王鳴華等

摘要：為建立一種測(cè)定抗體與小分子化合物吸附性能的色譜分析方法，本研究設(shè)計(jì)合成了5種對(duì)硫磷半抗原和2種異丙威半抗原，將半抗原P1和A1與同一載體蛋白偶聯(lián)制備“多簇”免疫抗原，免疫動(dòng)物獲得相應(yīng)的多克隆抗體；采用高效液相色譜結(jié)合固相吸附的方法，測(cè)定了抗體與對(duì)硫磷、異丙威及其競(jìng)爭(zhēng)原的吸附性能，并通過吸附動(dòng)力學(xué)模型擬合抗體與化合物的吸附行為，獲得相應(yīng)的吸附常數(shù)。結(jié)果表明抗體與小分子化合物的吸附動(dòng)力學(xué)符合Freundilich模型，抗體與不同化合物的吸附常數(shù)為：對(duì)硫磷>P1>P4>P3>P2>P5，大小順序與ELISA親和常數(shù)的測(cè)定結(jié)果相符，與ELISA靈敏度測(cè)定結(jié)果有很好的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：液相色譜； 對(duì)硫磷； 異丙威； 競(jìng)爭(zhēng)原； 抗體； 吸附常數(shù)

1引言

基于抗原抗體分子識(shí)別的免疫分析技術(shù)，特別是酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzymelinked Immunosorbent Assay， ELISA）以特異、靈敏、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[1]。半抗原、人工抗原、抗體及標(biāo)記物是小分子免疫分析中的4個(gè)基本要素，抗體是核心試劑，而抗體的親和力（Affinity）是確定抗體性質(zhì)的重要參數(shù)之一，是指抗體與抗原結(jié)合的緊密程度，多以親和常數(shù)（Affinity constant）表示[2]。通常采用Beatty等[3]建立的非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定抗體的親和常數(shù)，該法不受抗原分子量大小的限制，操作簡(jiǎn)便易行，結(jié)果可靠。但該方法只能測(cè)定抗體與包被抗原的親和力，而不能測(cè)定抗體與待測(cè)小分子化合物的親和力。

在競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析方法中，往往異源分析的靈敏度明顯高于同源分析[4]，即當(dāng)抗體與待測(cè)化合物的親和力不變時(shí)，抗體與包被抗原的親和力越弱，待測(cè)化合物的競(jìng)爭(zhēng)能力越強(qiáng)，方法靈敏度就越高。因此，抗體與包被抗原的親和力強(qiáng)弱不能指導(dǎo)方法建立中包被抗原的篩選，只能合成多種包被抗原后，通過免疫分析結(jié)果的評(píng)價(jià)篩選最佳的包被抗原[5]或利用分子模擬技術(shù)對(duì)抗體和半抗原進(jìn)行模擬分析[6]，選擇合適的異源半抗原（競(jìng)爭(zhēng)原）。而這些方法存在一定的盲目性或需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員。因而，建立一種簡(jiǎn)便、可靠的能直接比較抗體與競(jìng)爭(zhēng)原和待測(cè)物親和力強(qiáng)弱的方法，可減少免疫分析中競(jìng)爭(zhēng)原篩選的盲目性和工作量。

在ELISA測(cè)定中，抗體與競(jìng)爭(zhēng)原的吸附屬于固液吸附，而固體液體界面的吸附過程可用Langmiur或Freundilich吸附動(dòng)力學(xué)模型描述，獲得的吸附常數(shù)可用于表示主體和客體間的親和力大小[7]。有關(guān)利用吸附常數(shù)描述抗體與競(jìng)爭(zhēng)原或待測(cè)物親和力大小的文章尚未見報(bào)道。本研究以抗對(duì)硫磷和異丙威抗體為例，采用高效液相色譜結(jié)合固相吸附的方法，測(cè)定“寬譜”抗體對(duì)對(duì)硫磷、異丙威及其半抗原的吸附能力，通過吸附常數(shù)的比較，判斷抗體的特性及競(jìng)爭(zhēng)原的優(yōu)劣，并與ELISA分析結(jié)果相比較，驗(yàn)證了方法的可行性。2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；iMARKTM酶標(biāo)儀（美國(guó)BioRad公司）；DU 800核酸蛋白儀（美國(guó)Beckman公司）；Wellwash Plus洗板機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；96孔聚乙烯酶標(biāo)板（加拿大Jet Biochemical公司）；移液槍（美國(guó)Eppendorf 公司）。

對(duì)硫磷，異丙威標(biāo)準(zhǔn)品（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心）；牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、二抗（羊抗兔）（SIGMA公司）；碳酸鹽緩沖液（CBS，0.05 mol/L，pH 9.6），磷酸鹽緩沖液（PBS，0.1 mol/L，pH 7.4）；PBST等緩沖液（實(shí)驗(yàn)室配制）；甲醇（色譜純，美國(guó)天地公司）；其它試劑均為分析純。

2.2半抗原合成

摘要：為建立一種測(cè)定抗體與小分子化合物吸附性能的色譜分析方法，本研究設(shè)計(jì)合成了5種對(duì)硫磷半抗原和2種異丙威半抗原，將半抗原P1和A1與同一載體蛋白偶聯(lián)制備“多簇”免疫抗原，免疫動(dòng)物獲得相應(yīng)的多克隆抗體；采用高效液相色譜結(jié)合固相吸附的方法，測(cè)定了抗體與對(duì)硫磷、異丙威及其競(jìng)爭(zhēng)原的吸附性能，并通過吸附動(dòng)力學(xué)模型擬合抗體與化合物的吸附行為，獲得相應(yīng)的吸附常數(shù)。結(jié)果表明抗體與小分子化合物的吸附動(dòng)力學(xué)符合Freundilich模型，抗體與不同化合物的吸附常數(shù)為：對(duì)硫磷>P1>P4>P3>P2>P5，大小順序與ELISA親和常數(shù)的測(cè)定結(jié)果相符，與ELISA靈敏度測(cè)定結(jié)果有很好的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：液相色譜； 對(duì)硫磷； 異丙威； 競(jìng)爭(zhēng)原； 抗體； 吸附常數(shù)

1引言

基于抗原抗體分子識(shí)別的免疫分析技術(shù)，特別是酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzymelinked Immunosorbent Assay， ELISA）以特異、靈敏、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[1]。半抗原、人工抗原、抗體及標(biāo)記物是小分子免疫分析中的4個(gè)基本要素，抗體是核心試劑，而抗體的親和力（Affinity）是確定抗體性質(zhì)的重要參數(shù)之一，是指抗體與抗原結(jié)合的緊密程度，多以親和常數(shù)（Affinity constant）表示[2]。通常采用Beatty等[3]建立的非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定抗體的親和常數(shù)，該法不受抗原分子量大小的限制，操作簡(jiǎn)便易行，結(jié)果可靠。但該方法只能測(cè)定抗體與包被抗原的親和力，而不能測(cè)定抗體與待測(cè)小分子化合物的親和力。

在競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析方法中，往往異源分析的靈敏度明顯高于同源分析[4]，即當(dāng)抗體與待測(cè)化合物的親和力不變時(shí)，抗體與包被抗原的親和力越弱，待測(cè)化合物的競(jìng)爭(zhēng)能力越強(qiáng)，方法靈敏度就越高。因此，抗體與包被抗原的親和力強(qiáng)弱不能指導(dǎo)方法建立中包被抗原的篩選，只能合成多種包被抗原后，通過免疫分析結(jié)果的評(píng)價(jià)篩選最佳的包被抗原[5]或利用分子模擬技術(shù)對(duì)抗體和半抗原進(jìn)行模擬分析[6]，選擇合適的異源半抗原（競(jìng)爭(zhēng)原）。而這些方法存在一定的盲目性或需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員。因而，建立一種簡(jiǎn)便、可靠的能直接比較抗體與競(jìng)爭(zhēng)原和待測(cè)物親和力強(qiáng)弱的方法，可減少免疫分析中競(jìng)爭(zhēng)原篩選的盲目性和工作量。

在ELISA測(cè)定中，抗體與競(jìng)爭(zhēng)原的吸附屬于固液吸附，而固體液體界面的吸附過程可用Langmiur或Freundilich吸附動(dòng)力學(xué)模型描述，獲得的吸附常數(shù)可用于表示主體和客體間的親和力大小[7]。有關(guān)利用吸附常數(shù)描述抗體與競(jìng)爭(zhēng)原或待測(cè)物親和力大小的文章尚未見報(bào)道。本研究以抗對(duì)硫磷和異丙威抗體為例，采用高效液相色譜結(jié)合固相吸附的方法，測(cè)定“寬譜”抗體對(duì)對(duì)硫磷、異丙威及其半抗原的吸附能力，通過吸附常數(shù)的比較，判斷抗體的特性及競(jìng)爭(zhēng)原的優(yōu)劣，并與ELISA分析結(jié)果相比較，驗(yàn)證了方法的可行性。2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；iMARKTM酶標(biāo)儀（美國(guó)BioRad公司）；DU 800核酸蛋白儀（美國(guó)Beckman公司）；Wellwash Plus洗板機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；96孔聚乙烯酶標(biāo)板（加拿大Jet Biochemical公司）；移液槍（美國(guó)Eppendorf 公司）。

對(duì)硫磷，異丙威標(biāo)準(zhǔn)品（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心）；牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、二抗（羊抗兔）（SIGMA公司）；碳酸鹽緩沖液（CBS，0.05 mol/L，pH 9.6），磷酸鹽緩沖液（PBS，0.1 mol/L，pH 7.4）；PBST等緩沖液（實(shí)驗(yàn)室配制）；甲醇（色譜純，美國(guó)天地公司）；其它試劑均為分析純。

2.2半抗原合成

摘要：為建立一種測(cè)定抗體與小分子化合物吸附性能的色譜分析方法，本研究設(shè)計(jì)合成了5種對(duì)硫磷半抗原和2種異丙威半抗原，將半抗原P1和A1與同一載體蛋白偶聯(lián)制備“多簇”免疫抗原，免疫動(dòng)物獲得相應(yīng)的多克隆抗體；采用高效液相色譜結(jié)合固相吸附的方法，測(cè)定了抗體與對(duì)硫磷、異丙威及其競(jìng)爭(zhēng)原的吸附性能，并通過吸附動(dòng)力學(xué)模型擬合抗體與化合物的吸附行為，獲得相應(yīng)的吸附常數(shù)。結(jié)果表明抗體與小分子化合物的吸附動(dòng)力學(xué)符合Freundilich模型，抗體與不同化合物的吸附常數(shù)為：對(duì)硫磷>P1>P4>P3>P2>P5，大小順序與ELISA親和常數(shù)的測(cè)定結(jié)果相符，與ELISA靈敏度測(cè)定結(jié)果有很好的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：液相色譜； 對(duì)硫磷； 異丙威； 競(jìng)爭(zhēng)原； 抗體； 吸附常數(shù)

1引言

基于抗原抗體分子識(shí)別的免疫分析技術(shù)，特別是酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzymelinked Immunosorbent Assay， ELISA）以特異、靈敏、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[1]。半抗原、人工抗原、抗體及標(biāo)記物是小分子免疫分析中的4個(gè)基本要素，抗體是核心試劑，而抗體的親和力（Affinity）是確定抗體性質(zhì)的重要參數(shù)之一，是指抗體與抗原結(jié)合的緊密程度，多以親和常數(shù)（Affinity constant）表示[2]。通常采用Beatty等[3]建立的非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定抗體的親和常數(shù)，該法不受抗原分子量大小的限制，操作簡(jiǎn)便易行，結(jié)果可靠。但該方法只能測(cè)定抗體與包被抗原的親和力，而不能測(cè)定抗體與待測(cè)小分子化合物的親和力。

在競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析方法中，往往異源分析的靈敏度明顯高于同源分析[4]，即當(dāng)抗體與待測(cè)化合物的親和力不變時(shí)，抗體與包被抗原的親和力越弱，待測(cè)化合物的競(jìng)爭(zhēng)能力越強(qiáng)，方法靈敏度就越高。因此，抗體與包被抗原的親和力強(qiáng)弱不能指導(dǎo)方法建立中包被抗原的篩選，只能合成多種包被抗原后，通過免疫分析結(jié)果的評(píng)價(jià)篩選最佳的包被抗原[5]或利用分子模擬技術(shù)對(duì)抗體和半抗原進(jìn)行模擬分析[6]，選擇合適的異源半抗原（競(jìng)爭(zhēng)原）。而這些方法存在一定的盲目性或需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員。因而，建立一種簡(jiǎn)便、可靠的能直接比較抗體與競(jìng)爭(zhēng)原和待測(cè)物親和力強(qiáng)弱的方法，可減少免疫分析中競(jìng)爭(zhēng)原篩選的盲目性和工作量。

在ELISA測(cè)定中，抗體與競(jìng)爭(zhēng)原的吸附屬于固液吸附，而固體液體界面的吸附過程可用Langmiur或Freundilich吸附動(dòng)力學(xué)模型描述，獲得的吸附常數(shù)可用于表示主體和客體間的親和力大小[7]。有關(guān)利用吸附常數(shù)描述抗體與競(jìng)爭(zhēng)原或待測(cè)物親和力大小的文章尚未見報(bào)道。本研究以抗對(duì)硫磷和異丙威抗體為例，采用高效液相色譜結(jié)合固相吸附的方法，測(cè)定“寬譜”抗體對(duì)對(duì)硫磷、異丙威及其半抗原的吸附能力，通過吸附常數(shù)的比較，判斷抗體的特性及競(jìng)爭(zhēng)原的優(yōu)劣，并與ELISA分析結(jié)果相比較，驗(yàn)證了方法的可行性。2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；iMARKTM酶標(biāo)儀（美國(guó)BioRad公司）；DU 800核酸蛋白儀（美國(guó)Beckman公司）；Wellwash Plus洗板機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；96孔聚乙烯酶標(biāo)板（加拿大Jet Biochemical公司）；移液槍（美國(guó)Eppendorf 公司）。

對(duì)硫磷，異丙威標(biāo)準(zhǔn)品（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心）；牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、二抗（羊抗兔）（SIGMA公司）；碳酸鹽緩沖液（CBS，0.05 mol/L，pH 9.6），磷酸鹽緩沖液（PBS，0.1 mol/L，pH 7.4）；PBST等緩沖液（實(shí)驗(yàn)室配制）；甲醇（色譜純，美國(guó)天地公司）；其它試劑均為分析純。

2.2半抗原合成