體共軛亞油酸具有抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗高血壓和提高免疫力等功能；人類共軛亞油酸主要來自反芻動(dòng)物食品，奶制品約占70%[8～12]。黃油因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、供能特性、良好的質(zhì)構(gòu)和口感特性而受到廣泛歡迎，越來越多地被用于焙烤工業(yè)和餐飲業(yè)，中國(guó)2012年黃油累計(jì)進(jìn)口量同2011年相比，同比增加10.6%[13]。人造黃油雖和黃油具有類似的食品加工特性，但其主要成分為氫化植物油和食品添加劑，基本沒有激素殘留的風(fēng)險(xiǎn)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也較差。關(guān)于動(dòng)物源食品中激素的研究報(bào)道多是關(guān)于豬肉、牛肉[14]、羊肉、雞肉和肝臟[15]、牛奶[16]、雞蛋[17]和水產(chǎn)品[18]等，尚未見到黃油等高脂肪含量樣品的報(bào)道。

黃油脂肪含量高，因此選擇去除油脂效果良好的凝膠滲透色譜法（GPC）凈化。GPC凈化技術(shù)已成功應(yīng)用于農(nóng)藥殘留分析[19～21]，近年來也有關(guān)于藥物殘留分析的報(bào)道，只有少量報(bào)道是關(guān)于激素分析[22，23]。類固醇激素的常用檢測(cè)分析方法有GC MS法和LC MS/MS法等[24，25]， 但是GC MS法靈敏度低，并且需要衍生化，過程復(fù)雜且耗時(shí)；LC MS/MS法靈敏度高、重復(fù)性好、分析時(shí)間短，因此本文選擇了全自動(dòng)GPC凈化系統(tǒng)與LC MS/MS相結(jié)合檢測(cè)黃油中的8種類固醇激素（圖1），凈化效果好、回收率高、靈敏度高和重現(xiàn)性好，滿足殘留分析技術(shù)要求。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

API5000型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀配電噴霧離子源（美國(guó)AB公司）；1200型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；全自動(dòng)凝膠凈化系統(tǒng)（GPC Vario，德國(guó)LCtech公司）；漩渦振蕩器（德國(guó)Heidolph公司）；低溫離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；往復(fù)式振蕩器（日本Yamato公司）；恒溫振蕩水浴搖床（德國(guó)Julabo公司）；全自動(dòng)氮吹儀（美國(guó)Caliper公司）；移液器（法國(guó)Gilson公司）。

類固醇激素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)睪酮、17α雌二醇、17β雌二醇、雌三醇、雌酮、孕酮、丙酸睪酮和表睪酮（純度≥98%）購自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、環(huán)己烷、乙酸乙酯和乙腈（HPLC級(jí)）購自美國(guó)TEDIA公司。

黃油樣品：市售進(jìn)口黃油（非人造黃油）。

2.2 GPC條件

2.3 色譜/質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件 雌性激素負(fù)離子模式： 流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為乙腈。液相洗脫條件為： 0.0 min（35%B）

SymbolnB@ 18.0 min（35%B），進(jìn)樣量： 10 μL， 流速： 250 μL/min。

雄性激素與孕激素正離子模式： 流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為乙腈。 液相洗脫條件為： 0.0 min（35%B）

2.3.2 質(zhì)譜條件 負(fù)離子模式（ESI

Symbolm@@ ）：碰撞氣壓41.4 kPa，氣簾氣壓241.3 kPa，霧化氣壓275.8 kPa，去溶劑氣壓482.7 kPa，離子噴霧電壓

Symbolm@@ 4500 V，離子源溫度500 ℃。

正離子模式（ESI+）：碰撞氣壓41.4 kPa，氣簾氣壓241.3 kPa，霧化氣壓275.8 kPa，去溶劑氣壓482.7 kPa，離子噴霧電壓5500 V，離子源溫度500 ℃。

2.4 樣品處理 稱取1g樣品（精確到0.01g）于15 mL具塞離心管中，加5 mL環(huán)己烷/乙酸乙酯（1∶1，V/V）渦旋1 min，溶解后定容至10.0 mL，定容液往復(fù)振蕩20 min和45 ℃下水浴5 min，然后在9500 r/min下離心5 min， 收集上清液至GPC樣品瓶中，經(jīng)GPC凈化、濃縮，濃縮液40 ℃氮?dú)獯抵两桑?用35%乙腈溶液溶解濃縮物并定容至1.0 mL，過0.22 μm濾膜，供測(cè)定。

3 結(jié)果與討論

3.1 提取溶劑的選擇

激素常用提取溶劑為乙腈[26]、甲醇[17]和叔丁基甲醚[2]。激素是分子量較小的脂溶性物質(zhì)，樣品中激素含量與脂含量成正比[27]。黃油是新鮮牛奶加以攪拌之后上層的濃稠狀物體濾去部分水分之后的產(chǎn)物，其含脂量高，常用提取溶劑對(duì)其溶解性差，叔丁基甲醚和正己烷可溶解黃油，但溶解效果低于乙酸乙酯/環(huán)己烷。乙酸乙酯/環(huán)己烷（1∶1，V/V）能溶解油脂，且溶解黃油為澄清溶液，乙酸乙酯/環(huán)己烷也是凝膠色譜常用流動(dòng)相，因此選擇乙酸乙酯/環(huán)己烷（1∶1，V/V）作為提取溶劑。

3.2 GPC凈化條件的確定

黃油含脂量高，激素脂溶性強(qiáng)，基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重，有效去除油脂是準(zhǔn)確測(cè)定黃油中激素的關(guān)鍵。GPC根據(jù)被分離物質(zhì)分子量大小不同而分離，能有效去除油脂和色素等大分子物質(zhì)。選擇型號(hào)40010凝膠柱，Bio Beads SX 3是為柱填料。流動(dòng)相選擇沸點(diǎn)一致的乙酸乙酯（77 ℃）和環(huán)己烷（88.7 ℃），因沸點(diǎn)一致比例不會(huì)發(fā)生顯著變化，洗脫條件較穩(wěn)定。進(jìn)樣量為5 mL，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

GPC凈化主要是切割時(shí)間點(diǎn)的選擇，要充分考慮排除的基質(zhì)與待測(cè)物的分離情況，如凝膠色譜圖2所示，當(dāng)流速為4.7 mL/min時(shí)，大分子物質(zhì)油脂的保留時(shí)間在4～9 min，10 min時(shí)被完全洗脫下來，因此本實(shí)驗(yàn)前運(yùn)行時(shí)間設(shè)計(jì)為10～11 min， 其間隔周期為10 s； 主收集時(shí)間設(shè)計(jì)為16.5， 20， 33和50 min。 如圖3A所示，前運(yùn)行時(shí)間在10 min 時(shí)加標(biāo)回收率最高，但是在10.5 min之前存在基質(zhì)效應(yīng)，有部分油脂被接收，因此綜合考察加標(biāo)回收率、除脂效果和基質(zhì)效應(yīng)，最終選擇前運(yùn)行時(shí)間為10.5 min； 圖3B所示，主收集時(shí)間在33 min時(shí)回收率最大，時(shí)間即使再延長(zhǎng)回收率也變化不大，因此選擇主收集時(shí)間為33 min； 流速分別考察了4.0， 4.5和4.7 mL/min，結(jié)果顯示， 在獲得相近回收率情況時(shí)，增大流速，縮短了樣品的前運(yùn)行時(shí)間和主收集時(shí)間，因此為了縮短樣品處理時(shí)間，流速選擇為4.7 mL/min。

GPC凈化后結(jié)合SPE柱（Florisil柱：6 mL，1 g，Supelco）凈化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用GPC凈化與GPC SPE聯(lián)用凈化效果相同，但是GPC SPE聯(lián)用的加標(biāo)回收率稍低于單獨(dú)使用GPC，因此，為了減少目標(biāo)物的損失，只選擇GPC凈化就能滿足實(shí)驗(yàn)要求。

3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取濃度為1.0 mg/L的各激素標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用微量擠壓泵連續(xù)進(jìn)樣，一級(jí)質(zhì)譜全掃描，確定準(zhǔn)分子離子。結(jié)果顯示，4種雌激素在負(fù)離子模式下獲得準(zhǔn)分子離子峰，3種雄性激素和1種孕激素在正離子模式下獲得準(zhǔn)分子離子。以母離子為準(zhǔn)分子離子進(jìn)行掃描二級(jí)質(zhì)譜，選豐度較高的兩個(gè)碎片離子作為定性定量離子，并優(yōu)化對(duì)應(yīng)離子對(duì)的去簇電壓（Decluste ring potential，DP）、碰撞能（Collision energy，CE）、碰撞室出口電壓（Collision cell exit potential，CXP）和碰撞室入口電壓（Entrance potential，EP）。綜合所有離子對(duì)響應(yīng)信號(hào)優(yōu)化了質(zhì)譜離子源溫度（Temperture，TEM）、碰撞氣壓（Collision gas，CAD）、氣簾氣壓（Curtain gas，CUR）、霧化氣壓（GS1）、去溶劑氣壓（GS2）和離子源噴霧電壓（Ion spray voltage，IS）。碰撞室出口電壓為15 V， 碰撞室入口電壓為10 V，主要質(zhì)譜參數(shù)見表1。

3.4 液相色譜條件優(yōu)化

分別選擇乙腈 水和乙腈（0.1%甲酸） 水（0.1%甲酸）為流動(dòng)相，選擇C18色譜柱，采用不同色譜柱、流動(dòng)相和流速分析結(jié)果。結(jié)果表明， YMC Hydrosphere C18色譜柱優(yōu)于Agilent poroshell C18色譜柱， Hydrosphere柱分離效果、批次重現(xiàn)性、重復(fù)性和峰型（窄而無拖尾）均較好， 其色譜圖如圖4； Poroshell柱重復(fù)性差，峰型不穩(wěn)定，批次間響應(yīng)值差異大，且峰裂較嚴(yán)重。選擇YMC柱為分離柱，改變柱溫（20，25和30 ℃）對(duì)分析物分離效果及響應(yīng)值的變化影響不大，因此柱溫選擇為室溫； 正離子模式時(shí)， 流動(dòng)相加甲酸并沒有顯著提高分析物的響應(yīng)信號(hào)，乙腈在負(fù)離子模式時(shí)有利于分析物的去質(zhì)子化，因此， 正負(fù)離子模式時(shí)流動(dòng)相選擇為乙腈/水；流速分別采用0.2， 0.25和0.3 mL/min，分析結(jié)果顯示，雌激素在0.25 mL/min時(shí)靈敏度高、分離度好，雄激素和孕激素在0.2 mL/min時(shí)靈敏度高、分離度好；α雌二醇和β雌二醇、睪酮和表睪酮是差向異構(gòu)體，異構(gòu)體的特征離子對(duì)相同，所以同時(shí)檢測(cè)兩對(duì)異構(gòu)體時(shí)僅靠離子的對(duì)差異性分不開，因此必須優(yōu)化液相條件使得差向異構(gòu)體分開，研究發(fā)現(xiàn)， 優(yōu)化的液相條件對(duì)兩對(duì)差向異構(gòu)體分離度好。

3.5 分析方法的評(píng)價(jià)

3.5.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限 采用基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。回歸方程的獲得是利用濃度范圍為1.0～20.0 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以濃度為橫坐標(biāo)（x， μg/kg）和定量離子對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸計(jì)算，所得相關(guān)系數(shù)均大于0.999，線性關(guān)系良好。檢出限（LOD）和定量限（LOQ）根據(jù)信噪比S/N=3和S/N≥10確定，8種類固醇激素的LODs為0.04～0.30 μg/kg，定量限LOQs確定為1.0 μg/kg。

3.5.2 方法的回收率與精密度 按照1.0， 2.0， 4.0 μg/kg 濃度水平對(duì)空白黃油樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次，計(jì)算平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），回收率為64.1% 110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%～11%（表2）?？梢?，方法的準(zhǔn)確度和精密度符合禁用藥物分析技術(shù)要求。

3.6 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用所建方法對(duì)4個(gè)市售黃油樣品進(jìn)行分析，結(jié)果見表3，樣品1和樣品2中均含有孕酮、表睪酮、雌酮和α雌二醇； 樣品3和樣品4中含有孕酮、表睪酮和雌酮，但除孕酮外，其它激素的含量均小于方法的定量限；4個(gè)樣品中均未檢出β雌二醇、雌三醇、睪酮和丙酸睪酮。4個(gè)市售黃油樣品中孕酮含量最高，樣1，2和4含量相近，范圍在127～138 μg/kg，這與文獻(xiàn)報(bào)道的黃油中孕酮含量值（132.9±5.1） μg/kg相近[28]，樣3含量稍高，達(dá)180.8 μg/kg，但4個(gè)樣品中孕酮含量均低于另一文獻(xiàn)報(bào)道中黃油孕酮含量值300 μg/kg[29]，在4個(gè)樣品中也檢測(cè)到雌激素雌酮或α雌二醇，這也與文獻(xiàn)[30]報(bào)道牛奶中主要雌激素是雌酮和雌二醇一致，本實(shí)驗(yàn)與此文獻(xiàn)差異為在報(bào)道中還檢出α雌二醇的差向異構(gòu)體β雌二醇。很少有報(bào)道對(duì)牛奶或黃油中雄性激素進(jìn)行檢測(cè)，但是曾有研究者在牛奶中檢測(cè)出睪酮（0.02～

4 結(jié) 論

建立了黃油中8種類固醇激素的凝膠滲透色譜（GPC） 液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜（LC MS/MS）檢測(cè)方法。所建GPC法簡(jiǎn)化了復(fù)雜的樣品前處理過程，凈化效果好，有效降低了樣品中基質(zhì)對(duì)激素檢測(cè)的干擾，目標(biāo)物回收率高。應(yīng)用所建方法對(duì)實(shí)際動(dòng)物黃油樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確可靠，滿足高脂樣品中類固醇激素殘留量的確證檢測(cè)要求，對(duì)高脂含量樣品中藥物殘留分析具有一定參考意義。

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