張曉丹 李文娣 張茹 盛潔靜 張佳男 劉慧宇 李松林

摘 要 目的：探討葛根素（Pue）對缺氧誘導的肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）焦亡的影響及其調控機制。方法：以大鼠PASMCs為對象，將其隨機分為常氧組、缺氧組和缺氧+Pue組（0.2 mmol/L），除常氧組外，其余各組均于37 ℃、5%CO2、3%O2條件下培養(yǎng)24 h以建立缺氧模型。采用Western blot法檢測細胞中焦亡相關蛋白[NOD樣受體蛋白3（NLRP3）、胱天蛋白酶1、白細胞介素1β、凋亡相關斑點樣蛋白]的表達水平;采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放實驗檢測細胞中LDH的釋放量;采用Hoechst 33342/PI雙染色法檢測焦亡陽性細胞比例。另將PASMCs隨機分為常氧+對照質粒組、缺氧+對照質粒組、缺氧+過表達質粒組和缺氧+過表達質粒+Pue組，除常氧+對照質粒組外，其余各組均同法建立缺氧模型;在分別轉染對照質?；騈LRP3過表達質粒后，采用Western blot法、LDH釋放實驗和Hoechst 33342/PI雙染色法檢測Pue是否通過干擾NLRP3炎癥小體來發(fā)揮對缺氧致PASMCs焦亡的影響。結果：與常氧組比較，缺氧組細胞中焦亡相關蛋白的表達水平、LDH釋放量和焦亡陽性細胞比例均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;而Pue可逆轉上述指標（P<0.05或P<0.01）。當NLRP3炎癥小體過表達時，細胞中焦亡相關蛋白的表達水平、LDH釋放量和焦亡陽性細胞比例均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;且Pue可通過調控NLRP3炎癥小體而抑制上述現(xiàn)象（P<0.05或P<0.01）。結論：Pue可通過下調焦亡相關蛋白的表達、減少LDH的釋放、降低焦亡陽性細胞比例，從而發(fā)揮對缺氧致PASMCs焦亡的抑制作用，其機制可能與抑制NLRP3炎癥小體的活性有關。

關鍵詞 葛根素;肺動脈平滑肌細胞;焦亡;NOD樣受體蛋白3炎癥小體

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To investigate the effects and mechanism of puerarin （Pue） on hypoxia-induced pyroptosis of pulmonary artery smooth muscle cells （PASMCs）. METHODS： PASMCs of rats as research objects were randomly divided into normoxia group， hypoxia group and hypoxia+Pue group （0.2 mmol/L）. Except for normoxia group， other groups were cultured with 5% CO2 and 3% O2 at 37 ℃ for 24 hours to establish hypoxia model. Western blot assay was used to detect the expression of pyroptosis related proteins [NOD-like receptor protein-3 （NLPR3）， caspase-1， interleukin-1β （IL-1β）， apoptosis-associated speck-like protein （ASC）]. Lactate dehydrogenase （LDH） release assay was used to detect the release of LDH in cells; Hoechst 33342/PI double staining test was adopted to detect the proportion of pyroptosis positive cells. PASMCs was randomly divided into normoxia group+control plasmid group， hypoxia+control plasmid group， hypoxia+over-expression plasmid group and hypoxia+over-expression plasmid+Pue group. Except for the normoxia+control plasmid group， the other groups were established hypoxia model by the same method. After transfection of control plasmid or NLRP3 over-expression plasmid， Western blot， LDH release test and Hoechst 33342/PI double staining test were used to investigate whether Pue could inhibit hypoxia-induced PASMCs pyroptosis by interfering with the activity of NLRP3 inflammasomes. RESULTS： Compared with normoxia group， the expression of pyroptosis related proteins， the release of LDH and the proportion of pyroptosis positive cells were increased significantly in? hypoxia group （P<0.05 or P<0.01）. Pue had the effect of reversing the above indexes （P<0.05 or P<0.01）. When the NLRP3 inflammasome was over-expressed， the expression of pyroptosis related proteins， the release of LDH and the proportion of pyroptosis positive cells were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Pue could inhibit the above phenomenon through regulating NLRP3 inflammasome （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Pue can significantly inhibit the hypoxia-induced pyroptosis of PASMCs by down-regulating the expression of pyroptosis related proteins， reducing the release of LDH and proportion of pyroptosis positive cells. The mechanism is related to the activity inhibition of NLRP3 inflammasome.

KEYWORDS? ?Puerarin; Pulmonary artery smooth muscle cells; Pyroptosis; NLRP3 inflammasome

肺動脈高壓（PAH）是一種以肺血管壁增厚為主要特征的心肺疾病[1-2]。自從Tuder等[3]學者首次在PAH患者的肺血管周圍發(fā)現(xiàn)炎性細胞浸潤后，越來越多的學者證實了炎癥與PAH密切相關[4-6]。目前，炎癥已經(jīng)作為一項新的指標用來評價患者PAH的嚴重程度，因此抑制炎癥反應是緩解PAH癥狀、減少肺血管重構的有效途徑[7-8]。在細胞焦亡中發(fā)揮關鍵作用的NOD樣受體蛋白3（NLPR3）炎癥小體，是由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）和胱天蛋白酶1前體（pro-caspase-1）組成[9]。當NLRP3炎癥小體活化時，pro-caspase-1會生成具有活性的胱天蛋白酶1（caspase-1），釋放白細胞介素1β（IL-1β）和IL-18[10-11]。當PAH發(fā)生時，上述炎癥因子會促進肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）的遷移和增殖，使管腔變窄，從而加速PAH的進展[12]。此外，最新研究表明，缺氧誘導的PASMCs中有異常細胞焦亡的存在，但具體的機制尚未闡明[13]?？梢?，從抗炎角度出發(fā)關注PAH與細胞焦亡之間的關系十分重要。

葛根素（Pue）是從中藥野葛Pueraria lobata （Willd.） Ohwi的干燥根中提取出的活性成分，其自分離鑒定起就引起了中外學者的廣泛關注?，F(xiàn)代藥理研究表明，Pue可通過調節(jié)多種與炎癥疾病相關的炎性細胞、炎癥因子及其復雜的信號通路來發(fā)揮抗炎作用[14-15]。因此，筆者推測Pue可能通過焦亡相關信號通路來發(fā)揮保護PASMCs的作用，但該化合物對上述通路的調控作用以及具體機制尚未有文獻報道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，0.2 mmol/L的Pue作用24 h即可通過自噬抑制PASMCs的增殖[16]。而在PAH中，細胞焦亡釋放出的炎癥因子最終也會導致PASMCs增殖[13]?；诖耍疚囊訮ASMCs為研究對象，探討Pue（0.2 mmol/L）對缺氧誘導的PASMCs焦亡的影響，并擬驗證這種影響是否與NLRP3炎癥小體有關，以期為闡明Pue對PAH的影響提供新的思路。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括DYY6B型電泳及轉膜裝置、Gel Doc XR+型化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），IX71型熒光顯微鏡（日本Olympus公司），HF100型三氣培養(yǎng)箱（上海力申科學儀器有限公司），BB150 CO2型細胞培養(yǎng)箱、MK3型酶標儀（美國Thermo Fisher? ? Scientific公司），3K15型低溫高速離心機（德國Sigma公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

葛根素對照品（批號J1003A5，純度>98%）購自大連美侖生物技術有限公司，以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑配制成200 mmol/L的無菌溶液進行實驗，現(xiàn)用現(xiàn)配。

DMEM培養(yǎng)液（批號AF29498408）購自美國HyClone公司;胎牛血清（批號FB25015）購自美國Clark Bioscience公司;胰酶消化液、青-鏈霉素雙抗、RIPA細胞裂解液、Hoechst 33342/PI雙染檢測試劑盒（批號C0201、C0222、P0013B、C1056）均購自上海碧云天生物技術有限公司;兔抗大鼠ASC多克隆抗體、兔抗大鼠caspase-1多克隆抗體（批號分別為PA5-85810、PA5-87536）均購自美國CST公司;兔抗大鼠NLRP3單克隆抗體、小鼠抗大鼠β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號分別為ab263899、ab8226）均購自英國Abcam公司;兔抗大鼠IL-1β多克隆抗體（批號bs-20448R）購自北京博奧森生物技術有限公司;辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、HRP標記的山羊抗大鼠IgG二抗（批號分別為E030120、E030110）均購自美國EarthOx LLC公司;對照質粒、NLRP3過表達質粒（批號均為00043118）均購自上海吉凱基因科技有限公司;乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒、ECL超敏化學發(fā)光液（批號分別為MAK066、WBULS0100）均購自美國Sigma-Aldrich公司;X-treme轉染載體（批號65453）購自瑞士Roche公司;BCA蛋白定量試劑盒（批號23227）購自美國Thermo Fisher Scientific公司;脫脂奶粉、DMSO（批號分別為1172、1084）購自德國Biofroxx公司;其余試劑為分析純或實驗室常用規(guī)格，水為去離子水。

1.3 實驗動物

實驗用動物為SPF級成年雄性SD大鼠，8周齡，體質量（230±20） g，由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（吉）2018-0007。所有動物均在溫度（22±2） ℃、相對濕度（50±10）%的條件下飼養(yǎng)。本研究方案取得哈爾濱醫(yī)科大學動物實驗倫理委員會批準。

2 方法

2.1 PASMCs的分離與體外培養(yǎng)

取大鼠3只，經(jīng)常規(guī)麻醉后，轉至無菌操作臺上。打開其胸腔，取出完整的肺，分離遠端血管動脈并除去外膜后剪成小塊，用胰酶消化后以3 000 r/min離心5 min。收集細胞沉淀，加入含有20%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液，混勻后培養(yǎng)，傳至第2代后用于后續(xù)研究。

2.2 Pue對缺氧PASMCs中焦亡相關蛋白表達的影響考察

采用Western blot法進行檢測。取對數(shù)生長期PASMCs，按3×108 mL-1的密度接種于培養(yǎng)瓶內，每瓶3 mL。實驗設常氧組、缺氧組和缺氧+Pue組（Pue終濃度為0.2 mmol/L，參考文獻[15]并結合前期預實驗結果設置），每組設復孔6個。常氧組和缺氧組細胞加入等體積DMSO（體積分數(shù)為0.1%），缺氧+Pue組細胞按1 μL/mL加入相應藥液（Pue終濃度為0.2 mmol/L）。隨后，常氧組細胞于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，其余各組細胞均于37 ℃、5%CO2、3%O2條件下培養(yǎng)24 h以建立缺氧模型。取出細胞，用pH 7.3的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后勻漿，加入細胞裂解液適量，于冰上裂解;刮取細胞，收集裂解后的細胞液，于4 ℃下以13 500 r/min離心20 min;取上清液，采用BCA法測定蛋白含量后，于100 ℃下加熱變性5 min。取變性后蛋白樣品適量，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離（濃縮膠電泳80 V，分離膠電泳120 V），隨后以濕轉法將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，再以10%脫脂奶粉室溫封閉1 h;然后分別加入NLRP3、caspase-1、IL-1β、ASC、β-actin一抗（稀釋比例分別為1 ∶ 1 000、1 ∶ 1 000、1 ∶ 1 000、1 ∶ 500、1 ∶ 2 000），4 ℃孵育過夜;次日用TBST溶液洗膜，加入相應二抗（NLRP3、caspase-1、IL-1β、ASC一抗加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，稀釋比例分別為1 ∶ 4 000、1 ∶ 6 000、1 ∶ 8 000、? ?1 ∶ 8 000;β-actin一抗加入HRP標記的山羊抗大鼠二抗，稀釋比例為1 ∶ 4 000），室溫孵育1 h;用TBST溶液洗膜，以ECL發(fā)光顯影后，置于化學發(fā)光成像系統(tǒng)中成像。使用Quantity One 6.0軟件分析，以目標蛋白與內參條帶的灰度值的比值作為目標蛋白的表達水平。實驗重復4次。

2.3 Pue對缺氧PASMCs中LDH釋放的影響考察

采用LDH釋放實驗進行檢測。取對數(shù)生長期PASMCs，按1×104 mL-1的密度接種于96孔板中，每孔150 μL，按“2.2”項下方法分組、造模、給藥，每組設置復孔6個。細胞培養(yǎng)24 h后，按相應試劑盒說明書方法操作，使用酶標儀于490 nm波長處檢測各孔吸光度并計算細胞中LDH的釋放量：LDH釋放量（%）=（樣品吸光度-對照孔吸光度）/（細胞最大酶活性的吸光度-對照孔吸光度）×100%。實驗重復4次。

2.4 Pue對缺氧PASMCs中焦亡陽性細胞比例的影響考察

采用Hoechst 33342/PI雙染法進行檢測。取對數(shù)生長期PASMCs，按2×104 mL-1的密度接種于24孔板中，每孔300 μL，按“2.2”項下方法分組、造模、給藥，每組設置復孔6個。細胞培養(yǎng)24 h后，按相應試劑盒說明書進行染色處理后在熒光顯微鏡下觀察，用Image J 6.0軟件處理分析并計算焦亡陽性細胞比例：焦亡陽性細胞比例=焦亡陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%（Hoechst 33342染料可將活細胞的細胞核染成藍色，而PI染料只能將細胞膜破裂的焦亡細胞的細胞核染成紅色）。實驗重復4次。

2.5 NLRP3過表達質粒構建合格性考察

采用Western blot法進行檢測。取對數(shù)生長期PASMCs，按3×108 mL-1的密度接種至培養(yǎng)瓶內，每瓶3 mL。試驗設常氧+對照質粒組和常氧+過表達質粒組，每組設置復孔6個。細胞培養(yǎng)至融合度達70%時，以X-treme為轉染載體對常氧+過表達質粒組細胞進行轉染：首先，棄去瓶內培養(yǎng)液，將DMEM培養(yǎng)液（100 μL）分別與X-treme（7.5 μL）、對照質粒（3 mg）、NLRP3過表達質粒（3 mg）混合5 min;然后，再將含X-treme的DMEM培養(yǎng)液分別與含對照質粒和NLRP3過表達質粒的DMEM培養(yǎng)液混合15 min;最后，加至含有DMEM培養(yǎng)液2.8 mL的培養(yǎng)瓶內轉染6 h，轉染結束后，棄去培養(yǎng)液，加入“2.1”項下含血清、青-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液適量。細胞培養(yǎng)24 h后取出，按“2.2”項下Western blot實驗操作檢測細胞中NLRP3蛋白的表達水平，并以P<0.05（常氧+過表達質粒組與常氧+對照質粒組相比）表示此過表達質粒構建合格。實驗重復4次。

2.6 NLRP3炎癥小體過表達時Pue對缺氧PASMCs中焦亡相關蛋白表達的影響考察

采用Western blot法進行檢測。取對數(shù)生長期PASMCs，設常氧+對照質粒組、缺氧+對照質粒組、缺氧+過表達質粒組、缺氧+過表達質粒+Pue組，每組設置復孔6個。細胞按“2.2”項下方法接種、造模、給藥，按“2.5”項下方法轉染并培養(yǎng)24 h后，再按“2.2”項下Wes- tern blot實驗操作檢測細胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β、ASC蛋白的表達水平。實驗重復4次。

2.7 NLRP3炎癥小體過表達時Pue對缺氧PASMCs中LDH釋放的影響考察

采用LDH釋放實驗進行檢測。取對數(shù)生長期PASMCs，按“2.3”項下方法接種，按“2.6”項下方法分組，再按“2.2”項下方法造模、給藥，每組設置復孔6個。細胞按“2.5”項下方法轉染并培養(yǎng)24 h后，再按“2.3”項下方法檢測和計算細胞中LDH釋放量。實驗重復4次。

2.8 NLRP3炎癥小體過表達時Pue對PASMCs中焦亡陽性細胞比例的影響考察

采用Hoechst 33342/PI雙染法進行檢測。取對數(shù)生長期PASMCs，按“2.4”項下方法接種，按“2.6”項下方法分組，再按“2.2”項下方法造模、給藥，每組設置復孔6個。細胞按“2.5”項下方法轉染并培養(yǎng)24 h后，再按“2.4”項下方法檢測焦亡陽性細胞比例。實驗重復4次。

2.9 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 6.01軟件進行統(tǒng)計分析。結果數(shù)據(jù)均以x±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 Pue對缺氧PASMCs中焦亡相關蛋白表達水平的影響

與常氧組比較，缺氧組細胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β、ASC蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與缺氧組比較，缺氧+Pue組細胞中上述蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖1、表1。

3.2 Pue對缺氧PASMCs中LDH釋放量的影響

與常氧組比較，缺氧組細胞中LDH的釋放量顯著升高（P<0.01）;與缺氧組比較，缺氧+Pue組細胞中LDH的釋放量顯著降低（P<0.01），詳見表2。

3.3 Pue對缺氧PASMCs中焦亡陽性細胞比例的影響

與常氧組比較，缺氧組細胞紅色熒光增強，其焦亡陽性細胞比例顯著升高（P<0.01）;與缺氧組比較，缺氧+Pue組細胞紅色熒光減弱，其焦亡陽性細胞比例顯著降低（P<0.01），詳見圖2、表2（圖2中，Hosechst 33342表示視野內所有能被染色的活細胞圖，PI表示發(fā)生焦亡的細胞圖，Merge為兩者合并圖，下同）。

3.4 NLRP3過表達質粒構建的合格性

常氧+過表達質粒組細胞中NLRP3蛋白的表達水平顯著高于常氧+對照質粒組[（1.79±0.45） vs. （1.21±0.14），P<0.05]，提示此NLRP3過表達質粒構建成功，可用作后續(xù)研究，詳見圖3。

3.5 NLRP3過表達時Pue對缺氧PASMCs中NLRP3、caspase-1、IL-1β、ASC表達水平的影響

與常氧+對照質粒組比較，缺氧+對照質粒組細胞中NLPR3、caspase-1、IL-1β、ASC蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與缺氧+對照質粒組比較，缺氧+過表達質粒組細胞中上述4種蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與缺氧+過表達質粒組比較，缺氧+過表達質粒+Pue組細胞中上述4種蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖4、表3。

3.6 NLRP3過表達時Pue對缺氧PASMCs中LDH釋放量的影響

與常氧+對照質粒組比較，缺氧+對照質粒組細胞中LDH的釋放量顯著升高（P<0.01）;與缺氧+對照質粒組比較，缺氧+過表達質粒組細胞中LDH的釋放量顯著升高（P<0.05）;與缺氧+過表達質粒組比較，缺氧+過表達質粒+Pue組細胞中LDH的釋放量顯著降低（P<0.05），詳見表4。

3.7 NLRP3過表達時Pue對缺氧PASMCs中焦亡陽性細胞比例的影響

與常氧+對照質粒組比較，缺氧+對照質粒組細胞中多見紅色熒光，其焦亡陽性細胞比例顯著升高（P<0.01）;與缺氧+對照質粒組比較，缺氧+過表達質粒組細胞中紅色熒光有所增強，其焦亡陽性細胞比例顯著升高（P<0.05）;與缺氧+過表達質粒組比較，缺氧+過表達質粒+Pue組細胞中的紅色熒光有所減少，其焦亡陽性細胞比例顯著降低（P<0.01），詳見圖5、表4。

4 討論

在PAH中，炎癥反應是其關鍵的致病因素：在正常情況下，免疫炎癥的發(fā)生有利于病原體的清除;但在PAH中，炎性細胞釋放出的炎癥因子會促進PASMCs的增殖和肺血管的異常收縮，進而加速肺血管的重構[17]。無論是在體外培養(yǎng)的PASMCs還是在缺氧或野百合堿誘導的PAH模型中，均有研究證實腫瘤壞死因子α（TNF-α）、核因子κB（NF-κB）、IL-6、IL-1β、IL-18等炎癥因子的存在[18-20];同時，本課題組早期研究中也發(fā)現(xiàn)，PAH模型大鼠體內細胞間黏附分子1（ICAM-1）和血管細胞黏附分子1表達增加，炎癥反應和PAH進程加劇[21]?？梢?，炎癥因子在PAH中的作用不容忽視。

隨著細胞焦亡相關研究的開展，已有學者開始關注這種促炎形式的細胞程序性死亡與PAH之間的關系[22-23]。當細胞發(fā)生焦亡時，細胞膜會先形成直徑10～20 nm的孔道，迫使鉀離子外流，使得細胞因吸水過多而發(fā)生物理破裂，最終導致胞內LDH和炎癥因子的滲出;同時，當細胞膜的完整性被破壞時，Hoechest33342/PI等熒光染料就可以嵌入這些細胞的雙鏈DNA中，使焦亡陽性被染色[24-25]。正常生理狀態(tài)下，焦亡可使機體免受異常損傷和炎癥刺激;而其異?；钴S則會導致病理性炎癥的發(fā)生[26]。Zhang等[16]的研究表明，由缺氧激活的程序性死亡配體1可觸發(fā)PASMCs焦亡和肺血管纖維化，同時caspase-1抑制劑可逆轉上述現(xiàn)象。本研究也發(fā)現(xiàn)，與常氧組比較，缺氧組細胞中的焦亡相關蛋白NLRP3、caspase-1、IL-1β、ASC的表達水平均顯著升高，同時其LDH的釋放量以及焦亡陽性細胞比例亦顯著升高。上述結果均提示缺氧誘導PASMCs焦亡是符合已有理論的。

Pue是從中藥野葛的干燥根中提取出的化合物，現(xiàn)已被廣泛應用于多種炎性疾病的治療。張程美等[27]的研究表明，低、高劑量（10、100 μg/mL）的Pue均能下調THP-1巨噬細胞中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA表達水平;除此之外，Pue不僅可以影響炎癥因子的表達，而且還可通過降低基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9等炎癥介質，ICAM-1等細胞黏附分子，單核細胞趨化蛋白1、轉化生長因子β等炎癥趨化因子的水平，從而發(fā)揮抗炎作用[28]。因此，在綜合細胞焦亡機制的基礎上，筆者推測Pue可能具有減少炎癥因子釋放、緩解PAH的作用。同時，為減少因藥物純度不足或儲存不當所造成的實驗誤差，本研究在高度隨機和前期多次檢測的基礎上選用了Pue對照品并現(xiàn)用現(xiàn)配。本研究結果顯示，對于缺氧24 h的PASMCs，0.2 mmol/L的Pue即可下調由缺氧引起的焦亡相關蛋白表達的升高，可減少LDH的釋放并降低焦亡陽性細胞比例，提示Pue在體外具有保護細胞膜完整性、減少炎癥因子釋放和下調焦亡陽性細胞比例的作用。

NLRP3炎性小體是巨噬細胞介導的免疫應答和炎癥反應中的關鍵調節(jié)因子，在長期低氧環(huán)境的刺激下會觸發(fā)缺氧誘導分子1α（HIF-1α）的分泌，大量HIF-1α的累積使得肺動脈細胞的有氧代謝平衡失調，繼而升高的NF-κB又進一步上調NLRP3的表達，后者又可通過增加caspase-1的分泌而加重炎癥反應[29-31]。以上研究提示，NLRP3炎癥小體可能是治療PAH的潛在靶點之一。雖有文獻曾報道過Pue與PAH之間的關系，但未有研究從細胞焦亡角度入手探討Pue與NLRP3炎癥小體的關系以及二者在PAH中的作用。因此，筆者構建了NLRP3過表達質粒，在NLRP3炎癥小體異?；罨臈l件下初步探討了Pue對PASMCs焦亡的影響。結果顯示，NLRP3過表達質粒組中NLRP3、caspase-1、IL-1β、ASC的表達水平均較缺氧+對照質粒組顯著上調。這一方面表明NLRP3過表達質粒構建成功，另一方面也提示NLRP3的異?；罨杉觿⊙装Y因子的釋放。加入0.2 mmol/L Pue進行干預后，焦亡相關蛋白的表達水平均顯著下調，LDH的釋放量和焦亡陽性細胞比例均顯著降低，提示Pue可通過調控NLRP3炎癥小體抑制PASMCs的焦亡。

綜上所述，本研究證實了缺氧可誘導PASMCs焦亡并且激活NLRP3炎癥小體，而Pue可通過下調NLRP3、caspase-1、IL-1β、ASC蛋白的表達、減少LDH的釋放、降低焦亡陽性細胞比例，從而發(fā)揮對缺氧致PASMCs焦亡的抑制作用，其機制可能與其抑制NLRP3炎癥小體的活性有關，提示Pue在PAH疾病預防及治療中存在潛在的應用價值。為了更加全面地掌握焦亡與PAH之間的聯(lián)系以及Pue的調控機制，后期研究可從量-效、時-效關系入手深入探討，為臨床治療PAH奠定研究基礎。

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（收稿日期：2021-01-18 修回日期：2021-04-20）

（編輯：張元媛）