郁 濃 石瑤瑤 葉元土

(蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院, 水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘇州 215123)

大豆具有蛋白含量高、消化率高和氨基酸結(jié)構(gòu)相對(duì)平衡等營養(yǎng)優(yōu)點(diǎn), 被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)飼料中。然而, 大豆含有干擾魚體健康狀況的化學(xué)物[1],目前這些物質(zhì)被歸為抗?fàn)I養(yǎng)因子。豆粕是大豆經(jīng)浸提或預(yù)壓浸提制油工藝的副產(chǎn)物, 脫溶和烘烤等處理可以部分去除一些熱不穩(wěn)定抗?fàn)I養(yǎng)因子, 如胰蛋白酶抑制劑、凝集素和致甲狀腺腫因子等[2], 已經(jīng)有學(xué)者以豆粕基礎(chǔ)日糧飼喂水產(chǎn)動(dòng)物, 不僅會(huì)引起腸炎性疾病[3], 而且會(huì)導(dǎo)致肝臟組織病變和生理異常。例如, 在石首魚的研究中證實(shí)了當(dāng)日糧豆粕水平在44%以上時(shí), 肝臟細(xì)胞核發(fā)生了偏移, 出現(xiàn)大量的脂質(zhì)空泡[4]; 45%豆粕替代魚粉能夠破壞大黃魚肝臟組織結(jié)構(gòu)[5]; 16%豆粕替代魚粉使凡納濱對(duì)蝦過度應(yīng)激造成肝胰腺受損[6]; 我們實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了不同比例豆粕含量日糧對(duì)草魚肝胰臟結(jié)構(gòu)與功能影響試驗(yàn), 結(jié)果表明在日糧中添加60%豆粕能夠引起草魚肝胰臟代償性增大[7], 肝胰臟的蛋白酶活力顯著下降[8]。這種異常是由一種或幾種抗?fàn)I養(yǎng)因子, 例如皂甙、植物甾醇、寡糖和/或其他不明成分引起的[9—12]。目前文獻(xiàn)報(bào)道主要是引起腸炎機(jī)制, 其毒性成分種類尚不明確, 肝毒性作用與抗?fàn)I養(yǎng)因子是否具有相關(guān)性有待研究。

肝臟作為魚類具代謝活性重要器官, 在營養(yǎng)物質(zhì)的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存及外源物質(zhì)的代謝等方面發(fā)揮重要作用[13,14]。采用體外培養(yǎng)草魚原代肝臟細(xì)胞, 能夠使代謝酶保持較高水平, 表現(xiàn)出完整的特異性功能, 是研究肝臟細(xì)胞體外代謝水平的較好模型[15]。在機(jī)體受到某些因子刺激時(shí), 魚體內(nèi)過量的氧化物積累會(huì)對(duì)核酸、蛋白質(zhì)組分和生物膜等重要大分子造成損傷[16]。線粒體被認(rèn)為是產(chǎn)生活性氧的主要部位, 線粒體中過量的活性氧能夠引起氧化應(yīng)激, 增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的活性, 造成線粒體損傷, 甚至引起細(xì)胞凋亡[17]。營養(yǎng)物質(zhì)作為一種信號(hào), 肝細(xì)胞通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)來改變代謝途徑,使其達(dá)到穩(wěn)態(tài), 基因組學(xué)利用高通量方法研究肝臟的生理反應(yīng)和植物性膳食成分適應(yīng)性反應(yīng)[18]。

本文利用草魚肝臟分離的原代肝細(xì)胞為試驗(yàn)對(duì)象, 以大豆和豆粕的水提物為實(shí)驗(yàn)材料。在離體培養(yǎng)的肝細(xì)胞中定量加入不同劑量的水提物, 研究水提物對(duì)肝細(xì)胞活力和超微結(jié)構(gòu)等的影響, 探討大豆和豆粕水提物對(duì)肝細(xì)胞的損傷作用。采用RNAseq測序技術(shù), 考察對(duì)肝細(xì)胞全基因表達(dá)譜的影響,闡明損傷作用的位點(diǎn)和機(jī)制等, 不僅提高了我們對(duì)魚類肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)、代謝和免疫功能等方面的基本認(rèn)識(shí), 而且為修飾、消除或調(diào)節(jié)這些反應(yīng)提供了潛在的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

M199培養(yǎng)基(Hyclone, 美國)、胎牛血清(Gibco,美國)、胰蛋白酶(Gibco, 美國)、CCK-8(同仁化學(xué),日本)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase, LDH)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、還原性谷胱甘肽(Glutathione, GSH)、線粒體膜電位檢測試劑盒(南京建成)、Hoechst 33258染色液、活性氧(Reactive oxygen species, ROS)、可溶性糖試劑盒(碧云天)、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(聯(lián)科生物)、CO2培養(yǎng)箱(HF 90/HF 240, Heal Force)、低速離心機(jī)、低速恒溫振蕩器、酶標(biāo)儀(Gene Company Limited)、流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter, 美國)、電子顯微鏡(型號(hào): 120 kv HT-7700, 日立)。

1.2 SAE、SMAE的制備和成分分析

為了除去大豆中熱敏感抗?fàn)I養(yǎng)因子和脲酶對(duì)試驗(yàn)的影響, 模擬豆粕加工時(shí)溫度[19], 故采用高溫干熱法去除脲酶, pH增值法進(jìn)行檢測脲酶活力, 當(dāng)ΔpH<0.3時(shí)符合巴西豆粕質(zhì)量指標(biāo)。將熱處理后的巴西大豆和同一批次巴西豆大豆生產(chǎn)的豆粕(均購于張家港中糧集團(tuán))粉碎并過60目篩, 分別稱取等量豆粕和大豆, 均以1∶6(w/v)的比例加入蒸餾水, 在4℃冰箱中浸提24h, 不斷進(jìn)行攪拌; 真空抽濾后得到濾液, 冷凍干燥后得到水提物凍干粉, 將其置于–80℃保存以備后續(xù)使用。對(duì)凍干粉進(jìn)行成分分析,測定其得率、水分、蛋白質(zhì)、脂肪、灰分、可溶性糖及小肽含量。水分是105℃烘干至恒重下測定的。蛋白質(zhì)含量測定采用凱氏定氮法(GB/T 6432-2018); 石油醚索式抽提24h后, 測定粗脂肪含量(GB/T 6433-2006); 氣相色譜法對(duì)脂肪酸組成及含量進(jìn)行測定; 550℃灼燒測定灰分含量; 高效液相色譜法(GB/T 22729-2008)測定肽組成和含量; 可溶性糖含量測定參照南京建成生物工程學(xué)院試劑盒說明書, 成分分析結(jié)果見表1。對(duì)大豆和豆粕凍干后的水提物進(jìn)行了稱重, 凍干前后干物質(zhì)的浸出率分別為23.19%和18.86%。SAE和SMAE中存在的主要化合物是蛋白、碳水化合物和灰分, 2種樣品在可溶性糖、蛋白和肽含量的相對(duì)含量上存在差異。

表1 SAE和SMAE的組成成分和小肽含量(g/100 g干物質(zhì))Tab. 1 Chemical compositions and peptides content of SAE and SMAE (g/100 g dry matter)

1.3 實(shí)驗(yàn)魚的管理

實(shí)驗(yàn)草魚平均體重為(15.0±5.0) g, 來自于蘇州市吳江區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站試驗(yàn)場, 為一冬齡魚種。為了保障試驗(yàn)草魚的生理健康, 將試驗(yàn)用草魚暫養(yǎng)于蘇州大學(xué)魚類室內(nèi)循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中, 至少養(yǎng)殖2周以上, 每天投喂1次32%蛋白質(zhì)和8%脂肪含量的草魚膨化料, 養(yǎng)殖水體溫度為(24.0±5.0)℃, 溶氧為(5.0±0.5) mg/L。

1.4 草魚原代肝細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

參考秦潔等[20]的組織塊酶解法, 將實(shí)驗(yàn)草魚浸泡在0.01%高錳酸鉀溶液中30min, 用75%的酒精擦拭體表, 放入超凈工作臺(tái)中, 取出肝臟組織, 用預(yù)冷的D-Hanks試劑清洗, 將組織塊剪切成1 mm3大小,加入3倍體積的0.25%胰酶放入振蕩培養(yǎng)箱中低速振蕩消化15min, 用70 μm細(xì)胞濾膜過濾組織塊, 1000 r/min離心1min, 去除上清液。加入D-Hanks液和紅細(xì)胞裂解液(1∶3)混合液以去除紅細(xì)胞, 再進(jìn)行離心(1000 r/min, 4min)去除上清液, 輕洗2次離心后得到肝細(xì)胞, 用臺(tái)盼藍(lán)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色檢測, 活細(xì)胞的存活率>85%時(shí)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。用M199培養(yǎng)基(15%胎牛血清、青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 μg/mL和兩性霉素0.25 μg/mL)重懸細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù), 調(diào)整細(xì)胞濃度后置于27℃、4.5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.5 不同濃度水提物對(duì)草魚原代肝細(xì)胞活力的影響

將上述方法獲得的原代肝細(xì)胞(4×105個(gè)/孔)接種到96孔板中, 每孔100 μL。在培養(yǎng)24h后, 將SAE和SMAE用含5%胎牛血清的培養(yǎng)基稀釋成不同濃度, 使SAE和SMAE在細(xì)胞培養(yǎng)液中的終濃度分別為0、0.5、2.5、5.0和10.0 mg/mL, 每個(gè)濃度至少設(shè)置6個(gè)復(fù)孔, 在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。采用CCK-8微板比色法檢測細(xì)胞活力。方法為每孔加入10 μL CCK-8溶液, 培養(yǎng)箱孵育2h, 在450 nm波長下檢測吸光度(OD值)。

1.6 透射電子顯微鏡檢測細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

收集對(duì)照組和5.0 mg/mL SAE、SMAE 組細(xì)胞數(shù)量為6×106個(gè), PBS洗2遍, 棄上清, 用2.5%戊二醛作前固定, 1%鋨酸作后固定, 梯度乙醇脫水后氧化丙烯浸透、環(huán)氧樹脂包埋、制超薄切片, 切片在200目銅網(wǎng)上收集, 干燥24h, 用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛雙重染色, 在透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)改變。

1.7 Hoechst 33285染色

Hoechst 33285是一種可以穿透細(xì)胞膜的非嵌入性熒光染料, 在染色體AT序列富集區(qū)域的小溝處與DNA結(jié)合, 在紫外光激發(fā)下可以發(fā)出亮藍(lán)色熒光[21]。為了進(jìn)一步觀察細(xì)胞的凋亡特征, 使用熒光顯微鏡觀察Hoechst 33258試劑染色后的細(xì)胞核形態(tài)。方法為PBS清洗細(xì)胞2遍, 在4%多聚甲醛固定后添加100 μL的 Hoechst 33258試劑, 避光孵育30min。PBS洗滌3次去除背景色, 在熒光倒置顯微鏡檢測并拍照。

1.8 肝細(xì)胞相關(guān)抗氧化酶的檢測

采用微板法測定上清中LDH活力, 450 nm波長下多功能酶標(biāo)儀測定吸光光度值。采用可見分光光度計(jì)法檢測上清中MDA的含量, 細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH按南京建成細(xì)胞專用試劑盒說明書處理, 分別在酶標(biāo)儀450和405 nm處檢測OD值。

1.9 Annexin V/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡

肝細(xì)胞在含SAE和SMAE的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后, 收集板中所有細(xì)胞, 清洗后加入195 μL Annexin V-FITC輕輕重懸細(xì)胞, 依次加入5 μL Annexin VFITC、10 μL PI染色液, 輕輕混勻。避光孵育15min后置于冰浴中, 用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測細(xì)胞凋亡百分比。統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本中超過10000個(gè)細(xì)胞, 定量分析細(xì)胞凋亡率。

1.10 線粒體膜電位(MMP)檢測

收集細(xì)胞重懸于0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中, 加入0.5 mL JC-1染色工作液, 顛倒多次混勻, 在27℃培養(yǎng)箱中孵育40min。染色結(jié)束后沉淀細(xì)胞, 用JC-1染色緩沖液洗滌2次, 重懸后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.11 ROS檢測

加入熒光探針DCFH-DA于培養(yǎng)基中, 濃度為10 μmol/L, 27℃孵育細(xì)胞30min, 用胰酶消化細(xì)胞,加入培養(yǎng)基終止消化制成細(xì)胞懸液, 1000×g離心5min收集細(xì)胞, 用PBS洗滌2次, 再次離心收集細(xì)胞進(jìn)行上機(jī)檢測。

1.12 轉(zhuǎn)錄組分析

基于以上結(jié)果, 轉(zhuǎn)錄本選用的是對(duì)照組、5.0 mg/mL濃度下的 SAE組和SMAE組細(xì)胞進(jìn)行分析。RNA的質(zhì)量、完整性和純度采用瓊脂糖凝膠電泳法和分光光度計(jì)法。由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行RNA-seq測序, 采用 Illumina HiSeq測序平臺(tái)完成轉(zhuǎn)錄組測序, 構(gòu)建Illumina PE文庫(**bp)進(jìn)行2×150 bp測序, 對(duì)獲得的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制,利用生物信息學(xué)手段對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.13 數(shù)據(jù)處理和分析

所有值均以至少3個(gè)批次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因子方差分析(One-way ANOVA), 組間差異顯著性用Duncan氏多重比較進(jìn)行分析(Duncan’s multiple range test)。用GraphPad軟件(GraphPad Prism 6.0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)和圖形繪制。P<0.05表示顯著差異, P<0.01表示極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 SAE和SMAE對(duì)草魚原代肝細(xì)胞活力的影響

如圖1所示, 在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入SAE和SMAE后, 細(xì)胞相對(duì)活力下降。0.5和2.5 mg/mL濃度下的 SAE和SMAE組細(xì)胞相對(duì)活力與空白對(duì)照組相比無顯著性差異。5.0和10.0 mg/mL的 SAE劑量組相對(duì)細(xì)胞活力與濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān), 細(xì)胞活力分別為(78.10±8.57)%和(65.97±7.35)%, 與對(duì)照組相比具有極顯著差異(P<0.01)。與之相同, 同劑量的SMAE組細(xì)胞相對(duì)活力分別為 (86.35±7.17)%和(80.26±7.08)%。

圖1 CCK-8法檢測相對(duì)細(xì)胞活力Fig. 1 Primary hepatocytes viability assessed by CCK-8 assay

2.2 肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

如圖2所示, 正常組肝細(xì)胞核呈現(xiàn)圓形或橢圓形, 雙層膜結(jié)構(gòu)清晰可見, 核仁位于核中央, 大而清晰, 細(xì)胞質(zhì)均勻分布, 胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器和內(nèi)含物豐富,線粒體特別發(fā)達(dá), 呈圓球形、橢圓形、彎月形、球桿狀或長桿狀, 內(nèi)有清晰的細(xì)管狀嵴, 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),常呈層狀排列, 膜表面有核糖體分布(圖2A和2B)。相比之下, SAE組(5.0 mg/mL)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體數(shù)量減少, 且腫脹現(xiàn)象明顯。肝細(xì)胞內(nèi)聚集了大小不一的大脂滴(圖2C和2D)。SMAE組(5.0 mg/mL)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變, 包括核染色質(zhì)沿核膜的環(huán)狀凝結(jié)、稀疏的光密度、胞質(zhì)、線粒體腫脹和數(shù)量的減少、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腫脹(圖2E和2F)。上述結(jié)果表明, SAE和SMAE均能導(dǎo)致肝細(xì)胞微觀結(jié)果的顯著性改變, 主要的變化在細(xì)胞核和線粒體的微觀結(jié)構(gòu)。

圖2 肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察Fig. 2 Ultrastructural observation of Hepatocytes

2.3 Hoechst 333258染色

選用5.0 mg/mL濃度組的 SAE和SMAE組肝細(xì)胞被Hoechst 33258染色, 如圖3所示, 熒光顯微鏡下可見對(duì)照組細(xì)胞大小一致, 形狀為圓形, 且亮度均一。經(jīng)水提物培養(yǎng)后的細(xì)胞藍(lán)色熒光強(qiáng)度減弱, 核縮小, 形態(tài)不規(guī)則, 邊緣模糊, 可見少量的核碎片,染色不均勻(染色質(zhì)凝集), 染色質(zhì)邊緣化等形態(tài)變化。

圖3 Hoechst 333258熒光染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化Fig. 3 Nuclear morphological changes were observed by hoechst 333258 fluorescent staining

2.4 SAE、SMAE對(duì)草魚原代肝細(xì)胞抗氧化相關(guān)酶活力的影響

圖4A顯示的是細(xì)胞上清液LDH含量的變化,可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞損傷的指標(biāo)。0.5 mg/mL濃度下的SAE組和0.5、2.5 mg/mL濃度下的SMAE組細(xì)胞上清液中LDH含量較低, 與對(duì)照組相比無顯著性差異, 2.5 mg/mL SAE組細(xì)胞外液LDH與對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05), 在兩組高劑量濃度(5.0和10.0 mg/mL)下, 細(xì)胞釋放到培養(yǎng)液中的LDH含量與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。如圖4B所示,兩組細(xì)胞上清液的MDA含量趨勢呈現(xiàn)上升狀態(tài)(P<0.01)。如圖4C和4D所示, 與對(duì)照組相比, 當(dāng)SAE和SMAE添加量為5.0和10.0 mg/mL時(shí), 還原型谷胱甘肽(GSH)含量差異極顯著(P<0.01), 且SOD活性與對(duì)照組相比均有顯著差異(P<0.01)。在同濃度下, SAE組細(xì)胞上清液中LDH和MDA含量高于SMAE組, 抗氧化酶活力低于SMAE組。

圖4 SAE和SMAE對(duì)草魚原代肝細(xì)胞抗氧化酶活性的影響Fig. 4 Effects of SAE and SMAE on antioxidant enzyme activity in primary hepatocytes of grass carp

2.5 SAE和SMAE誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡

對(duì)細(xì)胞凋亡分析結(jié)果如圖5所示, 隨著水提物濃度的升高, 細(xì)胞早期凋亡率升高。低劑量組(0.5和2.5 mg/mL)與對(duì)照組的凋亡比沒有顯著性差異, 5.0和10.0 mg/mL濃度SAE組凋亡率為(22.55±4.35)%和(55.03±2.76)%, SMAE組的凋亡率分別為(32.67±5.79)%和(37.11±8.57)%, 均與對(duì)照組相比有極顯著差異(P<0.01)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 水提物繼續(xù)培養(yǎng)24h會(huì)誘導(dǎo)草魚的肝臟細(xì)胞發(fā)生凋亡, 凋亡細(xì)胞數(shù)量呈劑量依賴性增加。

圖5 SAE和SMAE對(duì)草魚原代肝細(xì)胞凋亡的影響Fig. 5 Effects of SAE and SMAE on the apoptosis of primary hepatocytes in grass carp

2.6 SAE和SMAE誘導(dǎo)肝細(xì)胞線粒體損傷

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示(表2), 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組(P<0.01), SAE和SMAE (5.0和10.0 mg/mL)培養(yǎng)肝細(xì)胞24h后, 可升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平。線粒體通過內(nèi)在途徑在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用, 細(xì)胞膜電位的改變是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵, 與對(duì)照組相比, SAE組(2.5、5.0和10.0 mg/mL)和SMAE組(5.0和10.0 mg/mL) MMP較對(duì)照組有不同程度的下降(P<0.05, 表3)。

表2 SAE和SMAE對(duì)原代肝細(xì)胞活性氧(ROS)形成的影響Tab. 2 Effects of SAE and SMAE on ROS formation in primary hepatocytes

表3 SAE和SMAE對(duì)原代肝細(xì)胞線粒體膜電位(MMP) 的影響Tab. 3 Effects of SAE and SMAE on MMP in primary hepatocytes

2.7 基因差異表達(dá)和通路分析

對(duì)照(Con)組、5.0 mg/mL濃度下的 SAE組和SMAE 組細(xì)胞培養(yǎng)24h后肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中對(duì)照組和處理組分別采用TPM(Transcripts Per Million reads)計(jì)算方法計(jì)算各個(gè)基因表達(dá)量, 默認(rèn)參數(shù): p-adjust<0.05、|log2FC| ≥1, 即具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 對(duì)部分DEGs進(jìn)行整理結(jié)果見表4。如圖6所示, SAE組與Con組相比共有上調(diào)基因337個(gè), 下調(diào)基因532個(gè);SMAE組與Con組相比共有上調(diào)基因440個(gè), 下調(diào)基因1011個(gè)。將篩選所得的DEGs分別從生物學(xué)過程(Biological process, BP)、分子功能(Molecular function, MF)和細(xì)胞成分(Cellular component, CC) 三個(gè)層面進(jìn)行GO功能富集, 并采用KEGG通路分析研究DEGs可能參與調(diào)控的相關(guān)信號(hào)通路。

圖6 SAE和SMAE引起原代肝細(xì)胞差異表達(dá)火山圖和各組DEGs韋恩圖Fig. 6 SAE and SMAE induced differential expression of primary hepatocytes in volcanic and DEGs Venn diagrams

表4 差異表達(dá)基因列表Tab. 4 List of differentially expressed genes

由圖7可見, Con組與SAE組相比, 可顯著富集TOP15條途徑, BP Term包括蛋白水解負(fù)調(diào)控(Negative regulation of proteolysis)、水解酶活性的負(fù)調(diào)控(Negative regulation of hydrolase activity)、肽酶活性的負(fù)調(diào)控(Negative regulation of peptidase activity)、細(xì)胞內(nèi)脂類代謝(Cellular lipid metabolic process)和類異戊二烯代謝過程(Isoprenoid metabolic process)等。CC Term主要與細(xì)胞外空隙(Extracellular space)有關(guān)。所富集到的MF Term主要和肽酶抑制劑活性(Peptidase inhibitor activity)、肽鏈內(nèi)切酶調(diào)節(jié)活性(Endopeptidase regulator activity)和肽酶調(diào)節(jié)活性(Peptidase regulator activity)有關(guān)。Con組與SMAE組相比, 主要涉及氧化還原過程(Oxidation-reduction process)、催化活性的負(fù)調(diào)節(jié)(Negative regulation of catalytic activity)、內(nèi)肽酶活性的負(fù)調(diào)控(Negative regulation of endopeptidase acti-vity)、水解酶活性的負(fù)調(diào)控(Negative regulation of hydrolase activity)等BP Term。在CC Term中主要與細(xì)胞外區(qū)域部分(Extracellular region part)有關(guān),在MF Term中, DEGs主要集中在氧化還原酶活性(Oxidoreductase activity)、酶抑制劑的活性(Enzyme inhibitor activity)及肽酶調(diào)節(jié)。

圖7 SAE和SMAE引起原代肝細(xì)胞DEGs GO富集分析Fig. 7 SAE and SMAE caused DEGs GO enrichment in primary hepatocytes

對(duì)KEGG通路富集分析, DEGs可顯著富集到20條信號(hào)通路。如圖8所示, 影響最大的是補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián), 其次為甾體生物合成、PPAR信號(hào)通路、細(xì)胞因子的相互作用、脂肪消化和吸收、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、萜類骨架生物合成和甘油三酯代謝等, 這些通路可能作為SAE引起肝細(xì)胞損傷的發(fā)生機(jī)制。SMAE組肝細(xì)胞顯著富集到30條信號(hào)通路, 影響最大的是補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián), 其次是細(xì)胞因子的相互作用、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、甘油三酯代謝、NF-κB信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、谷胱甘肽代謝、糖酵解/糖異生和細(xì)胞色素P450等。這些結(jié)果提示, SAE可能更多的是通過誘導(dǎo)蛋白質(zhì)與脂質(zhì)代謝異常, 參與氧化應(yīng)激過程, 進(jìn)一步導(dǎo)致肝細(xì)胞炎癥和壞死的發(fā)生。

圖8 SAE和SMAE引起原代肝細(xì)胞DEGs KEGG富集分析Fig. 8 SAE and SMAE caused DEGs KEGG enrichment in primary hepatocytes

3 討論

3.1 SAE、SMAE誘導(dǎo)原代肝細(xì)胞線粒體途徑凋亡

肝細(xì)胞凋亡是肝損傷和癌變的機(jī)制之一。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑很多, 線粒體凋亡途徑是脊椎動(dòng)物的主要生理凋亡途徑[22]。線粒體是細(xì)胞能量代謝中心, 線粒體動(dòng)力學(xué)被認(rèn)為在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面具有重要的生理作用[23]。線粒體結(jié)構(gòu)異常和功能障礙是壞死的基本特性, 伴隨著線粒體膜通透性的改變, MMP的降低, Bcl-2家族中的促凋亡蛋白成員發(fā)生蛋白質(zhì)的加工修飾, 易位到線粒體的外膜上, 引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng), 最終觸發(fā)細(xì)胞凋亡[24]。

SAE和SMAE 能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變,結(jié)合Hoechst染色結(jié)果, 包括細(xì)胞核凝結(jié)和核破碎,光密度稀疏, 線粒體數(shù)量減少和腫脹現(xiàn)象明顯, 出現(xiàn)大量脂滴堆積等。SAE和SMAE能降低肝細(xì)胞線粒體膜電位。與對(duì)照組相比, 各濃度水平SAE組細(xì)胞MMP水平分別為74.02%、40.34%、21.43%和9.87%, 而SMAE組中MMP水平僅略有升高。線粒體內(nèi)膜的通透性屏障造成ATP合成功能障礙, 影響細(xì)胞活力。糖代謝過程與細(xì)胞能量供給密切相關(guān),在糖酵解過程、三羧酸循環(huán)通路中, 葡萄糖激酶(GCK)表達(dá)上調(diào), 丙酮酸脫氫酶基因(PDHA)、果糖-6-磷酸(G6PC)、乙醇脫氫酶(ADH)、果糖-1, 6-二磷酸(FBP)、絲氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)移酶(AGXT)表達(dá)受到抑制, 不僅糖的合成、降解受到了阻礙, 而且能量供應(yīng)出現(xiàn)障礙。其中AGXT在線粒體和過氧化物酶體中具有雙重代謝調(diào)節(jié)作用[25]。

在大西洋鮭的日糧中豆粕含量的升高會(huì)引起腸上皮細(xì)胞凋亡數(shù)量增加, 遠(yuǎn)端腸體指數(shù)下降[10],及形態(tài)學(xué)的改變[26], 同樣在Wistar大鼠的研究中發(fā)現(xiàn), 飼喂過生大豆的鼠小腸黏膜內(nèi)腸上皮細(xì)胞損傷最高[27]。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測10.0 mg/mL SAE組肝細(xì)胞凋亡百分比, 達(dá)到(55.03±2.76)%, SMAE組的凋亡百分比達(dá)到(37.11±8.57)%, 與對(duì)照組相比均有顯著差異(P<0.01), Bcl-2基因顯著下調(diào), 表明水提物能夠引起原代肝細(xì)胞凋亡。

3.2 SAE和SMAE引起原代肝細(xì)胞氧化損傷

ROS是指所有需氧細(xì)胞在一系列代謝反應(yīng)和各種刺激物作用下產(chǎn)生的副產(chǎn)物[28]。線粒體被認(rèn)為是ROS產(chǎn)生的主要場所, 這是在有氧條件下內(nèi)源性的、連續(xù)的生理過程。線粒體呼吸鏈?zhǔn)怯沙蹶庪x子歧化產(chǎn)生ROS的主要來源, 同時(shí)也是ROS破壞作用的重要靶點(diǎn)[29]。

在本研究中, SAE和SMAE在5.0 mg/mL濃度下誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS過量產(chǎn)生, 說明草魚原代肝細(xì)胞表現(xiàn)出氧化應(yīng)激。通過對(duì)細(xì)胞相關(guān)酶活力檢測發(fā)現(xiàn),細(xì)胞上清液中LDH和MDA水平明顯升高, 細(xì)胞內(nèi)液中抗氧化酶(SOD和GSH)活性明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01), 反映肝細(xì)胞膜損傷, 導(dǎo)致脂質(zhì)氧化, 抗氧化酶系統(tǒng)受損, 促進(jìn)細(xì)胞炎性反應(yīng)。肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示細(xì)胞色素P450相關(guān)基因(CYP24A1、CYP4B1、CYP4V2、CYP2K和CYP2U1)參與外源性物質(zhì)的氧化代謝, 參與NADPH依賴的電子傳遞途徑[30]。谷胱甘肽過氧化物酶以還原型谷胱甘肽為電子供體底物, 催化過氧化氫或有機(jī)過氧化物還原成水或相應(yīng)的醇[31], 谷胱甘肽過氧化物酶(Gpx)基因表達(dá)上調(diào), 超氧化物歧化酶(SOD3)基因表達(dá)水平顯著下降, 表明SAE和SMAE能致肝細(xì)胞氧化損傷。

3.3 豆粕中對(duì)肝細(xì)胞損傷的物質(zhì)來自于大豆

豆制品作為重要的膳食蛋白來源, 在人類和動(dòng)物中得到了廣泛的應(yīng)用。但是, 大豆中生物活性物質(zhì)的高含量使它成為一種需要關(guān)注的膳食補(bǔ)充劑[32]。這些物質(zhì)在魚類體內(nèi)不能正常代謝, 可引起一系列主要與消化生理、健康和代謝相關(guān)的作用, 導(dǎo)致腸黏膜屏障受損, 增加物質(zhì)對(duì)肝臟的通透性, 進(jìn)而引起代謝和免疫反應(yīng)[33]。有研究表明, 在30%大豆?fàn)I養(yǎng)脅迫下, 通過大西洋鮭的轉(zhuǎn)錄組水平發(fā)現(xiàn), 補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)和肉堿O-棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶基因顯著上調(diào), 通過合成輔酶A參與脂肪酸的氧化, 肝臟接近酮體狀態(tài), 表明大豆誘導(dǎo)的營養(yǎng)脅迫對(duì)魚類肝臟反應(yīng)的不利影響[18]。

本研究中轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示, 對(duì)肝細(xì)胞影響最大的是補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。白細(xì)胞介素IL-12由p35和p40亞基組成, 促進(jìn)細(xì)胞免疫和炎癥反應(yīng), 在本研究中, Toll樣受體1(TLR1)基因和IL12A基因表達(dá)上調(diào)。當(dāng)肝細(xì)胞受到水提物中危害成分損傷刺激后, 觸發(fā)TLR1介導(dǎo)的獲得性免疫, 導(dǎo)致大量的炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生, 同時(shí)伴隨著中性粒細(xì)胞激活(CXCR4和CCR9基因上調(diào)), 分泌產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì), 基質(zhì)金屬蛋白酶9 (MMP9)表達(dá)上調(diào), 降解細(xì)胞外基質(zhì),引起肝細(xì)胞免疫反應(yīng), 加重肝細(xì)胞損傷。這些結(jié)果表明, 豆粕能夠?qū)︳~類免疫機(jī)能和生理健康產(chǎn)生負(fù)面影響。

Gupta等[34]研究發(fā)現(xiàn)0.4%(w/v)大豆蛋白水解物(60%肽/氨基酸和20%碳水化合物)能夠促進(jìn)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞生長。而大豆異黃酮染料木素促進(jìn)人和大鼠乳腺上皮細(xì)胞和仔豬肝細(xì)胞凋亡[35,36]。大豆凝集素能夠降低豬腸柱狀上皮細(xì)胞整合素的表達(dá), 從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[37]。有研究表明, 大豆中的Glyceollins能夠通過MMP去極化引起小鼠肝癌細(xì)胞凋亡[38]。大豆作為一個(gè)復(fù)雜的組成系統(tǒng), 其對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞的影響尚未得到全面的綜述。通過化學(xué)成分分析結(jié)果顯示, SMAE的可溶性糖含量下降, 小肽含量升高, 這都與加工相關(guān), 在脫脂熱處理的過程中可能發(fā)生了一些成分的改變(化學(xué)修飾反應(yīng))[39]。水提物中含有引起草魚肝細(xì)胞氧化損傷的物質(zhì), 且這類物質(zhì)來自于大豆自身的組成物質(zhì)。SAE和SMAE 引起的肝細(xì)胞損傷可能有多種途徑, 試驗(yàn)結(jié)果表明, ROS介導(dǎo)的線粒體可能是大豆誘導(dǎo)原代肝細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的重要途徑之一。

4 結(jié)論

本文研究結(jié)果表明, 在大豆和豆粕的水提物中存在有對(duì)草魚原代離體肝細(xì)胞損傷的物質(zhì), 且豆粕水提物中損傷物質(zhì)是來源于大豆而不是大豆生產(chǎn)豆油和豆粕的過程中。氧化損傷為主要作用方式,能夠影響肝細(xì)胞核與線粒體的結(jié)構(gòu)和功能, 損傷作用的路徑為: 對(duì)細(xì)胞代謝產(chǎn)生干擾, 細(xì)胞內(nèi)ROS增加、抗氧化能力下降, 細(xì)胞核與線粒體結(jié)構(gòu)和功能改變, 并導(dǎo)致細(xì)胞活力顯著下降, 最終引起細(xì)胞凋亡。雖然本文分析了部分營養(yǎng)物質(zhì)成分和含量, 但具體的損傷物質(zhì)種類還有待分析和鑒定, 這是一個(gè)更為細(xì)致和長期的研究工作。