申峰峰 晁青何 黃沁怡 張俊玲,

(1. 上海海洋大學(xué)農(nóng)村農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心, 上海 201306; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室, 青島 266071)

性腺發(fā)育是行有性生殖動(dòng)物繁殖的基礎(chǔ), 也是復(fù)雜而高度有序調(diào)控的過(guò)程, 主要由大量時(shí)期差異性表達(dá)的基因在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控[1]。microRNAs(miRNAs)是一類(lèi)長(zhǎng)度約為21—23 nt的內(nèi)源性單鏈小分子RNA。越來(lái)越多的研究表明,miRNAs通過(guò)與其作用的靶基因3′UTR區(qū)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá), 進(jìn)而在性腺發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[2—4]。近年來(lái), 一系列與性腺發(fā)育相關(guān)的miRNAs相繼被發(fā)現(xiàn), 如miR-34c、miR-122a、miR-449a、let-7e、miR-20、miR-106a和miR-202等[5—10]。其中, miR-202-5p是一種在哺乳動(dòng)物和低等脊椎動(dòng)物的性腺中大量表達(dá)的miRNA。在小鼠中, miR-202-5p在睪丸中表現(xiàn)出特異性的高表達(dá)[11];而在人類(lèi)中, 與正常男性相比, 不育男性睪丸中的miR-202-5p表達(dá)量降低了17倍[12]。miR-202-5p在非洲爪蟾(Xenopus laevis)和大西洋比目魚(yú)(Hippoglossus hippoglossus)的未成熟或成熟精巢中也表現(xiàn)出特異性的高表達(dá)[13,14]; 在斑馬魚(yú)(Dnaio rerio)中,miR-202-5p在精巢中特異性高表達(dá), 且在精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中的表達(dá)高于精子細(xì)胞和精子, 但在卵巢的生殖細(xì)胞中幾乎不表達(dá)[15]。盡管miR-202-5p在物種間的表達(dá)模式已有較多研究, 但對(duì)miR-202-5p作用的下游靶基因的研究還十分有限, 對(duì)其靶基因的鑒定將對(duì)研究miR-202-5p在脊椎動(dòng)物性腺發(fā)育中的功能起到重要的推動(dòng)作用。

研究發(fā)現(xiàn)色素框同源蛋白2(Chromobox homolog 2, CBX2)是多梳蛋白家族(Polycomb group, PcG)的關(guān)鍵成員之一[16]。PcG是一類(lèi)保守的蛋白家族,主要針對(duì)一系列與細(xì)胞分化、發(fā)育相關(guān)的基因, 在染色質(zhì)水平上進(jìn)行表觀遺傳修飾, 從而達(dá)到基因沉默的作用[17]。M33/cbx2缺失的小鼠雌雄性腺均表現(xiàn)出發(fā)育不良的現(xiàn)象, 甚至?xí)霈F(xiàn)性反轉(zhuǎn)[18]。在人類(lèi)中,cbx2突變也會(huì)導(dǎo)致類(lèi)似的性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象[19]。功能分析發(fā)現(xiàn),cbx2突變后將不能與下游靶基因正確結(jié)合, 并會(huì)結(jié)合到不同的序列之上, 喪失對(duì)sf1等下游靶基因的調(diào)控作用, 進(jìn)而不能充分調(diào)節(jié)性腺發(fā)育所必需的靶基因的表達(dá)[20], 從而造成性腺不能正常發(fā)育或性反轉(zhuǎn), 表明cbx2可能通過(guò)調(diào)節(jié)性腺發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)在脊椎動(dòng)物性腺發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一, 與其他硬骨魚(yú)類(lèi)的性腺發(fā)育時(shí)期劃分相似, 牙鲆性腺發(fā)育可以分為Ⅰ—Ⅵ期[21,22]。與牙鲆性腺相關(guān)的miRNAs已有一些報(bào)道, 但多集中于表達(dá)模式的研究[23,24], 而對(duì)miRNAs及其靶基因在性腺中的作用研究則鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期圍繞miRNAs在牙鲆性腺分化與發(fā)育中的作用機(jī)制開(kāi)展研究, 通過(guò)精卵巢miRNAs高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)miR-202-5p在牙鲆性腺中具有豐富的表達(dá)。為進(jìn)一步探討其在牙鲆性腺中的功能, 本研究采用熒光定量PCR確認(rèn)了miR-202-5p在牙鲆中的組織表達(dá)分布, 利用原位雜交技術(shù)觀察了其在精巢和卵巢中的定位表達(dá), 并運(yùn)用生物信息學(xué)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)鑒定了miR-202-5p與潛在靶基因cbx2的靶向關(guān)系, 期望為揭示miR-202-5p在魚(yú)類(lèi)性腺發(fā)育中的功能與調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用10月齡和12月齡牙鲆來(lái)自于中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站, 無(wú)菌解剖獲取精巢、卵巢、腦、心臟、肝臟、腎臟、肌肉和腸等組織樣品, 經(jīng)焦碳酸二乙酯處理水沖洗干凈, 置于TRizol(Invitrogen, 美國(guó))中勻漿, 用于總RNA提取;另取牙鲆精巢和卵巢組織, 用PBS洗滌后, 立即置于4%的多聚甲醛中固定24h, 用于組織切片制備。

1.2 Real-time PCR

首先采用TRizol法提取上述各組織中的總RNA, 然后分別使用miRcute miRNA first-strand cDNA Synthesis kit(天根, 中國(guó))和PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time,TaKaRa, 日本)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 合成cDNA的第一條鏈,分別用于后續(xù)miRNA和mRNA的熒光定量實(shí)驗(yàn)。使用Primer5.0設(shè)計(jì)牙鲆miR-202-5p和內(nèi)參基因18S RNA的定量引物(表1)進(jìn)行熒光定量實(shí)驗(yàn)。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物Tab. 1 Primers used in this experiment

Real-time PCR反應(yīng)在CFX96 Touch real time(Bio-Rad, 美國(guó))上進(jìn)行。根據(jù)miRcute miRNA qPCR detection kit(天根, 中國(guó))進(jìn)行miR-202-5p的熒光定量PCR, 總反應(yīng)體系為20 μL: cDNA模板1 μL, 上下游引物各0.4 μL, SYBR Green 10 μL及8.6 μL滅菌水。PCR擴(kuò)增程序?yàn)? 95℃, 20s; 60℃, 34s; 進(jìn)行39個(gè)循環(huán)反應(yīng), 并添加溶解曲線。內(nèi)參18S RNA基因的熒光定量PCR的反應(yīng)總體系為20 μL: cDNA模板1 μL, 上下游引物各1 μL, TB Green Premix ExTaqTMII(TaKaRa, 日本)10 μL及7 μL滅菌水。PCR擴(kuò)增程序?yàn)? 95℃, 10s; 60℃, 30s; 進(jìn)行39個(gè)循環(huán)反應(yīng), 并添加溶解曲線。定量結(jié)果采用2–ΔΔCt法計(jì)算,獲取miR-202-5p在牙鲆各組織中的相對(duì)表達(dá)水平,在SigmaPlot 12.5軟件上進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖, 用Spass 24進(jìn)行組間顯著性分析, 當(dāng)P<0.05時(shí)視為具有顯著性差異。

1.3 石蠟切片制備與原位雜交分析

將上述固定的牙鲆精巢和卵巢組織樣品使用70%—80%—90%—100% Ⅰ—100% Ⅱ酒精進(jìn)行梯度脫水, 再經(jīng)過(guò)1/2二甲苯+1/2無(wú)水乙醇-二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ逐級(jí)進(jìn)行透明, 最后用石蠟進(jìn)行透蠟和包埋, 制作石蠟切片。為了驗(yàn)證切片的時(shí)期和完整性,首先對(duì)切片進(jìn)行HE染色, 并將驗(yàn)證好的切片保存起來(lái), 用于后續(xù)的原位雜交實(shí)驗(yàn)。

用上述驗(yàn)證過(guò)的精、卵巢切片進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)。通過(guò)與miRBase V20.0數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比發(fā)現(xiàn), 牙鲆miR-202-5p與斑馬魚(yú)miR-202-5p完全保守, 因此,牙鲆miR-202-5p探針及原位雜交檢測(cè)試劑盒采購(gòu)自丹麥Exiqon公司,vasa探針合成如下: 使用Primer5.0設(shè)計(jì)牙鲆生殖細(xì)胞標(biāo)記基因vasa探針合成所需引物(表1), 將片段大小為846 nt的vasa的cDNA片段插入到pGEM-T載體中。根據(jù)RNA Labeling kit(羅氏, 瑞士)的說(shuō)明書(shū), 用spel或sphl將重組質(zhì)粒線性化, 以轉(zhuǎn)錄DIG標(biāo)記的反義或正義探針。合成探針用DNaseI(賽默飛, 美國(guó))孵育, 并加入LiCl在–80℃沉淀2h。原位雜交基本過(guò)程如下: 組織切片脫蠟,水化, 于胃蛋白酶消化20min, 漂洗后, 55℃預(yù)雜交3h, 地高辛標(biāo)記的miR-202-5p探針和vasa探針恒溫雜交過(guò)夜, 洗滌后封閉1h, 于抗體中孵育過(guò)夜, 洗滌后加NBT/BCIP室溫避光顯色30min。使用正置光學(xué)顯微鏡(尼康, 日本)對(duì)原位雜交結(jié)果進(jìn)行拍照并記錄。

1.4 生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-202-5p的靶基因

本研究根據(jù)已篩選獲得的miR-202-5p的成熟序列及NCBI中牙鲆cbx2基因3′UTR序列, 采用RNAhybrid (https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)軟件預(yù)測(cè)候選靶基因cbx2的3′UTR與miR-202-5p的種子序列的結(jié)合位點(diǎn)。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因重組載體構(gòu)建與酶切鑒定

根據(jù)牙鲆cbx2基因3′UTR序列, 使用Primer5.0設(shè)計(jì)候選靶基因cbx2雙熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建引物(表1)進(jìn)行重組載體構(gòu)建, 以牙鲆精巢cDNA為模板, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增出上述候選靶基因的3′UTR片段。反應(yīng)體系如下: cDNA 1 μL、2×TaqPCR Master Mix酶10 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)程序如下: 95℃預(yù)變性3min,95℃變性10s, 60℃退火20s, 72℃延伸50s, 共35個(gè)循環(huán)。在反應(yīng)完成后, 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%凝膠電泳檢測(cè), 在凝膠成像儀上, 將目的條帶快速切下, 并使用膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收。將回收的目的產(chǎn)物連接到pMD19-T Vector上, 16℃連接16h后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中, 隨后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選, 挑取單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng), 經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證后選取陽(yáng)性克隆送往上海生工生物工程公司測(cè)序。

將加有酶切位點(diǎn)的cbx2 3′UTR的質(zhì)粒與pmir-GLO載體分別用XbaⅠ和SacⅠ限制性內(nèi)切酶(NEB,美國(guó))進(jìn)行雙酶切。分別回收目的產(chǎn)物, 并使用T4 DNA連接酶過(guò)夜連接, 轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中, 藍(lán)白斑篩選, 提取質(zhì)粒后, 經(jīng)雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證后, 將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒命名為pmir-GLO-cbx2。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

本研究所用miR-202-5p mimics購(gòu)自上海吉瑪基因。采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)對(duì)上述預(yù)測(cè)的候選靶基因進(jìn)行鑒定, 具體步驟如下: 將狀態(tài)良好的293T細(xì)胞接種于24孔板中, 并于10%-FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng), 待細(xì)胞密度達(dá)到70%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將1 μg重組質(zhì)粒和12 pmol的miR-202-5p mimics、negative control mimics和1 μL lipofectamineTM3000 reagent轉(zhuǎn)染試劑分別用不含F(xiàn)BS和抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋到100 μL(n=3), 將混合液充分混勻, 孵育15min, 分別將混合液加入相應(yīng)孔內(nèi),6h后更換新鮮培養(yǎng)基, 于37℃, 5%CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)24h, 空白組僅添加1 μg 重組質(zhì)粒DNA, 不添加miR-202-5p mimics和negative control mimics, 其余處理方式與上述實(shí)驗(yàn)組相同。熒光素酶活性檢測(cè)根據(jù)Dual-Luciferase?Reporter Assay System說(shuō)明書(shū)進(jìn)行, 記錄Firefly Luciferase與Renilla Luciferase比值(n=3), 用 SigmaPlot12.5軟件作圖, 用One-Way方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)的顯著性差異, 當(dāng)P<0.05 時(shí)視為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 miR-202-5p在牙鲆不同組織中的表達(dá)分布

采用熒光定量PCR檢測(cè)了miR-202-5p在牙鲆不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示, miR-202-5p在牙鲆性腺組織中表達(dá)豐富, 尤其是在精巢中的表達(dá)量最高, 卵巢次之, 而在其他組織中的表達(dá)量非常低(圖1,P<0.05)。

圖1 miR-202-5p在牙鲆不同組織中的表達(dá)分析Fig. 1 The expression level of miR-202-5p in Japanese flounder different tissues

2.2 miR-202-5p在牙鲆雌雄性腺中的定位表達(dá)

為進(jìn)一步檢測(cè)miR-202-5p在性腺中的定位表達(dá), 本研究進(jìn)行了HE和原位雜交分析, 并以生殖細(xì)胞標(biāo)記基因vasa作為定位參考。經(jīng)HE染色鑒定本實(shí)驗(yàn)所用精卵巢組織為Ⅳ期的精巢和Ⅴ期的卵巢。牙鲆Ⅳ期精巢體積較大, 精巢中的生殖上皮隨著結(jié)締組織向精巢內(nèi)部延伸, 形成許多隔膜, 把精巢分成許多不規(guī)則的精小葉, 同一個(gè)精小葉里生殖細(xì)胞發(fā)育不同步。從精小葉結(jié)構(gòu)上看, 生殖細(xì)胞沿精小葉由外向里可分為精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精細(xì)胞和精子; 在牙鲆Ⅴ期卵巢中, 既可見(jiàn)Ⅴ期的成熟卵母細(xì)胞, 同時(shí)也存在Ⅰ—Ⅳ期卵母細(xì)胞。原位雜交結(jié)果顯示: miR-202-5p僅在Ⅳ、Ⅴ期的卵母細(xì)胞中有較強(qiáng)烈雜交信號(hào), 而在其他時(shí)期的卵母細(xì)胞中雜交信號(hào)微弱; 而vasa則是在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ等早期的卵母細(xì)胞中均檢測(cè)到強(qiáng)烈的雜交信號(hào), 在Ⅳ和Ⅴ時(shí)期的卵母細(xì)胞中雜交信號(hào)逐漸減弱。不同的是, 在精巢中, miR-202-5p表現(xiàn)出與vasa相似的表達(dá)模式, 其均在精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中檢測(cè)到強(qiáng)烈的雜交信號(hào), 而在精子細(xì)胞和精子中雜交信號(hào)微弱(圖2)。

圖2 牙鲆精卵巢中地高辛標(biāo)記的原位雜交(ISH)Fig. 2 DIG-labeled in situ hybridization (ISH) in the testis and ovary of Japanese founder

2.3 miR-202-5p與cbx2靶向關(guān)系預(yù)測(cè)

利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-202-5p種子序列與其候選靶基因cbx2的3′UTR區(qū)的結(jié)合位點(diǎn), 如圖3所示,cbx2 3′UTR區(qū)僅與miR-202-5p的2—8位種子序列第六位不互補(bǔ), 可能是其潛在的靶基因。

圖3 miR-202-5p靶基因的預(yù)測(cè)Fig. 3 Prediction of target gene of miR-202-5p

2.4 pmir-GLO-cbx2重組質(zhì)粒構(gòu)建與驗(yàn)證

以牙鲆精巢cDNA為模板, 根據(jù)牙鲆cbx2基因3′UTR序列設(shè)計(jì)特異性引物, 克隆出長(zhǎng)度為501 bp的cbx2基因3′UTR片段(圖4, 泳道1), 凝膠電泳條帶大小與預(yù)測(cè)大小一致, 表明cbx2基因3′UTR片段克隆成功。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pmir-GLO-cbx2用XbaⅠ和SacⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證, 得到線性化質(zhì)粒和cbx2基因3′UTR片段, 凝膠電泳分析顯示兩條條帶大小分別約為7300和501 bp(圖4, 泳道2), 結(jié)合公司測(cè)序結(jié)果, 與預(yù)期結(jié)果一致, 表明pmir-GLO-cbx2重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖4 cbx2 3′UTR區(qū)克隆及重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig. 4 Result of cloning of cbx2 3′UTR region and double enzyme digestion of recombinant plasmid

2.5 miR-202-5p與cbx2靶向關(guān)系的鑒定

雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 與空白組和對(duì)照組相比, mimics組的熒光素酶活性顯著降低, 而空白組與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異(圖5,P<0.05)。結(jié)果表明, 過(guò)表達(dá)miR-202-5p后, 下調(diào)了cbx2 mRNA水平, 初步證實(shí)了cbx2是miR-202-5p直接作用的靶基因。

圖5 轉(zhuǎn)染重組載體pmirGLO-cbx2后熒光酶活性分析Fig. 5 Luciferase activity of reporter plasmid containing cbx2 3′UTR

3 討論

本研究首先分析了miR-202-5p在牙鲆不同組織中的表達(dá)情況, 結(jié)果表明miR-202-5p在牙鲆雌雄性腺中的表達(dá)量豐富, 而在其他組織幾乎不表達(dá), 表明miR-202-5p是牙鲆性腺特異并高表達(dá)的miRNA,這與先前在斑馬魚(yú)[15]和青鳉(Oryzias latipes)[25]中的研究結(jié)果一致。在斑馬魚(yú)中, miR-202-5p在性腺中具有較高表達(dá), 在精巢中表達(dá)量高于卵巢, 且在精原細(xì)胞中的表達(dá)最強(qiáng)[15]; 在青鳉中, miR-202-5p在精巢中的表達(dá)同樣高于卵巢, 在精巢中所有的生殖細(xì)胞中均有表達(dá), 但在精原細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)于精子[25]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-202-5p在精巢中的表達(dá)量高于卵巢, 原位雜交的結(jié)果進(jìn)一步表明miR-202-5p主要在精巢的精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中表達(dá), 而在精細(xì)胞和精子中沒(méi)有明顯的信號(hào)。這表明miR-202-5p可能在牙鲆精子發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用。據(jù)報(bào)道, 在雞精巢的生殖細(xì)胞中, miR-202-5p在精原細(xì)胞中的表達(dá)量最高[26]。綜上所述, miR-202-5p在脊椎動(dòng)物中具有廣泛的物種表達(dá)分布, 但在兩性性腺中, 尤其是精巢中具有較高的表達(dá), 這種雄性偏向性的表達(dá)模式表明miR-202-5p可能在精巢發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。

miRNA靶基因的預(yù)測(cè)與鑒定, 是研究miRNA功能的關(guān)鍵依據(jù)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)靈敏度高、操作簡(jiǎn)便, 是目前最常用的鑒定miRNA靶基因的一種手段[27]。本研究利用生物信息學(xué)和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)鑒定了miR-202-5p的靶基因, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)cbx2是miR-202-5p直接作用的靶基因, 在細(xì)胞水平初步明確了miR-202-5p與cbx2之間的負(fù)調(diào)控關(guān)系。先前的研究已表明cbx2是哺乳動(dòng)物性腺發(fā)育調(diào)控的重要因子[28]。研究發(fā)現(xiàn),M33(cbx2)基因缺失的雄性小鼠會(huì)出現(xiàn)向雌性轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象[29]。Eid等[30]在細(xì)胞中對(duì)cbx2進(jìn)行RNA干擾, 發(fā)現(xiàn)隨著cbx2被抑制, 減數(shù)分裂必不可少的基因-EXO1和雄性發(fā)育相關(guān)基因sox3的表達(dá)量也隨之降低; 而過(guò)表達(dá)cbx2后,EXO1基因和sox3基因的表達(dá)量升高, 與此同時(shí),Pbx1和Fzd1等雌性發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)量出現(xiàn)下降。研究表明,cbx2不僅可以通過(guò)調(diào)控下游靶基因sf1和NR5A1等的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控sry基因的表達(dá), 從而影響雄性性腺發(fā)育[20]; 還可以通過(guò)直接或間接抑制雌性性別相關(guān)基因wnt4和foxl2(forkhead transcriptional factor 2)的表達(dá), 抑制雌性的某些信號(hào)通路[30]。此外, 較多的研究也表明cbx2在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期變化[31,32]、減數(shù)分裂、同源染色體的聯(lián)會(huì)和生殖細(xì)胞增殖分化中發(fā)揮著較為重要的作用[33]。目前,cbx2基因在魚(yú)類(lèi)中的研究還很少, 本實(shí)驗(yàn)室王新艷等[34]研究發(fā)現(xiàn),cbx2在牙鲆性腺中表達(dá), 暗示cbx2可能在魚(yú)類(lèi)性腺發(fā)育中發(fā)揮重要作用。晁青何等[35]在青鳉中通過(guò)RNAi干擾抑制cbx2的表達(dá)發(fā)現(xiàn), 雄性性別相關(guān)基因sox9(SRY-related HMG box 9)的表達(dá)量降低, 而雌性性別相關(guān)基因foxl2的表達(dá)量升高, 表明cbx2可能通過(guò)調(diào)節(jié)性別相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控魚(yú)類(lèi)的性腺發(fā)育。本研究明確了miR-202-5p與cbx2間存在直接的靶向關(guān)系, 表明miR-202-5p可能通過(guò)調(diào)節(jié)cbx2進(jìn)而在牙鲆性腺發(fā)育中發(fā)揮重要作用, 為深入研究miR-202-5p和cbx2在牙鲆性腺發(fā)育中的作用機(jī)制提供了基礎(chǔ), 而其在牙鲆性腺發(fā)育和精子發(fā)生中具體扮演著怎樣的角色仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。