楊兆鵬等

摘 要 多囊卵巢綜合征是育齡期婦女最為常見的內(nèi)分泌以及代謝紊亂疾病，是女性不孕的主要原因之一。多囊卵巢綜合征患者臨床存在很大的異質(zhì)性，其致病機理尚未完全闡明。本研究基于反相液相色譜與串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（RPLC/Q-TOF-MS），對74例多囊卵巢綜合征患者和54例正常女性的血清進(jìn)行了脂質(zhì)組學(xué)分析，定性鑒別出15類314種脂質(zhì)化合物。數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗尋找潛在的差異化合物， p<0.05為顯著性差異。結(jié)果表明：多囊卵巢綜合征患者與正常人相比，不飽和脂肪酸、部分鞘磷脂、甘油二酯、甘油三酯呈上調(diào)趨勢； 部分磷脂酰膽堿、溶血性磷脂酰膽堿、溶血性磷脂酰乙醇胺呈下調(diào)趨勢。而肥胖多囊卵巢綜合征患者與非肥胖多囊卵巢綜合征患者相比，不飽和脂肪酸、鞘磷脂、甘油二酯、甘油三酯上調(diào)更為明顯； 溶血性磷脂酰膽堿、部分磷脂酰膽堿下調(diào)更為明顯。本研究結(jié)果表明，脂質(zhì)組學(xué)是研究疾病分型的有效手段。

關(guān)鍵詞 多囊卵巢綜合征； 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用； 脂質(zhì)組學(xué)； 脂質(zhì)代謝異常

1 引 言

多囊卵巢綜合征（Polycystic ovarian syndrome，PCOS）是女性不孕的主要原因之一，在育齡婦女人群中的發(fā)病率為6%～10%[1]。PCOS主要臨床表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)、慢性無排卵、卵巢多囊性改變，以及多毛癥和黑棘皮癥等，嚴(yán)重影響患者的身心健康。PCOS具有非常大的異質(zhì)性，給診斷帶來困難。Zhao等[2]用代謝組學(xué)方法探討了代謝標(biāo)志物進(jìn)行PCOS輔助診斷的可能性。

脂質(zhì)組學(xué)是研究生物體內(nèi)脂質(zhì)代謝變化以及脂質(zhì)調(diào)控在生命活動中作用的有效手段[3]。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是目前主要的研究方法，反相液相色譜法由于柱效高、分離效果好，被廣泛應(yīng)用于脂質(zhì)分析中。Hu等[4]將反相液相色譜法應(yīng)用于p53突變的小鼠血漿研究中，各類脂質(zhì)均得到了良好分離，線性特性和檢測限也令人滿意。

血脂代謝異常是PCOS患者的臨床表現(xiàn)之一，主要表現(xiàn)為甘油三酯、總膽固醇、極低密度脂蛋白升高和高密度脂蛋白降低[5]。但是目前尚沒有針對PCOS患者血清的脂質(zhì)組學(xué)研究。本研究采用反相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）的脂質(zhì)組學(xué)方法，對PCOS患者血清進(jìn)行了脂質(zhì)組學(xué)研究，希望發(fā)現(xiàn)PCOS患者的差異脂質(zhì)化合物，為了解患者脂質(zhì)代謝特征提供幫助。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

采用AcquityTM UPLC 液相色譜儀（美國Waters公司）與5600質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司）聯(lián)用進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析。分別使用正負(fù)離子掃描模式對樣本進(jìn)行檢測，色譜柱為ACQUITY UPLC C8柱（10 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司）。

甲醇、乙腈（HPLC級，Merck公司）； 乙酸銨（HPLC級）、 內(nèi)標(biāo)脂肪酸FFA 16-d3和FFA 18-d3（Sigma公司）； 磷脂酰膽堿PC 38∶0、磷脂酰乙醇胺PE 34∶0、溶血性磷脂酰膽堿LPC 19∶0、鞘脂SM 12∶0、甘油三酯TAG 45∶0和神經(jīng)酰胺Cer 17∶0（美國Avanti Polar Lipids公司）。實驗用水為超純水（Milli-Q，美國Millipore公司）。

2.2 血液樣本采集

采用黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科門診和哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院體檢中心提供的74例PCOS患者血樣和54例正常女性血樣。研究經(jīng)過黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院機構(gòu)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者都簽署了知情同意書。按照2003年鹿特丹會議提出的排除性標(biāo)準(zhǔn)[6]，在排除了先天性腎上腺皮質(zhì)增生、庫欣綜合征等疾病之后， 滿足下列3條標(biāo)準(zhǔn)中的兩條即可診斷為PCOS： （1） 稀發(fā)排卵或者不排卵； （2） 高雄激素血癥或高雄激素臨床表現(xiàn)； （3） 卵巢多囊性改變。

正常人在生理月經(jīng)周期第3～5天采血，PCOS患者在生理月經(jīng)周期或者孕激素降低第3～5天或者兩側(cè)卵巢均無優(yōu)勢卵泡時采血。所有采樣對象在前一天避免劇烈運動，于次日早晨采血。血樣采集后靜置30 min，離心后取血清置于-80℃保存。

根據(jù)身高體重指數(shù)（BMI），將74例PCOS患者和54例正常女性又分為肥胖組（BMI>23）和非肥胖組（BMI≤23），即4組：非肥胖正常組（36例）、肥胖正常組（18例）、非肥胖PCOS組（39例）、肥胖PCOS組（35例）。

2.3 樣本預(yù)處理

配制含內(nèi)標(biāo)的甲醇溶液，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度分別為：PC 38∶0為0.67 μg/mL，PE 34∶0為0.33 μg/mL，LPC 19∶0為0.33 μg/mL，SM 12∶0為0.17 μg/mL，TAG 45∶0為0.53 μg/mL，Cer 17∶0為0.53 μg/mL，F(xiàn)FA 16-d3為0.67 μg/mL，F(xiàn)FA 18-d3為0.67 μg/mL。

血液樣本的預(yù)處理：血樣于4℃下解凍后取40 μL于2 mL離心管中，加入300 μL含有內(nèi)標(biāo)的甲醇溶液（冰上操作），渦旋30 s，加入1 mL甲基叔丁基醚，室溫下振蕩1 h。加入250 μL水，渦旋30 s，于4℃以12000 r/min離心10 min。取上清液400 μL于1.5 mL離心管中凍干。復(fù)溶時先加入40 μL二氯甲烷-甲醇（2∶1， V/V），再加入120 μL含5 mmol/L乙酸銨的乙腈-異丙醇-水（65∶30∶5， V/V），渦旋30 s，離心后， 取60 μL上清液于裝有內(nèi)襯管中的玻璃瓶中用于進(jìn)樣。

質(zhì)量控制樣本（QC）平行地穿插在整個分析過程中，用于評價整個分析過程的重復(fù)性。QC樣本來自全部74例PCOS患者和54例正常女性血樣的混合。用QC樣本平衡儀器，待儀器響應(yīng)穩(wěn)定后再進(jìn)行樣本的分析，每10個樣本插入1個QC樣本。

2.4 基于LC-MS的脂質(zhì)組學(xué)分析條件

UPLC條件：流動相A相為含10 mmol/L 乙酸銨的乙腈-水（6∶4， V/V），B相為含10 mmol/L乙酸銨的異丙醇-乙腈（9∶1， V/V）。梯度洗脫程序：0～15.5 min，32% B； 15.5～15.6 min，85%～97% B； 15.6～18.1 min，97% B； 18.1～20.1 min，32% B。流速為0.26 mL/min。柱溫為55℃，樣本室溫度為10℃。進(jìn)樣量為5 μL。

Mass條件：在全掃獲得一級譜圖的同時進(jìn)行數(shù)據(jù)相關(guān)采集模式（IDA）獲得二級譜圖。正離子模式掃描范圍為100～1500 Da，質(zhì)量偏差為50 mDa。離子源霧化氣Gas1和輔助氣Gas2 都為344.75 Pa， 氣簾氣Curtain Gas為241.33 Pa，溫度為500℃，噴霧電壓（Ion spray voltage floating， ISVF）為5500 V。去簇電壓（Declustering potential， DP）為80 V，碰撞能（Collision energy， CE）為35 V。負(fù)離子模式掃描范圍為90～1500 Da，質(zhì)量偏差為50 mDa。離子源霧化氣Gas1 和輔助氣Gas2都為379.23 Pa，氣簾氣為241.33 Pa，溫度為600℃，噴霧電壓ISVF為 -4500 V。去簇電壓DP為 -100 V，碰撞能CE為45 eV。

2.5 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)采用美國ABSCIEX公司LIPIDVIEWVersion1.2軟件進(jìn)行定性鑒定，根據(jù)保留時間、精確質(zhì)量數(shù)、二級質(zhì)譜圖進(jìn)行色譜峰識別。定性的脂質(zhì)化合物用MultiQuant 2.1軟件進(jìn)行峰提取，并用相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正。

脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)利用美國SPSS公司SPSS 16.0軟件進(jìn)行非參數(shù)檢驗，p<0.05表示有顯著性差異。

3 結(jié)果與討論

3.1 基于LC-MS的脂質(zhì)組學(xué)分析

本研究采用非靶向的脂質(zhì)組學(xué)方法對74例PCOS患者和54例正常女性的血清進(jìn)行了脂質(zhì)組學(xué)分析。由于實驗采用的是反相色譜，極性較強的溶血磷脂如溶血性磷脂酰膽堿等先流出，非極性的甘油三酯后流出。同一類別的脂質(zhì)分子主要是根據(jù)脂肪鏈的長短和不飽和度的大小實現(xiàn)分離。正負(fù)離子模式下的基峰離子流圖如圖1所示，不同類別的脂質(zhì)均得到良好分離。

本研究采用IDA掃描模式，在全掃描獲得一級譜圖的同時獲得二級譜圖信息，因此可以快速獲得更為詳細(xì)的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)信息。再根據(jù)保留時間、精確質(zhì)量數(shù)、二級斷裂規(guī)律，實現(xiàn)定性分析。共檢測到15類脂質(zhì)代謝物，包括游離脂肪酸（FFA）、溶血性磷脂酰膽堿（LPC）、溶血性磷脂酰乙醇胺（LPE）、溶血性磷脂酰肌醇（LPI）、磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰甘油（PG）、磷脂酸（PA）和鞘磷脂（SM）、神經(jīng)酰胺（Cer）、糖基化的神經(jīng)酰胺（HexCer）、膽固醇酯（CE）、二酰甘油（DAG）、三酰甘油（TAG）。鑒定的結(jié)果如表1所示。正離子模式下鑒定出249種化合物，負(fù)離子模式下鑒定出215種化合物。其中LPC、LPE、PC、PE、SM等150種脂質(zhì)化合物在正負(fù)離子模式下均能檢測，因此最終本研究共定性鑒定出314種脂質(zhì)化合物。

QC樣本用于評價分析方法的重復(fù)性，如圖2所示：正離子模式下RSD<15%的化合物百分比達(dá)79.5%，RSD<30%的化合物百分比達(dá)93.7%； 負(fù)離子模式下， RSD<15%的化合物百分比達(dá)63.2%，RSD<30%的化合物百分比達(dá)94.4%。說明本法的分析重復(fù)性良好，適用于脂質(zhì)組學(xué)研究。

3.2 臨床數(shù)據(jù)比較

本研究選擇與PCOS患者年齡、BMI指數(shù)相匹配的正常人做對照。臨床數(shù)據(jù)表明，PCOS患者的腰臀比、腰圍顯著高于正常人，此外在多毛評分、黑棘皮發(fā)病率、溢脂發(fā)病率方面也顯著高于正常人； PCOS患者血清泌乳素、睪酮、游離雄激素指數(shù)升高，性激素結(jié)合球蛋白下降，表明PCOS患者激素代謝紊亂； PCOS患者的空腹葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白升高，高密度脂蛋白下降，表明PCOS患者的糖脂代謝狀況紊亂。

已有的研究表明，肥胖PCOS患者和非肥胖PCOS患者在發(fā)病機理、臨床表現(xiàn)等方面有差異[7]?；诖?，本研究將疾病組和正常組又分為肥胖組和非肥胖組。肥胖PCOS患者與非肥胖PCOS患者相比，腰臀比、收縮壓、舒張壓升高； 黑棘皮發(fā)病率，溢脂發(fā)病率、粉刺發(fā)病率升高； 空腹胰島素水平、穩(wěn)態(tài)胰島素評價指數(shù)升高； 低密度脂蛋白、甘油三酯升高，高密度脂蛋白下降； 性激素結(jié)合球蛋白下降。

3.3 PCOS差異代謝物的變化趨勢以及可能的生理學(xué)意義

在PCOS患者和正常人這兩組中， 對定性鑒定出的314種脂質(zhì)化合物進(jìn)行了非參數(shù)檢驗（p<0.05認(rèn)為有顯著性差異），其中66種變化倍率較大（即PCOS組和正常組比值小于0.9和大于1.2）的差異化合物可視化變化結(jié)果顯示在熱圖中（圖3）。從圖3可見，相對于正常人，在PCOS患者中，LPC、LPE、部分PC、PI下調(diào)； 不飽和脂肪酸UFA、部分SM、DAG以及TAG上調(diào)。

此外，應(yīng)用非參數(shù)檢驗研究了肥胖PCOS患者與非肥胖PCOS患者在脂質(zhì)代謝方面的差異，其差異化合物在圖3中以紅色標(biāo)示。綜合上述兩組對比的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：LPC、部分PC在PCOS組下調(diào)，且在肥胖PCOS組下調(diào)更為明顯； UFA、部分SM、DAG、TAG在PCOS組上調(diào)，且在肥胖PCOS組中上調(diào)更為明顯。

圖3 差異脂類代謝物的熱圖（標(biāo)記為紅顏色表示在肥胖PCOS患者與非肥胖PCOS患者中有差異）Fig.3 Heat map of differential lipids（Lipids in red show significant difference in obese polycystic ovarian syndrome （PCOS） and lean PCOS）

游離脂肪酸是人體內(nèi)的儲能物質(zhì)，臨床上很多疾病的發(fā)生發(fā)展與血清中游離脂肪酸的濃度異常密切相關(guān)，脂肪酸還是一些重要生理活動如胰島素分泌過程的的信號分子[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在PCOS患者中，多不飽和脂肪酸（如FFA20∶4， FFA22∶4， FFA22∶5）升高，且在肥胖的PCOS患者中升高更為顯著，結(jié)果如圖4A， 4B， 4C所示。許多研究表明，上調(diào)的游離脂肪酸含量與胰島素抵抗密切相關(guān)[9]。游離脂肪酸可激活C-Jun氨基末端激酶（JNK）信號通路，使胰島素受體底物-1（IRS-1）上的絲氨酸磷酸化水平升高，進(jìn)而減弱了胰島素靶器官中胰島素信號通路的作用[10]。本研究臨床數(shù)據(jù)表明，肥胖PCOS患者的空腹胰島素水平較非肥胖PCOS患者顯著升高，這也可能與肥胖PCOS患者游離脂肪酸增高相關(guān)。

LPC是脂肪酸誘導(dǎo)產(chǎn)生胰島素抵抗過程中重要的中介物[11]。如圖3所示，PCOS患者與正常人相比，LPC呈下調(diào)趨勢，這種變化在肥胖PCOS和肥胖正常人兩組對比中尤為明顯，圖4D，4E，4F清楚地顯示了這一變化。文獻(xiàn)＼[12＼]表明，LPC在葡萄糖轉(zhuǎn)運、吸收利用等方面發(fā)揮了重要作用，可能成為一種獨立的胰島素信號來調(diào)節(jié)體內(nèi)葡糖糖的含量。有研究表明，在肥胖和2型糖尿病患者體內(nèi)LPC也成下調(diào)趨勢， Barber等[13]發(fā)現(xiàn)，LPC的含量和肥胖呈負(fù)相關(guān)； Li等[14]發(fā)現(xiàn)，LPC可作為高脂肪膳食引起肥胖的標(biāo)志物，與野生型的小鼠相比，CYP1B1基因敲除的小鼠的血清中LPC明顯下降。另外CYP1B1對于維持人體內(nèi)雌激素代謝的穩(wěn)定具有重要作用[15]。PCOS患者的雌激素分泌異常也是其臨床特征之一。由此推測，PCOS患者血清中LPC含量下降，雄激素和雌激素的比例失衡，可能與CYP1B1基因被抑制有關(guān)。

圖4G和4H表明，PCOS患者與正常人相比，甘油二酯和甘油三酯增加，與臨床數(shù)據(jù)中TG含量增高吻合，高濃度的甘油三酯水平可增加PCOS患者患動脈粥樣硬化和冠心病的風(fēng)險[16]。脂質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，包含多不飽和脂肪酸鏈的TG增高更為顯著。此外，鞘磷脂SM（d18∶0/18∶0）在PCOS患者中顯著上調(diào)，在肥胖PCOS患者中上調(diào)更為顯著，如圖4I所示。Samad等[17]發(fā)現(xiàn)，鞘磷脂的集聚在動脈粥硬化的發(fā)展過程中有著重要作用。鞘磷脂在低密度脂蛋白LDL中的含量高于在高密度脂蛋白HDL； 從PCOS患者臨床指標(biāo)可知，低密度脂蛋白LDL上升，高密度脂蛋白HDL下降，這也可能與鞘磷脂的增高相關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究將基于LC-MS的脂質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)用于PCOS患者的血清研究，發(fā)現(xiàn)PCOS患者與正常人相比，不飽和脂肪酸、部分鞘磷脂、甘油二酯、甘油三酯呈上調(diào)趨勢，部分磷脂酰膽堿、溶血性磷脂酰膽堿、溶血性磷脂酰乙醇胺呈下調(diào)趨勢。不飽和脂肪酸、部分鞘磷脂、甘油二酯、甘油三酯在肥胖PCOS組上調(diào)更為明顯； 部分磷脂酰膽堿、溶血性磷脂酰膽堿在肥胖PCOS組下調(diào)更為明顯。這些現(xiàn)象表明，PCOS患者脂質(zhì)代謝異常，且肥胖PCOS患者相較非肥胖PCOS患者的脂質(zhì)代謝紊亂更為嚴(yán)重。本研究的結(jié)果提示，PCOS患者，特別是肥胖PCOS患者， 胰島素抵抗和動脈粥樣硬化、冠心病的風(fēng)險增加。

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