劉 林 周 穎 阮記明 梁惜梅 林長高 何 麗 隗黎麗

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 南昌 330045)

腫瘤蛋白p53誘導(dǎo)核蛋白1(Tumor protein 53-induced nuclear protein 1,TP53INP1)是p53的靶基因, 與腫瘤發(fā)生和進展有密切關(guān)系[1]。TP53INP1在1990年末先后被3個不同的實驗室獨立鑒定并報道,最早是在小鼠胸腺中發(fā)現(xiàn), 當(dāng)時命名為胸腺表達酸性蛋白(Thymus-expressed acidic protein,TEAP)[2],隨后Tomasini等[3]在患胰腺炎的小鼠(Mus musculus)中發(fā)現(xiàn)該蛋白, 并將其命名為應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白(Stress-induced protein,SIP), 同年, Okamura等[4]發(fā)現(xiàn)p53在細胞損傷反應(yīng)中可誘導(dǎo)一種蛋白大量表達,并將其命名為p53依賴損傷誘導(dǎo)核蛋白1(p53-dependent damage-inducible nuclear protein 1,p53DINP1)。2002年, 人類基因組基因命名委員會提出將TEAP、SIP和p53DINP1統(tǒng)一命名為TP53INP1。

盡管魚類TP53INP1基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中已有登錄, 但沒有相關(guān)的文章對其分子結(jié)構(gòu)、組織分布及多克隆抗體等進行研究, 尤其是缺少環(huán)境污染物對其表達影響的相關(guān)研究。微囊藻毒素(Microcystins, MCs)是淡水富營養(yǎng)化過程中最常見的藍藻毒素, 在中國、美國及其他許多國家的水體中都檢測到不同水平的MCs污染[5—7]。MCs結(jié)構(gòu)的變體多達100余種, 其中微囊藻毒素-LR (Microcystin-LR, MC-LR)是目前研究最多、毒性最強、危害最嚴(yán)重的一種MCs[8]。目前, 已有大量研究表明, MCs可能是潛在的致癌物[9], 越來越多的流行病學(xué)研究也表明, 飲用水中MC-LR的污染與人類肝癌的發(fā)生密切相關(guān)[10]。根據(jù)報道可知MCs促進腫瘤的機制與抑制蛋白磷酸酶(PP1和PP2A)有關(guān)[11], 而原癌基因的過表達和抑癌基因的抑制可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展也有關(guān)[9], TP53INP1作為一個與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系的蛋白, 研究MC-LR對TP53INP1蛋白表達的影響將有助于進一步提高對MC-LR毒性及其潛在的致癌性的認(rèn)識[12]。

本研究在前期對草魚(Ctenopharygodon idella)轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上[13], 采用cDNA末端快速克隆技術(shù)(RACE), 對草魚TP53INP1基因進行克隆, 構(gòu)建pET32a-TP53INP1原核表達載體, 表達TP53INP1融合蛋白, 同時, 制備了草魚TP53INP1蛋白多克隆抗體, 并采用Western blot研究了草魚TP53INP1蛋白在MC-LR脅迫下的表達變化, 以期為進一步研究TP53INP1蛋白在MC-LR致魚類毒性機制中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

間氨基苯甲酸乙酯甲烷磺酸鹽(MS-222)購于Sigma公司, RNA提取試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品,用于RACE擴增的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒Super SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit及進行RACE擴增的SMARTTMcDNA Amplication Kit試劑盒購于Clontech公司, 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit及熒光定量PCR的SYBR Green Real-time PCR Master Mix購于Promeaga公司, 限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和XhoⅠ購自NEB公司, 凝膠純化回收試劑盒、Taq酶、T4 DNA連接酶、Maker等購自TaKaRa公司, Bradford蛋白定量試劑盒、SDSPAGE所需試劑及組織蛋白抽提試劑盒等購自北京索萊寶, PVDF膜(0.22 μm)為Millipore公司產(chǎn)品;HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購自生工生物工程有限公司,GAPDH(兔抗)購于武漢賽維爾生物科技有限公司,其他試劑如氯仿、無水乙醇和異丙醇等為中國國藥分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

草魚TP53INP1基因cDNA全長的克隆根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)獲得的草魚TP53INP1基因序列,利用Primer Premier 5.0設(shè)計中間片段擴增引物(TP53INP1-MF: 5′-ATGTTCCAGAGGTTCACC-3′,TP53INP1-MR: 5′-TCAGTAGTTGTACTGCCT-3′)。分離健康草魚肝臟, 采用Super SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA模板,隨后用該模板進行PCR擴增, 進行膠回收和測序,比對分析獲得草魚TP53INP1中間序列。再根據(jù)這一序列設(shè)計5′RACE擴增引物(RC5-1: 5′-GGCC TTCGCTAGATAA-3′, RC5-2: 5′-GCCTTGCACC TAGATA-3′, RC5-3: 5′-ATCCACTCATCGTCC TCC-3′)和3′RACE擴增引物(RC3-1: 5′-GAGCAG ACCAAGAACGTCCGCC-3′, RC3-2: 5′-CTGTC TCGCAACGCCCTTCGCC-3′), 按照SMARTTMcDNA Amplication Kit說明書推薦的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進行5′ RACE和3′RACE擴增, 分別獲得5′和3′末端序列, 再與中間序列拼接得到全長cDNA序列。

草魚TP53INP1基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建生物信息學(xué)在線工具分析草魚TP53INP1基因。在NCBI(ORF finder, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)上查找開放閱讀框, 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)在http://us.expasy.org/tools/protparam.Html上進行分析, 信號肽預(yù)測和跨膜結(jié)構(gòu)分別在http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1和http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/上進行分析, 結(jié)構(gòu)域在http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search上進行分析, PEST序列在http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/epestfind上進行分析。系統(tǒng)發(fā)育樹則采用Mega7.0軟件的NJ法進行構(gòu)建, 在建樹之前氨基酸序列的比對用ClustalW1.81軟件。

草魚TP53INP1基因的組織表達特征分析分別取5尾健康草魚[體重: (650±131.53) g; 體長: (38.24±2.53) cm; 約24月齡], 通過尾靜脈采血, 分離肝臟、脾臟、腸道、體腎、頭腎、心臟、皮膚、肌肉、鰓和腦提取RNA, 采用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit進行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)獲得的草魚TP53INP1基因設(shè)計熒光定量引物(F: 5′-TCAAC GAGAAGGAGGAGGACGA-3′, R: 5′-CAGAGAG GAGCAGGAGGAGCAG-3′), 使用quantitative Realtime PCR (qRT-PCR)方法檢測草魚TP53INP1在不同組織中的表達水平。qRT-PCR采用CFX96 Touch?Real-Time PCR Detection System, 15 μL反應(yīng)體系包括: 7.5 μL SYBR Green Real-time PCR Master Mix,2.0 μL cDNA模板(10倍稀釋), 上下游引物各0.3 μL(10 μmol/L)和4.9 μL ddH2O。反應(yīng)程序為: 95℃變性3min; 95℃ 10s, 58℃ 15s, 72℃ 20s, 40個循環(huán)后,72℃延伸5min。以草魚β-actin(F: 5′-CACTGTGC CCATCTACGA-3′, R: 5′-CCATCTCCTGCTC GAAGTC-3′)作為內(nèi)參基因進行校正, 采用2?ΔΔCt法計算TP53INP1基因的相對表達量。

草魚TP53INP1原核表達載體構(gòu)建及多克隆抗體制備選擇重組表達蛋白表達載體pET-32a,對載體和TP53INP1的序列的限制性酶切位點進行分析, 選擇EcoR Ⅰ和XhoⅠ作為載體構(gòu)建的連接位點, 在TP53INP1的141—242aa這段序列內(nèi)設(shè)計添加EcoR Ⅰ和XhoⅠ限制性酶切位點(下劃線標(biāo)出)的引物 (F: 5′-CGGAATTCAGCCCTCGTCAACGAC CA-3′, R: 5′-CCGCTCGAGGTAGTTGTACTGCC TCTG-3′)。目的片段與pMD18-T連接, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α, 隨機挑選菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司測序驗證。提取測序正確的pMD18-TTP53INP1和pET-32a載體質(zhì)粒, 分別用EcoR Ⅰ和XhoⅠ雙酶切, 瓊脂糖凝膠電泳檢測, 酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后, 將TP53INP1連接至pET-32a載體, 將連接產(chǎn)物pET-32a-TP53INP1轉(zhuǎn)化至BL21中, 挑選陽性菌落再次測序驗證, 獲得pET-32a-TP53INP1原核表達載體。將測序正確的菌液繼續(xù)培養(yǎng), 加入0.8 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosidem, IPTG)在37℃誘導(dǎo)4h, 將誘導(dǎo)完的菌液用超聲波破碎, 分離上清與沉淀, 進行SDS-PAGE分析, 然后將從上清獲得的蛋白進行純化。隨后通過皮下注射純化的重組蛋白免疫新西蘭兔子, 共免疫4次(分別于第1、第12、第26和第40天注射), 兔子于第一次免疫76d后采血獲得抗血清, 抗血清用pET-32a-TP53INP1作為抗原親和純化, 隨后將獲得的抗體按1∶1000稀釋進行抗體特異性檢測分析, 剩余的抗體置于–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

微囊藻毒素對草魚TP53INP1蛋白的影響購買的健康草魚[體重: (22.13±2.17) g; 體長: (12.09±1.33) cm, 約5月齡] 在實驗室暫養(yǎng)2周后分組注射MC-LR, 劑量分別為25、75和100 μg MC-LR/kg BW, 對照組每尾草魚經(jīng)腹腔注射等量的0.80%的生理鹽水。在注射MC-LR 96h后, 分別從實驗組和對照組中各取3尾魚分離肝臟提取蛋白。蛋白樣品經(jīng)12% SDS-PAGE電泳后, 采用電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore)上, 于5%的脫脂牛奶中封閉2h。加入1∶1000稀釋的一抗[上述制備的TP53INP1抗體或內(nèi)參兔多抗GAPDH(武漢博士德生物工程有限公司)], 4℃孵育過夜。次日將膜取出后, 用TBST(武漢塞維爾生物科技有限公司)洗滌3次(每次10min), 然后在1∶3000倍稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗兔的二抗 (武漢塞維爾生物科技有限公司) 中孵育, 再次用TBST洗滌3次(每次10min), 采用ELC(武漢塞維爾生物科技有限公司)化學(xué)發(fā)光法檢測并拍照。采用AlphaEase FC軟件對蛋白條帶進行定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 并采用One-way ANOVA (SPSS 16.0)進行分析, 統(tǒng)計學(xué)顯著性水平設(shè)定P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 草魚TP53INP1基因全長cDNA序列特征分析

克隆獲得草魚TP53INP1基因全長1154 bp, 包括5′非編碼區(qū)和3′非編碼區(qū), 分別為179和216 bp, 開放閱讀框(Open reading frame, ORF)為759 bp, 其在GenBank上的登錄號為MG797689。對其編碼氨基酸序列預(yù)測分析, 發(fā)現(xiàn)草魚TP53INP1編碼252個氨基酸, 屬于β類型, 分子量為27.72 kD, 理論等電點為5.13。采用signalP4.1和InterPro在線分析表明草魚TP53INP1蛋白質(zhì)沒有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)。使用Epestfind在線軟件預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)草魚TP53INP1蛋白存在4個PEST結(jié)構(gòu)(Poor), 得分低于閾值(5.0), 分別位于14—39、53—79、101—125和125—142aa處。

2.2 草魚TP53INP1氨基酸同源性與系統(tǒng)進化分析

草魚TP53INP1氨基酸序列與鯉形目鯉科的鱇浪白魚(Anabarilius grahami)相似性和一致性分別達到了99%和98%, 與斑馬魚(Danio rerio)的相似性和一致性分別達到了93%和96%, 與人(Homo sapiens)和小鼠TP53INP1 α型的相似性分別達到了63%和58%、與β型的相似性分別為59%和55%。

構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹結(jié)果(圖1)顯示, 草魚TP53INP1與魚類的TP53INP1的β類型聚為一大支, 哺乳動物TP53INP1的α和β類型聚為一支。其中, 草魚TP53INP1蛋白與鱇浪白魚的TP53INP1親緣關(guān)系最近。

圖1 TP53INP1的系統(tǒng)進化樹Fig. 1 Phylogenetic analysis of TP53INP1

2.3 草魚TP53INP1基因組織分布特征分析

qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)TP53INP1基因在所有檢測的組織中均有表達(圖2), 在肝臟中的表達量最為豐富, 其次為血液和腸道等, 在頭腎中表達量相對較低。TP53INP1基因在肝臟中的表達量相對于頭腎表達量的倍數(shù)為27.83, 顯著高于在頭腎中的表達量(P<0.05), 此外,TP53INP1基因在血液(22.04倍)、腸道(20.81倍)、心臟(16.56倍)、肌肉(16.50倍)和鰓(13.64倍)中的表達量也顯著高于在頭腎中的表達量(P<0.05)。

圖2 草魚TP53INP1基因在不同組織中的表達Fig. 2 The expression of TP53INP1 gene in different tissues of grass carp

2.4 草魚TP53INP1融合蛋白的表達與純化

SDS-PASGE檢測分析, 發(fā)現(xiàn)在39 kD左右位置產(chǎn)生目的蛋白條帶(圖3)。再通過可溶性分析, 發(fā)現(xiàn)該蛋白在上清中表達, 也可以包涵體的形式存在。上清經(jīng)過標(biāo)簽純化后, 獲得的蛋白濃度為3 mg/mL。

圖3 草魚TP53INP1重組蛋白的表達及純化Fig. 3 Expression and purification of the recombinant TP53INP1 in grass carp

2.5 草魚TP53INP1多克隆抗體的免疫鑒定

采血收集血清, 獲得草魚TP53INP1的多克隆抗體，進行Western blot分析, 得到1條約39 kD的條帶與預(yù)期蛋白大小一致, 表明本研究獲得的草魚TP53INP1多克隆抗體具有一定的特異性(圖4)。

圖4 Western blot檢測草魚TP53INP1多克隆抗體的特異性Fig. 4 The specificity of anti-TP53INP1 polyclonal antibody by western blot

2.6 微囊藻毒素-LR對草魚肝臟TP53INP1蛋白表達的影響

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)草魚TP53INP1蛋白在100 μg MC-LR/kg BW劑量組中顯著抑制, 其他劑量組也有不同程度的抑制(圖5A)。以AlphaEase FC軟件對蛋白條帶進行分析發(fā)現(xiàn), 對照組、25 μg MC-LR/kg BW劑量組、75 μg MC-LR/kg BW劑量組和100 μg MC-LR/kg BW劑量組中TP53INP1蛋白相對于內(nèi)參蛋白GAPDH的表達量分別為0.59倍、0.57倍、0.44倍和0.07倍, 其中, TP53INP1蛋白在100 μg MC-LR/kg BW劑量組中的表達相對于對照組中的表達差異顯著(P<0.05; 圖5B)。

圖5 微囊藻毒素-LR對草魚肝臟TP53INP1蛋白表達的影響Fig. 5 The effect of MC-LR on the expression of liver TP53INP1 protein from grass carp

3 討論

TP53INP1由Okamura等[2]在小鼠的胸腺中首次發(fā)現(xiàn)并報道后, 其他學(xué)者進一步研究發(fā)現(xiàn),TP53INP1基因被選擇性剪切后, 有2種轉(zhuǎn)錄本, 可編碼2種不同蛋白異構(gòu)體, 分別為TP53INP1α和TP53INP1β(分子量分別為18和27 kD)[3]。根據(jù)結(jié)構(gòu)和分子量分析可知, 本研究獲得的TP53INP1基因?qū)儆讦骂愋?。但有研究表? α和β類型TP53INP1在功能上差別不大[14]。TP53INP1氨基末端部分包含一個異常的PEST序列, 具有短壽命的蛋白質(zhì)的特征[3,4]。PEST序列是指富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)殘基。根據(jù)PEST序列假說, 含有該序列的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)可能通過由蛋白體或鈣蛋白酶介導(dǎo)的途徑進行降解, 因此胞內(nèi)半衰期較短[15]。采用Epestfind在線軟件預(yù)測時, 有效的PEST結(jié)構(gòu)依據(jù)分值高低可分為PEST motif(Symbols)、Potential(+++++)和Poor(00000)三類, 草魚TP53INP1的PEST序列的預(yù)測結(jié)果顯示其存在4個Poor PEST, 即不存在明顯的PEST結(jié)構(gòu), 這與哺乳動物的TP53INP1的特征不太一致[3,4]。但與Ex-PASy在線序列分析工具(http://www.expasy. ch/tools/protparam.html) 分析的結(jié)果比較吻合, 其預(yù)測結(jié)果顯示TP53INP1在哺乳動物中的半衰期為30h, 在酵母和大腸桿菌中的半衰期分布大于20h和10h, 不穩(wěn)定指數(shù)為66.33, 這說明TP53INP1在草魚中具有穩(wěn)定的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。

分析TP53INP1在不同組織中的分布特征發(fā)現(xiàn),該基因在草魚中廣泛表達, 在肝臟、血液、腸道、心臟、肌肉和鰓等組織中表達比較豐富, 而在頭腎等其他組織中表達較低。這與TP53INP1在哺乳動物中的組織表達分布不太一致, Tomasini等[3]研究發(fā)現(xiàn)TP53INP1基因在健康大鼠胸腺、心臟和睪丸表達豐富, 而在胰腺和胃中表達低, 這可能與不同的物種有關(guān)。

TP53INP1蛋白在腫瘤中的作用與腫瘤類型相關(guān), 其既能促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展, 也能抑制腫瘤細胞的增殖[1]。但更多的研究證明TP53INP1是一個抑癌蛋白, 可抑制腫瘤的發(fā)展, 如有研究發(fā)現(xiàn)TP53INP1蛋白表達缺失可引起其他促腫瘤過程,如肝臟細胞中誘導(dǎo)上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型和腫瘤干細胞[16], 因此, TP53INP1蛋白的表達在腫瘤細胞中可能發(fā)揮腫瘤抑制功能。TP53INP1蛋白在大多數(shù)腫瘤組織中表達會下調(diào), 如在人類的食管癌[17]和胃癌[18]等中表達降低。最近有研究表明, TP53INP1蛋白在人類的肝癌組織中表達也明顯下降, 并建議將TP53INP1蛋白作為診斷肝癌的一個指標(biāo)[1]。在我們先前對斑馬魚的研究發(fā)現(xiàn), TP53INP1蛋白在MCLR染毒6h后, 其在肝臟中表達明顯上調(diào), 隨著時間的延長, 其表達逐漸下降[19]。本研究通過實驗室制備的TP53INP1蛋白多克隆抗體, 采用Western blot檢測分析經(jīng)MC-LR誘導(dǎo)96h后的草魚肝臟蛋白, 發(fā)現(xiàn)TP53INP1蛋白在25和75 μg MC-LR/kg BW劑量組表達變化不明顯, 但在100 μg MC-LR/kg BW劑量組中的草魚肝臟TP53INP1蛋白明顯下調(diào), 這與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果也是一致的(未發(fā)表數(shù)據(jù)), 但TP53INP1蛋白是否與MC-LR促進了肝癌的發(fā)生從而導(dǎo)致其表達下降還需要進一步的實驗進行驗證。研究抑癌基因表達的變化, 有助于提高對MCLR毒性及其潛在的致癌性的認(rèn)識[12], 因此, 今后對TP53INP1蛋白與MC-LR誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生的關(guān)系及調(diào)控機制還需進一步研究。