杜成興 張華麗 戴冬青 吳明月 梁敏敏 陳俊宇 馬良勇

水稻粒重粒形QTL的定位及的驗證

杜成興#張華麗#戴冬青 吳明月 梁敏敏 陳俊宇*馬良勇*

(中國水稻研究所 水稻生物學(xué)國家重點實驗室/國家水稻改良中心，杭州 310006；#共同第一作者；*通信聯(lián)系人，E-mail: chenjunyu@caas.cn，maliangyong@caas.cn)

【目的】粒重粒形對水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)均有重要的影響。本研究通過開展水稻粒重粒形QTL的初步定位，并對新鑒定的第1染色體長臂區(qū)間進(jìn)行驗證，旨在進(jìn)一步揭示水稻粒重粒形的遺傳調(diào)控機(jī)制。【方法】以大粒的FM9為父本，小粒的EFT為母本，配組衍生遺傳群體，先后獲得包含277個株系的F2:3群體和211個株系的重組自交系群體（Recombinant Inbred Lines, RILs），測定千粒重、粒長和粒寬，采用完備區(qū)間作圖法進(jìn)行QTL初定位；針對新鑒定的區(qū)間，篩選2個剩余雜合體單株，自交衍生分離群體，開展QTL效應(yīng)驗證。【結(jié)果】初定位分析共檢測到35個調(diào)控千粒重、粒長和粒寬的QTL，其中，11個能同時在兩個群體中被檢測到，18個僅在F2:3群體中被檢測到，6個僅在RIL群體中被檢測到；應(yīng)用兩個剩余雜合體衍生的兩套分離群體驗證了新鑒定的區(qū)間對千粒重和粒長的效應(yīng)，并觀察到穎殼細(xì)胞長度的顯著變化。通過qPCR分析，觀察到與細(xì)胞周期、生長素代謝和粒形相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生了顯著變化?！窘Y(jié)論】初步定位的35個QTL以及驗證的有利于進(jìn)一步揭示水稻粒重粒形的遺傳控制基礎(chǔ)，也為后續(xù)的基因克隆及分子標(biāo)記輔助選擇奠定了基礎(chǔ)。

水稻；粒重；粒形；QTL；剩余雜合體

水稻是世界三大糧食作物之一，是亞洲最重要的主食作物[1]。水稻產(chǎn)量相關(guān)性狀的遺傳研究是當(dāng)前作物科學(xué)研究的熱門領(lǐng)域。水稻粒重作為稻谷產(chǎn)量三要素之一，主要由粒長和粒寬等粒形性狀決定，同時粒形也是影響稻米外觀和加工品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一，是商品稻米的重要指標(biāo)[2-3]。

粒重與粒形均屬于典型的多基因控制的數(shù)量性狀，相互之間高度相關(guān)[4-5]。過去20多年間，數(shù)量性狀基因座（Quantitative Trait Locus, QTL）的研究一直受到重視，目前為止，已鑒定出500多個粒重和粒形的相關(guān)QTL（http://www.gramene.org/），廣泛分布于水稻所有12條染色體上，并已有20多個QTL被克隆[6]。這些研究提升了我們對粒重與粒形遺傳組成的理解，尤其通過基因克隆進(jìn)一步揭示了粒重粒形的分子調(diào)控機(jī)制，這些克隆的基因主要涉及植物激素、泛素-蛋白酶體通路、MAPK信號通路、G-蛋白信號通路以及一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等途徑[7-8]。因此，挖掘新的水稻粒重粒形QTL，將進(jìn)一步完善粒重粒形的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)水稻產(chǎn)量與品質(zhì)的遺傳改良。

水稻粒重粒形主要由少數(shù)主效與多數(shù)微效基因共同調(diào)控，在QTL初定位分析中，主效位點由于對群體的表型變異貢獻(xiàn)大，其分離往往會對其他微效位點的檢測功效及遺傳效應(yīng)估計產(chǎn)生較大的影響[9-11]。構(gòu)建次級定位群體，排除主效位點的干擾，是新位點驗證、精細(xì)定位乃至克隆的有效途徑[12-13]。次級群體的構(gòu)建，除了通過連續(xù)回交（6～7代）使遺傳背景與輪回親本基本一致外，也可通過篩選剩余雜合體自交衍生；后者相對前者，僅需1次分子標(biāo)記檢測，篩選出目標(biāo)單株即可，無需重新構(gòu)建群體，省時省力，已有較普遍的應(yīng)用，比如在排除主效粒重粒型QTL和影響的基礎(chǔ)上，完成了多個微效粒重粒形QTL的鑒定[14-16]。

圖1 群體構(gòu)建過程

Fig.1.Development of the rice materials used in the study.

本研究篩選粒重和粒形具有顯著差異的兩個水稻材料進(jìn)行雜交配組，構(gòu)建了F2:3群體和重組自交系群體，用于粒重和粒形的QTL初定位分析。并且，針對在兩套初定位群體中均呈顯著作用的區(qū)間，從重組自交系群體中篩選出2個不同遺傳背景的剩余雜合體單株，自交衍生了2套分離群體，開展該區(qū)間對粒重粒形的效應(yīng)驗證，并初步分析了該QTL區(qū)間對穎殼細(xì)胞分裂生長的影響，以及部分細(xì)胞周期相關(guān)基因和3個主效粒形基因的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 群體材料

以中優(yōu)早81為輪回親本的谷梅2號導(dǎo)入系FM9為父本（大粒），春江06和TN1雜交衍生的后代株系EFT為母本（小粒），通過雜交衍生構(gòu)建了具有277個株系的F2:3群體和211個株系的F7代 RIL群體，用于粒重粒形QTL的初定位分析。針對在兩套初定位群體中對千粒重和粒長都呈顯著作用的第1染色體長臂上的區(qū)間（RM315?RM12138），從RIL群體中挑選到2個剩余雜合體單株RHL17和RHL124，衍生分離群體，用于QTL效應(yīng)的驗證。這兩個單株遺傳背景不同，在與RM315?RM12138區(qū)間交疊的FIR3596?FIR3892區(qū)間（2.96 Mb）表現(xiàn)為雜合，在其他背景區(qū)間上高度純合。通過自交，獲得2套F8分離群體，命名為D1和D2，分別包含48和45個單株；進(jìn)一步從每個群體中挑選區(qū)間呈父本純合型（即FM9純合型）和母本純合型（即EFT純合型）的單株，自交后獲得2套相應(yīng)的F8:9家系群體，命名為E1和E2；E1包含EFT純合型株系12個和FM9純合型株系10個，E2包含EFT純合型株系12個和FM9純合型株系11個。群體構(gòu)建的具體流程如圖1所示。兩個剩余雜合體單株RHL17和RHL124的基因型組成如圖2所示。

1.2 田間試驗及性狀考查

F2:3群體、RIL群體和兩套F8:9近等基因系群體分別于2015年、2019年和2020年種植在浙江杭州（5月?9月）；兩套F8分離群體于2019年種植在海南陵水（2019年12月?2020年4月）。F8:9近等基因系群體每株系種2行，每行8個單株，株行距16.7 cm×26.7 cm，正常田間管理。成熟后混收中間4株。將每株系的種子在自然條件下風(fēng)干后用18%的生理鹽水浸種，取實粒于39℃烘箱烘干20 h[17]。使用SC-G型萬深考種自動分析儀測量千粒重，粒長和粒寬，每次150粒，2次重復(fù)取平均值，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

圖2 兩個剩余雜合體單株RHL17和RHL124與目標(biāo)qTGW1.2/qGL1.2區(qū)間的基因型組成

Fig.2.Schematic genotypes of two residual heterozygotes RHL17 and RHL124 and the targeted region of.

1.3 遺傳圖譜構(gòu)建與QTL分析

將在雙親FM9和EFT之間具有多態(tài)性的148對SSR（simple sequence repeats）標(biāo)記和通過親本間重測序結(jié)果獲得的58對InDel標(biāo)記，用于F2:3群體和RIL群體的基因型檢測，使用QTL IciMapping 4.2構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。F2:3群體的遺傳圖譜包含其中的155對標(biāo)記，總遺傳距離為2362.3 cM，平均距離為15.0 cM；RIL群體的遺傳圖譜包含其中的170對標(biāo)記，總遺傳距離為 1742.7 cM，平均距離為10.3 cM。兩套群體共用129對標(biāo)記，F(xiàn)2:3群體單獨(dú)使用的標(biāo)記26對，RIL群體單獨(dú)使用的標(biāo)記41對。

采用QTL IciMapping 4.2軟件[18]中的完備區(qū)間作圖法（Inclusive Composite Interval Mapping, ICIM），模擬計算1000次，獲得F2:3和RIL群體中QTL存在的閾值，分別為3.80和2.88；在全基因組范圍內(nèi)檢測千粒重、粒長和粒寬的QTL；QTL命名遵照McCouch等[19]建議的規(guī)則命名；將2個群體在同一染色體不同區(qū)間檢測到的QTL按物理位置依次命名。

1.4 穎殼掃描電鏡觀察

選取E1群體中的兩種親本純合型（FM9和EFT）的成熟干燥種子穎殼，經(jīng)導(dǎo)電處理后，置于掃描電子顯微鏡下觀察、采圖。為了保證兩個近等基因系之間的遺傳背景盡量保持一致，我們所挑選的兩個近等基因系衍生于同一個剩余雜合體單株RHL17；針對RHL17遺傳背景中的5個剩余雜合區(qū)間，我們進(jìn)一步分析了該對近等基因系的基因型。結(jié)果顯示，除了第2和第3染色體長臂的2個雜合區(qū)間已通過自交純合，呈FM9純合型，剩余的3個雜合區(qū)間仍為雜合。

1.5 RT-PCR表達(dá)分析

利用穎殼掃描電鏡觀察所用到的近等基因系進(jìn)行相關(guān)基因的表達(dá)分析。取5 cm左右的幼穗提取總RNA[7, 20]，cDNA合成反應(yīng)使用ReverTra Ace?反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO）。qRT-PCR使用SYBR?實時定量PCR試劑盒（TOYOBO），在Applied Biosystems? 7900HT快速實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行。使用水稻（）作為內(nèi)參對照，每個基因反應(yīng)均設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)，3個生物學(xué)重復(fù)，所用到的各基因引物參見附表1。

**表示在 0.01水平上顯著。

Fig.3.Comparison of 1000-grain weight, grain length and grain width of the parents EFT and FM9.

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010進(jìn)行表型數(shù)據(jù)的錄入、整理，作圖，并進(jìn)行數(shù)據(jù)相關(guān)性和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本、F2:3和RIL群體的粒重和粒形

親本EFT和FM9在千粒重、粒長和粒寬性狀上均存在極顯著的差異（圖3）；大粒親本FM9的千粒重高達(dá)41.01 g，粒長10.96 mm，粒寬3.38 mm，相比小粒親本EFT分別增加103%、57%和24%。EFT/FM9衍生的F2:3和RIL群體的千粒重、粒長和粒寬的頻率分布較為接近，均呈連續(xù)分布；粒寬表現(xiàn)出明顯的雙向超親分離現(xiàn)象，但千粒重、粒長的超親現(xiàn)象并不明顯（圖4）。此外，同一群體的三個性狀之間均呈極顯著正相關(guān)（<0.01）（表1）。

2.2 粒重和粒形QTL的初定位結(jié)果

應(yīng)用同樣衍生于EFT/FM9的F2:3和RIL群體開展千粒重、粒長、粒寬的QTL初定位。兩套群體分別檢測到29個和17個QTL。其中，11個QTL在兩個群體中均能檢測到，18個QTL僅在F2:3群體中檢測到，6個QTL僅在RIL群體中檢測到，因此，共定位到35個調(diào)控粒重粒形的QTL，分布在除第4和第8染色體外的其余10條染色體上。增效等位基因來自大粒親本FM9的QTL占到29個（83%）。并且，有多個調(diào)控不同粒重粒形性狀的QTL位于同一區(qū)間或相近位置。各性狀的具體QTL定位結(jié)果如下（表2和圖5）。

表1 EFT/FM9 F2:3和RIL群體粒型性狀相關(guān)性分析

**表示在0.01水平上顯著相關(guān)。

** Significantly correlated at 0.01 level.GL, Grain length; GW, Grain width; TGW, 1000-grain weight.

千粒重。分別在F2:3和RIL群體中檢測到12和9個QTL，其中，兩套群體同時檢測到的QTL有5個，F(xiàn)2:3群體單獨(dú)檢測到的有7個，RIL群體單獨(dú)檢測到的有4個，因此，共定位到16個調(diào)控千粒重變異的QTL，分布在除第4、8和11染色體外的9條染色體上。其中，除了和之外，14個QTL的增效等位基因均來自大粒親本FM9。的作用最強(qiáng)，在F2:3和RIL群體中均呈主效作用，來自FM9的等位基因增加粒重，加性效應(yīng)分別為3.7和3.0 g，貢獻(xiàn)率分別高達(dá)38.33%和34.24%；其余QTL的加性效應(yīng)和貢獻(xiàn)率均大幅減小，在F2:3群體中的加性效應(yīng)為0.76~1.49 g，貢獻(xiàn)率為1.76%~6.74%，在RIL群體中的加性效應(yīng)為0.91~1.41 g，貢獻(xiàn)率為3.16%~9.87%；此外，我們注意到QTL效應(yīng)排名在2~5位的、、和也能同時在兩套群體中起顯著作用。

圖4 EFT/FM9衍生的F2:3和RIL群體的粒重粒形性狀的頻率分布

Fig.4.Frequency distribution of grain weight and shape of EFT/FM9 derived F2:3and RIL populations.

粒長。分別在F2:3和RIL群體中檢測到11和6個QTL，其中，兩套群體同時檢測到的QTL有4個，F(xiàn)2:3群體單獨(dú)檢測到的有7個，RIL群體單獨(dú)檢測到的有2個，因此，共定位到13個調(diào)控粒長變異的QTL，分布在除第4、8、10和12染色體外的8條染色體上。其中，除了和之外，11個QTL的增效等位基因均來自大粒親本FM9。在與效應(yīng)最大的千粒重QTL相同的區(qū)間上也檢測到調(diào)控粒長的QTL，該位點同時在F2:3和RIL群體中起作用，加性效應(yīng)分別為0.21和0.32 mm，貢獻(xiàn)率分別為6.35%和18.24%。此外，我們還檢測到另一個效應(yīng)更大的粒長QTL，該位點在兩群體中的加性效應(yīng)分別為0.44和0.38 mm，貢獻(xiàn)率分別高達(dá)32.65%和25.95 %。和兩個位點的累加對兩套群體的粒長變異的貢獻(xiàn)分別可達(dá)39.00%和44.19%。其余位點的作用較弱，加性效應(yīng)變幅為0.12~0.22 mm，貢獻(xiàn)率介于2.27%~8.25%。

圖5 在F2:3和RIL群體中檢測到的粒重和粒形QTL

Fig.5.QTLs for grain weight and shape detected in F2:3and RIL populations.

表2 F2:3和RIL群體中檢測到的粒重粒形QTL

Add?加性效應(yīng)，指一個EFT等位基因取代一個FM9等位基因所產(chǎn)生的遺傳效應(yīng)。PVE－貢獻(xiàn)率，指相應(yīng)QTL所解釋的群體表型方差的比例。a初定位QTL區(qū)間包含或相鄰的已克隆粒重粒形QTL，其中，穗粒數(shù)基因?qū)αＶ亓Ｐ尉哂卸嘈浴?/p>

Add, Additive effect measured as the genetic effect when the FM9 allele is replaced by the EFT allele.PVE, Proportion of phenotypic variance explained by the QTL effect.aCloned QTL for grain weight and shape located in the given region, among whichare grainnumber genes showing pleiotropic effects on grain weight and shape.

粒寬。分別在F2:3和RIL群體中檢測到6個和2個QTL，其中，兩套群體同時檢測到的QTL有2個，F(xiàn)2:3群體單獨(dú)檢測到的有4個，因此，共定位到6個調(diào)控粒寬變異的QTL，分布在第2、3、5、11和12染色體上。其中，和的增效等位基因來源于小粒親本EFT，與相鄰及相同區(qū)間的和的等位效應(yīng)方向相同，其余4個粒寬QTL的增效等位基因來自大粒親本FM9。在被檢測到的6個QTL中，存在2個主效位點的分離，即和，這兩個位點在兩套群體中均起顯著作用，但效應(yīng)方向相反。在F2:3和RIL群體中的加性效應(yīng)分別為0.20和0.17 mm，貢獻(xiàn)率分別為30.95%和24.96%，大粒親本FM9的等位基因起增加粒寬的作用；的加性效應(yīng)分別為0.15 mm和0.13 mm，貢獻(xiàn)率分別為19.25%和15.49%，粒寬的增效等位基因卻來源于小粒親本EFT。這兩個效應(yīng)方向相反的主效位點的分離，可能是造成F2:3和RIL群體粒寬變異雙向超親分離現(xiàn)象相比千粒重和粒長變異更加明顯的原因。其余4個QTL的遺傳效應(yīng)均大幅減小，加性效應(yīng)變幅為0.05~0.07 mm，貢獻(xiàn)率為2.93%~4.42%。

2.3 對qTGW1.2/ qGL1.1的驗證

鑒于第1染色體長臂RM315?RM12138區(qū)間能同時在F2:3和RIL群體中檢測到對千粒重（）和粒長（）的顯著作用，并且暫未見該區(qū)間的進(jìn)一步驗證與基因克隆研究，我們隨即檢測重組自交系群體，從中挑選到2個不同遺傳背景的剩余雜合體單株RHL17和RHL124。它們在與RM315?RM12138交疊的FIR3596?FIR3892區(qū)間上（2.96 Mb）呈雜合，在其他背景區(qū)間上高度純合（圖2），通過自交，獲得了2套F8分離群體，并進(jìn)一步篩選目標(biāo)區(qū)間的純合單株，自交衍生相應(yīng)的2套F8:9家系群體，用于區(qū)間的粒重和粒長效應(yīng)驗證。

在初定位的F2:3和RIL群體中，區(qū)間對千粒重的加性效應(yīng)分別為1.08和0.94 g，平均1.01 g；對粒長的加性效應(yīng)分別為0.15和0.21 mm，平均0.18 mm。在兩套F8分離群體D1和D2中，區(qū)間的大粒親本FM9純合型、小粒親本EFT純合型以及雜合型材料之間的千粒重和粒長均有極顯著的表型差異，其中雜合型株系的表型值居中；D1和D2群體均未在該區(qū)間檢測到對粒寬的顯著作用，與初定位的結(jié)果吻合（圖6）。該QTL區(qū)間在D1和D2群體中的增效等位基因都來自大粒親本FM9，對千粒重的加性效應(yīng)分別為1.16和1.22 g，對粒長的加性效應(yīng)分別為0.22和0.23 mm。在兩套F8:9家系群體E1和E2中，兩個親本純合型材料之間的千粒重和粒長亦均呈極顯著的差異，同樣對粒寬無顯著效應(yīng)，加性效應(yīng)方向不變，對千粒重的加性效應(yīng)分別為0.89 g和1.18 g，對粒長的加性效應(yīng)分別為0.21 mm和0.22 mm（表3）。以上結(jié)果驗證了區(qū)間對千粒重和粒長的遺傳效應(yīng)。

2.4 穎殼表皮細(xì)胞的掃描電鏡觀察及細(xì)胞周期和粒形相關(guān)基因的表達(dá)分析

水稻谷粒大小通常由穎殼細(xì)胞的大小和數(shù)目決定[7, 39]。為了探究是如何通過調(diào)控穎殼細(xì)胞的分裂和生長影響粒長，我們利用掃描電鏡比較了E1群體中兩種親本純合型FM9和EFT之間成熟谷粒外穎細(xì)胞的數(shù)目和大?。▓D7-A、B）。結(jié)果表明，相較于短粒形EFT，長粒形FM9外穎細(xì)胞長度極顯著增加，細(xì)胞寬度卻顯著減小，我們推測長粒形FM9的粒長增加可能主要由其穎殼細(xì)胞的長度增加所造成，或也有可能通過調(diào)控細(xì)胞周期，影響細(xì)胞增殖而造成粒長的變化。因此，我們進(jìn)一步檢測了18個細(xì)胞周期相關(guān)基因、6個生長素相關(guān)基因和3個主效粒形基因（，，）在FM9和EFT的幼穗中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，16個相關(guān)基因表達(dá)水平表現(xiàn)出顯著變化，包括9個細(xì)胞周期相關(guān)基因、4個生長素相關(guān)基因和3個主效粒形基因（圖7-C）。其中，針對3個主效粒形基因，我們發(fā)現(xiàn)相比小粒EFT，在大粒FM9中，調(diào)控粒寬的和的表達(dá)水平分別顯著下降與上升，而調(diào)控粒長的顯著上升，該結(jié)果與主要調(diào)控粒長的變化相符。以上結(jié)果表明，可能參與、、介導(dǎo)的粒形調(diào)控途徑，通過調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞大小的變化造成穎殼細(xì)胞長度以及谷粒長度的改變。

**表示在0.01水平上差異顯著。

Fig.6.Comparison of plant architecture, grain shape and grain weight among different genotypes ofin the D1 population (A-C) and the D2 population (D-F) of advanced generations.

A?FM9和EFT的穎殼細(xì)胞（標(biāo)尺：200 μm）；B?外穎細(xì)胞長度和寬度的比較（*, **分別表示在 0.05 和 0.01 水平上顯著相關(guān)，=30）；C?FM9和EFT幼穗中細(xì)胞周期與粒形相關(guān)基因的表達(dá)水平比較。?A型細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1；?B型周期蛋白依賴性激酶2；? A型周期蛋白依賴性激酶1-1；?A型周期蛋白依賴性激酶2-1；?B型周期蛋白依賴性激酶1-1；?B型周期蛋白依賴性激酶2-2；?D型周期蛋白依賴性激酶4-1；?D型周期蛋白依賴性激酶4-2；?突觸融合蛋白相關(guān)蛋白KNOLLE；? T型細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1；?U型細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4-3；?U型細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4-1；MAD2?細(xì)胞擴(kuò)增相關(guān)基因MAD2；? E2F轉(zhuǎn)錄因子2；?絲裂原活化蛋白激酶；?微型染色體維持蛋白2；?微型染色體維持蛋白3；?微型染色體維持蛋白4；?粒寬基因；?粒長基因；?粒寬基因；?PIN蛋白1a；? PIN蛋白1；?大?；颍?Aux/IAA蛋白11；?生長素應(yīng)答因子19；?色氨酸轉(zhuǎn)氨酶。

A, Local outer surfaces ofFM9andEFTspikelet hulls.(Bars = 200 μm); B, Comparison of the cell length and width of outer glume cells (*, **Significant at 0.05 and 0.01 levels, respectively,=30); C, Two parental homozygous genotypesFM9andEFTare involved in the expression levels of cell cycle- and grain shape-related genes in young panicles.,Cyclin-dependent kinase A-1;,B-type cyclin-dependent kinase 2;1;, A-type cyclin 1;1;,A-type cyclin 3;1;,B-type cyclin 1;,B-type cyclin 2;2;,D-type cyclin 4;1;,D-type cyclin 4;2;,Syntaxin-related protein KNOLLE;, T-type cyclin 1;,U-type cyclin 4;3;,Cadmium tolerant 2;,Cell expansion-related gene MAD2;, E2F transcription factor 2;,Mitogen-activated protein kinase;,Mini-chromosome maintenance protein 2;,Mini-chromosome maintenance protein 3;,Mini-chromosome maintenance protein 4;, Grain weight 2;, Grain size 3;, Grain width 5;,Pin protein 1a;, Pin-formed 1b;,Big grain 1;,Aux/IAA protein 11;,Auxin response factor 19;,Tillering and small grain 1.

圖7 攜帶的FM9純合型（FM9）和EFT純合型（EFT）材料的穎殼表皮細(xì)胞掃描電鏡觀察和相關(guān)基因的表達(dá)分析

Fig.7.Scanning electron observation and quantitative expression analysis of related genes inFM9andEFT.

表3 高世代分離群體E1和E2中qTGW1.2/qGL1.2的效應(yīng)分析

加性效應(yīng)是指1個EFT等位基因取代1個FM9等位基因所產(chǎn)生的遺傳效應(yīng)。

Additive effect, Genetic effect when the FM9 allele is replaced by the EFT allele.

3 討論

我們應(yīng)用千粒重、粒長、粒寬分別相差20.85 g、3.99 mm、0.66 mm的大粒親本FM9與小粒親本EFT配組衍生F2:3和RIL兩套初定位群體開展粒重粒形的QTL分析，定位到16個千粒重QTL（兩套群體共定位的5個），13個粒長QTL（共定位4個）和6個粒寬QTL（共定位2個）。相較于RIL群體，F(xiàn)2:3群體檢測到的QTL更多，其累計解釋的群體千粒重變異可達(dá)77.97%，粒長變異73.80%，粒寬變異64.66%；當(dāng)進(jìn)一步整合RIL群體獨(dú)立檢測到的QTL后，更充分地揭示出大粒親本FM9與小粒親本EFT之間粒重粒形差異的遺傳控制基礎(chǔ)。但是，我們注意到，在前人的QTL初定位研究中，與相同組合衍生的F2等低世代臨時群體相比，RIL等高世代永久群體定位到的QTL個數(shù)普遍更多[40-46]；而本研究的QTL定位結(jié)果卻相反，雖然兩套群體對主效QTL的檢測都很穩(wěn)定，但是RIL群體對微效QTL的檢測能力明顯不足；這其中的一個重要原因可能是微效QTL容易受到環(huán)境和遺傳背景的雙重影響，使得這類QTL在RIL群體中不能有效表達(dá)，但具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究加以驗證。

三個性狀也都檢測到貢獻(xiàn)率>30%的主效QTL，如調(diào)控千粒重的、粒長的和粒寬；這些結(jié)果與粒重粒形的性狀遺傳力高，是由少數(shù)主效和多數(shù)微效QTL共同調(diào)控的典型數(shù)量性狀的普遍認(rèn)識相符[17, 47-48]。另一方面，在千粒重與和粒長QTL的檢測中，我們觀察到包括主效QTL在內(nèi)的絕大多數(shù)位點的增效等位基因均來自大粒親本FM9，可能是造成F2:3和RIL群體中這兩個性狀沒有表現(xiàn)超親分離的主要原因；而相比在粒寬的QTL檢測中，增效等位基因的分布平均，且兩個主效位點和的加性效應(yīng)方向相反，就使得F2:3和RIL群體的粒寬頻率分布出現(xiàn)了明顯的超親現(xiàn)象。

針對我們驗證的第1染色體長臂區(qū)間，發(fā)現(xiàn)在其兩側(cè)已分解出7個粒重粒形QTL，比如位于著絲粒方向的QTL、和，靠端粒方向的、、-和-[6, 49-54]。我們注意到，其中的6個QTL來源于同一組合“珍汕97/密陽46”，它們的增效等位基因既有來自珍汕97也有來自密陽46，但這些QTL的效應(yīng)普遍較小，千粒重加性效應(yīng)變幅僅為0.12~0.39 g，粒長僅為0.004~0.037 mm，粒寬僅為0.006~0.023 mm。我們驗證的并未在珍汕97/密陽46的組合中得到鑒定，且千粒重和粒長加性效應(yīng)較大，分別達(dá)到1.11 g和0.22 mm；此外，Zhang等[41]在日本晴/93-11群體中檢測的也未在珍汕97/密陽46的組合中起顯著作用，其粒長效應(yīng)也可達(dá)0.26 mm。從中可以看出，粒重粒形QTL可通過連鎖排列的方式成簇分布于染色體某一特定區(qū)段，并以不同的等位基因組合出現(xiàn)在不同的水稻品種中，因此，通過配組不同類型親本，進(jìn)一步分解、鑒定QTL簇中潛在的調(diào)控基因，有助于全面解析粒重粒形的調(diào)控機(jī)制，可更有效地借助分子技術(shù)進(jìn)行水稻粒重粒形的改良。

在本研究檢測的35個QTL中，13個包含或鄰近已克隆粒重粒形QTL，而且多效性區(qū)間均有主效QTL的報道，比如與，與，與，與，以及9與（表2）。針對其中3個主效水稻粒重粒形基因、和，我們初步分析了大粒親本FM9與小粒親本EFT間的基因型差異。首先，借助功能分子標(biāo)記-Ⅰ，N1212del分別對和位點進(jìn)行基因分型[56]，結(jié)果顯示，大粒親本FM9攜帶不能被Ⅰ內(nèi)切酶酶切的長?；蛐?，以及不含950 bp缺失的寬粒基因型，小粒親本EFT則相反，該結(jié)果與預(yù)期相符（附圖1）。然而，在位點上，我們未發(fā)現(xiàn)前人報道的在第4個外顯子上的1 bp移碼突變；并且通過對包括928 bp啟動子在內(nèi)的基因區(qū)間進(jìn)行測序分析[56]，也未能鑒定到可能引起其編碼蛋白環(huán)型E3泛素連接酶功能缺失的關(guān)鍵序列差異（附圖2），該結(jié)果一方面表明可能以其他遺傳機(jī)制調(diào)控FM9與EFT之間粒重粒形變異，另一方面也暗示可能存在新的調(diào)控基因，畢竟區(qū)間除對粒重和粒寬起作用外，還顯著影響粒長。

在后續(xù)的研究中，除了深入開展的精細(xì)定位與克隆研究，針對尚未克隆的且能在不同群體中穩(wěn)定表達(dá)的的進(jìn)一步分析鑒定，將有助于完善我們對水稻粒重和粒形遺傳基礎(chǔ)的認(rèn)識。

輔助信息：有1個輔助性表格和2個輔助性圖片放在中國水稻科學(xué)網(wǎng)站(http://www.ricesci.cn)上。

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QTL Analysis for Grain Weight and Shape and Validation of

DU Chengxing#, ZHANG Huali#, DAI Dongqing, WU Mingyue, LIANG Minmin, CHEN Junyu*, MA Liangyong*

(State Key Laboratory of Rice Biology and Chinese National Center for Rice Improvement, China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author, E-mail: chenjunyu@caas.cn, maliangyong@caas.cn)

【Objective】 Grain weight and shape have an important impact on the yield and quality of rice.The purpose is to further reveal the genetic mechanism of grain weight and shape in rice by primary mapping of QTLs for grain weight and shape and validating of the newly identifiedon the long arm of chromosome 1.【Method】 An F2:3population consisting of 277 individuals and a recombinant inbred line (RIL) population with 211 individuals were derived from the cross between the large-grain male parent FM9, and the small-grain female parent EFT.The1000-grain weight (TGW), grain length (GL) and grain width (GW) were measured.QTL mapping was performed by the inclusive composite interval mapping.As for theregion, two residual heterozygotes were screened and self-fertilized to produce segregated populations for QTL validation.【Results】 A total of 35 QTLs for TGW, GL and GW were detected by QTL primary mapping.Among them, 11 QTLs were detected in both populations, 18 QTLs were detected only in the F2:3population, and six QTLs only in the RIL population.The effects of the newly identifiedon TGW and GL were validated by using the segregated populations derived from the two residual heterozygotes.Additionally, significant variations in the length of glume cells were observed, and qPCR results demonstrated that the expression levels of genes related to cell cycle, auxin metabolism and grain shape were up- or down-regulated significantly.【Conclusion】 The primary mapping of 35 QTLs and the validating ofwill contribute to a deep insight into the genetic basis underlying grain weight andshape of rice, and also lay a foundation for gene cloning and marker assisted selection.

rice; grain weight; grain shape; QTL; residual heterozygote

10.16819/j.1001-7216.2021.201205

2020-12-08；

2021-01-26。

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項目（31701398）；國家863計劃資助項目（2014AA10A604-15）；浙江省農(nóng)業(yè)（糧食）新品種選育重大科技專項（2016C02050-4）；國家重點研發(fā)計劃資助項目（2016YFD0101104）。