吳明晗 朱葆華 張瑞豪 王路路 孫暢澤 潘克厚,

(1. 中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室, 青島 266003; 2. 青島海洋科學與技術國家實驗室,海洋漁業(yè)科學與食物產出過程功能實驗室, 青島 266237)

目前, 有關硅藻的研究受到廣泛關注。一方面,硅藻作為海洋生態(tài)系統(tǒng)重要的初級生產者, 對物質循環(huán)和能量流動起著不可替代的作用；另一方面,大量研究證實開發(fā)利用硅藻中高附加值物質的可行性[1]。三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)因其具有適應性強、繁殖周期短、光合效率高、遺傳轉化體系成熟和完成了全基因組測序等特性, 是實驗室常用的模式硅藻, 是巖藻黃素、二十碳五烯酸(EPA)和金藻昆布多糖等生物活性物質的潛在生產者[2]。

金藻昆布多糖是三角褐指藻的主要儲存性多糖, 由葡萄糖通過β-1,3糖苷鍵主鏈和少量的β-1,6糖苷鍵支鏈連接而成[3], 是天然抗氧化物的一種, 具有很強的清除自由基活性且對人體無副作用[4,5], 因其可以抑制癌細胞增殖、有明顯的抗腫瘤活性和增強機體免疫力等[6,7]而逐步受到國內外研究者的廣泛關注。在其合成過程中, 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase, UGPase)是關鍵的限速酶, 抑制UGP基因表達會使金藻昆布多糖的合成減少, 光合作用固定的碳更多轉向脂質的合成[8]。研究表明, 多種環(huán)境因素可影響UGP基因的表達。Ciereszko等[9]報道, 擬南芥(Arabidopsis thaliana)在磷限制情況下, UGP基因的表達水平顯著上調, UGPase活性顯著提高, 而石紅萍[10]在三角褐指藻中的研究卻得到了相反的結果。可見, 相同的環(huán)境因子對UGP基因表達的影響, 不同的研究者在不同物種中可能會得出不同的結論。此外, 溫度、光照、鹽度和Cd2+等也對UGP基因表達產生不同程度的影響[10—13]。

Cd2+作為主要金屬工業(yè)污染物之一, 其濃度超過一定范圍具有抑制生長發(fā)育、影響營養(yǎng)物質的吸收與分配、擾亂新陳代謝的毒性。但已有研究表明, 一些高等植物和微藻可以耐受一定濃度的Cd2+, 將其轉化為無毒的形態(tài), 作為Cd2+污染的指示生物。目前, 我國國家海水水質標準(GB 3097-1997)中第四類水質標準的Cd2+含量≤0.01 mg/L(約為0.09 μmol/L)。三角褐指藻對Cd2+具有很強的耐受性, 0.027 mmol/L以上濃度Cd2+會顯著抑制該藻生長, 半最大效應濃度(EC50)可達0.12 mmol/L[14], 是探究Cd2+對植物生長及特定酶基因表達影響的優(yōu)質材料。另外, Repetto等[11]發(fā)現, 高等植物豌豆(Pisum sativum)根經0.89 mmol/L Cd2+處理后, UGPase蛋白含量增加。Chen等[15]報道, 在Cd2+脅迫下海濱雀稗(Paspalum vaginatum)UGP基因克隆通過外源表達提高了酵母對Cd2+的耐受性。然而, 關于UGPase如何提高植物對Cd2+的耐受性及該酶基因受Cd2+調控的表達模式還知之甚少, 需要進一步研究。

綜上, 本文旨在通過研究不同濃度Cd2+對三角褐指藻生長、最大光能轉化效率(Fv/Fm)、實際光能轉化效率(Yield)、UGP基因轉錄水平、UGPase活性和金藻昆布多糖含量的影響, 確定該藻UGP基因在不同濃度Cd2+處理下的表達模式, 為研究Cd2+影響植物生長及UGP基因表達和金藻昆布多糖合成提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)

藻種: 三角揭指藻由中國海洋大學微藻種質庫提供, 編號PT1。

以氯化鉻(CdCl2)作為鎘源, 不加 CdCl2作為對照組, 預實驗后設置實驗組濃度為0.1、0.5、1、2和5 μmol/L CdCl2。在接種時, 不同處理組藻細胞密度相同, 將初始OD750設置為0.1, 每個濃度3個平行, 在光照強度75 μmolphotons/(m2·s), 光照周期12L∶12D, 溫度(20±1)℃的條件下培養(yǎng), 每天搖瓶3次, 培養(yǎng)至指數生長期。

1.2 生長曲線繪制及生物量測定

在培養(yǎng)過程中, 每隔24h定時取樣, 通過紫外分光光度計(Hitachi, U-3310)檢測藻液在波長為750 nm處的吸光度[16](A750), 以反映生長狀況并繪制生長曲線。

培養(yǎng)至指數生長末期時, 離心(6000×g, 5min)收集藻液, 通過真空冷凍干燥機(Christ, ALPHA 1-4LD)冷凍干燥, 稱量藻粉質量, 計算生物量。

1.3 葉綠素熒光參數測定

使用Water-PAM水樣葉綠索熒光儀(Germany,Walz)進行測定。取2 mL藻液進行15min暗處理,用 0.01 μmol/(m2·s) 弱測量光測得F0(基礎熒光),4000 μmol/(m2·s)飽和脈沖持續(xù) 0.8s激發(fā)測得Fm(最大熒光)。光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)最大光能轉化效率(Fv/Fm)、實際光能轉化效率(Yield)等可直接讀出。

1.4 UGP基因轉錄水平測定

收集培養(yǎng)至指數生長期的藻細胞, 滅菌雙蒸水洗滌后, 使用OMEGA的Total RNA Kit Ⅰ試劑盒, 提取RNA, 反轉錄成cDNA。以編碼組蛋白的H4基因(Histone H4)為內參基因[17], 使用Roche Applied Science的LightCycler 480 Real-Time PCR System進行實時熒光定量PCR, 檢測UGP基因的表達情況。結果分析時以對照組UGP基因相對轉錄水平作為參照定為1。

1.5 UGPase活性測定

離心收集80 mL指數生長后期的藻細胞, 使用GENMEDBradford蛋白濃度定量試劑盒(Genmed Scientifics Inc., Shanghai, China)進行清洗和裂解,加入蛋白酶抑制劑, 立即用SCIENTZ超聲波細胞粉碎機破碎10min, 離心收集上清, 通過多功能酶標儀(Synergy HT, Bio Tek, USA)監(jiān)測波長340 nm處的吸光值, 結合蛋白質濃度標準曲線, 計算得出樣品實際蛋白濃度。

UGPase活性測定使用GENMED植物尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性光譜法定量檢測試劑盒(Genmed Scientifics Inc., Shanghai, China)。通過多功能酶標儀(Synergy HT, Bio Tek, USA)監(jiān)測37℃下0與30min時波長340 nm處的吸光度。UGPase酶活力單位定義為: 在37℃, pH=7.5條件下, 每分鐘還原1 μmol NADP+所需的酶量。

1.6 金藻昆布多糖含量測定

金藻昆布多糖的萃取[18]: 準確稱取5 mg凍干藻粉, 加入5 mL 0.05 mol/L H2SO4, 渦旋混勻, 60℃水浴60min, 離心后收集上清, 藻渣經蒸餾水洗滌2次,上清合并定容于25 mL容量瓶中, 即為萃取液。

苯酚-硫酸法測定金藻昆布多糖含量[2]: 吸取1 mL萃取液, 加入1 mL 6%的液化苯酚和5 mL濃H2SO4,快速渦旋混勻, 室溫下靜置30min, 檢測490 nm處的吸光度。結合葡萄糖標準曲線, 計算出每毫克凍干藻粉中金藻昆布多糖的含量。

1.7 數據處理及分析

本實驗采用Excel 2016和Origin 8.5軟件進行圖表繪制和數據分析, 以P<0.05作為差異顯著性水平(以*表示P<0.05, **表示P<0.01)。

2 結果

2.1 生長情況分析

如圖1所示, 在6種不同濃度Cd2+的培養(yǎng)基中,藻細胞密度均逐漸增加。0.1 μmol/L Cd2+組在培養(yǎng)結束時的細胞密度最大, 顯著高于對照組, 0.5 μmol/L Cd2+組與對照組無顯著差別, 1、2和5 μmol/L Cd2+處理組明顯低于對照組, 說明低濃度Cd2+促進藻細胞生長, 較高濃度Cd2+則抑制細胞生長, 但未出現明顯白化死亡的現象。

圖1 三角褐指藻生長曲線Fig. 1 Growth curves of P. tricornutum

2.2 葉綠素熒光參數分析

葉綠素熒光參數可以靈敏地反映微藻的生理狀態(tài)。不同濃度Cd2+處理后三角褐指藻的最大光能轉化效率(Fv/Fm)和PSⅡ的實際光能轉化效率(Yield)如圖2所示。在培養(yǎng)周期內, 與對照組相比,0.1 μmol/L Cd2+組光系統(tǒng)Ⅱ的Fv/Fm和Yield明顯升高(P<0.05)。隨著Cd2+濃度增加, 藻細胞的光合作用能力逐漸降低, 0.5和1 μmol/L Cd2+的Fv/Fm和Yield與對照組差別不顯著(P>0.05), 較高濃度(2和5 μmol/L) Cd2+組的Fv/Fm和Yield顯著降低(P<0.05)。這與藻細胞的生長趨勢是一致的, 表明低濃度Cd2+促進了藻細胞光合作用, 較高濃度Cd2+抑制藻細胞的光合作用能力。

圖2 三角褐指藻的葉綠素熒光參數Fig. 2 Chlorophyll fluorescence parameters of P. tricornutum

2.3 UGP基因轉錄水平、UGPase活性和金藻昆布多糖含量分析

如圖3所示, UGP基因相對表達量、UGPase酶活及金藻昆布多糖合成量表現出相同的變化趨勢。作為影響UGP基因表達的環(huán)境因子, 低濃度Cd2+(0.1 μmol/L)上調UGP基因的轉錄水平, 提高UGPase酶活, 促進金藻昆布多糖合成, 與對照組相比, 分別提高了100.65%、11.99%和9.77%, 顯著高于其他處理組, 這說明UGPase的活性與UGP基因的轉錄水平和金藻昆布多糖的合成呈正相關, 與之前的研究結果一致[19]。隨著Cd2+濃度逐漸升高, 這3項指標均逐漸降低, 在本研究Cd2+濃度的范圍內,Cd2+濃度越大, 3項指標降低的幅度越大, 0.5 μmol/L Cd2+組與對照組無顯著差異(P>0.05), 2和5 μmol/L Cd2+組較對照組極顯著(P<0.01)降低, UGP基因轉錄水平, UGPase活性和金藻昆布多糖含量分別比對照組降低了50.31%和60.47%, 56.27%和66.72%,42.41%和47.30%, 進一步表明UGPase的活性與UGP基因的轉錄水平和金藻昆布多糖的合成之間具有顯著的相關性。

圖3 不同濃度CdCl2對三角褐指藻UGP基因相對表達量、UGPase活性和金藻昆布多糖含量的影響Fig. 3 Effects of different CdCl2 concentrations on relative quantification of UGP transcripts, UGPase activity and chrysolaminaran content of P. tricornutum

3 討論

3.1 Cd2+對三角褐指藻生長的影響

藻細胞生長是檢驗Cd2+毒性作用的良好指示。藻類對Cd2+有一定的耐受性, 不同藻類對Cd2+的耐受性不同。葸玉琴等[20]發(fā)現, Cd2+的濃度低于30 μmol/L會促進普通小球藻(Chlorella vulgari)生長, 隨著濃度增加則對小球藻的生長產生抑制作用。賀新宇等[21]也報道, 在培養(yǎng)基中添加1.78 μmol/L的Cd2+培養(yǎng)擬柱孢藻(Cylindrospermopsis raciborskii), 比生長速率顯著高于對照組。在本研究中, 低濃度Cd2+(0.1 μmol/L)促進藻細胞生長,較高濃度Cd2+(1、2和5 μmol/L)則抑制藻細胞生長,與之前的研究結論0.027 mmol/L或更高濃度Cd2+會顯著抑制三角褐指藻的生長[14]有很大差別, 這可能與不同藻株、不同實驗條件和處理時間等有很大關系。

Cd2+通常被認為不具有特定的生物學功能。但在硅藻中, Cd2+作為鎘碳酸酐酶(CDCA)催化的金屬原子, 在Zn2+消耗的海洋中, 在建立Cd2+和碳的全球循環(huán)中發(fā)揮了關鍵作用[22]。同時Zn2+是磷酸酶的重要組分, Cd2+部分替代Zn2+在磷的代謝中也發(fā)揮重要作用。Lane等[23]報道, 海洋硅藻威氏海鏈藻(Thalassiosira weissflogii)在Zn2+限制, 特別是低濃度CO2條件下, 可以表達Cd2+特異性碳酸酐酶, 在碳濃縮機制中發(fā)揮重要作用, 從而促進藻細胞生長。另外, 在Cd2+的刺激下, 藻細胞會誘導表達與重金屬結合更有效的、由多個亞基構成的長鏈金屬硫蛋白(Metallothioneins), 結合Cd2+形成無毒的金屬絡合物, 結合的Cd2+越多, 細胞對Cd2+的耐受性越強[14]。在杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)中也有類似報道,該藻在Zn2+和Cd2+的誘導下, 均可以合成植物螯合肽, 從而降低重金屬對藻細胞的毒性[24]。

在本研究中, 較高濃度Cd2+抑制三角褐指藻的生長, 可能是由于Cd2+濃度超過了藻細胞產生的金屬硫蛋白的結合能力, 細胞中存在游離狀態(tài)的Cd2+,致使細胞膜脂過氧化和膜電位去極化, 容易破壞細胞質膜的完整性, 甚至損傷細胞結構, 進而干擾代謝過程和生長[25]。另外, UGPase是植物生長過程中的重要限速酶, UGPase活性降低也會抑制生長。Woo等[26]的研究表明, 水稻中的UGPase基因通過RNA干擾抑制基因表達, 導致花粉不育, 結實率降低。同樣的, Park等[27]報道, 擬南芥UGPase基因的T-DNA插入突變體會使生長受阻。較高濃度Cd2+使UGP基因表達下調從而影響藻細胞生長。

3.2 Cd2+對三角褐指藻葉綠素熒光參數的影響

葉綠素熒光參數是研究植物光合作用能力的良好探針, 反映植物所受脅迫程度和生理狀態(tài), 是檢測快速靈敏、對生物體無損傷的新型活體診斷技術[28,29]。通過分析各項葉綠素熒光參數, 可以清晰地反映植物受到環(huán)境脅迫時光合作用能力的變化。在本研究中, 低濃度Cd2+(0.1 μmol/L)處理的三角褐指藻光合作用能力增強, 光系統(tǒng)Ⅱ最大光能轉化效率(Fv/Fm)和實際光能轉化效率(Yield)較對照組均顯著升高(圖2)。葉綠素a是植物光合作用的主要色素, 可能是Cd2+刺激了葉綠素a的合成, 導致光合作用能力隨之增強。向蓓等[30]報道, 0.1 mmol/L的Cd2+刺激鹽藻(Dunaliella salina)葉綠素a含量顯著升高, 但具體的機制需要進一步研究。

在本研究中, 較高濃度Cd2+(2和5 μmol/L)抑制藻細胞的光合作用能力,Fv/Fm和Yield均顯著低于對照組(圖2)。Stobart等[31]的研究, 金屬Cd2+抑制葉綠素酸酯還原酶活性, 減少氨基-γ-戊酮酸的合成,這兩種物質分別是葉綠素合成所必需的酶和前體,從而削弱細胞的光合作用能力。羅麗娟等[32]也報道, 煙草葉片在Cd2+脅迫下光系統(tǒng)Ⅱ供體側和受體側遭到破壞, 光合電子傳遞受阻, 高濃度Cd2+可能破壞葉綠體的完整結構, 導致類囊體膜解體, 細胞內葉綠素流失[33,34]。在本研究Cd2+濃度下, 藻細胞結構完整, 未出現明顯白化死亡的現象, 說明該藻對Cd2+具有較強的耐受性。

3.3 Cd2+對三角褐指藻UGP基因轉錄水平、UGPase活性和金藻昆布多糖含量的影響

如圖3所示, 低濃度Cd2+(0.1 μmol/L)上調UGP基因轉錄水平, 提高UGPase酶活, 促進金藻昆布多糖合成, 據我們所知, 這是有關Cd2+調控三角褐指藻UGP基因表達的首次報道。

金藻昆布多糖是硅藻的儲存性多糖, 作為一類水溶性多糖, 可以調節(jié)細胞滲透壓, 穩(wěn)定細胞結構,提高細胞對逆境的抵抗能力[35]。葸玉琴等[20]報道,普通小球藻在Cd2+濃度為5—30 μmol/L時, 藻細胞多糖含量隨Cd2+濃度升高逐漸增加。高敏等[36]報道, 菌藻共生系統(tǒng)在含17.79 μmol/L Cd2+的污水刺激下, 藻類分泌多聚糖的含量顯著增加, 多聚糖的羥基官能團直接結合水中的Cd2+達到明顯的去除效果。另外, Chen等[15]對鹽生植物海濱雀稗(Paspalum vaginatum)的研究表明, UGP編碼基因是一種Cd2+耐受基因, UGPase參與的糖代謝可以提高植物對Cd2+的耐受性。因此, 當受到低濃度Cd2+刺激時, 三角褐指藻中的UGP基因表達被上調, 調節(jié)參與的糖代謝, 增加作為滲透性保護物質的金藻昆布多糖含量, 以提高藻細胞對逆境的抵抗能力。

此外, Rivera-Becerril等[37]發(fā)現, Cd2+會減少豌豆對磷的吸收, 導致磷缺乏, 從而上調UGP基因的表達水平, 增加UGPase含量[11]。但是, 蔣麗[38]的研究卻得出了相反的結論, Cd2+降低一種海洋細菌(Pseudoalteromonassp. SCSE709-6)對磷的吸收, 導致肌醇磷酸代謝和磷酸戊糖途徑多種酶基因下調表達。而在本研究中, 較高濃度Cd2+(2、5 μmol/L)導致UGP基因轉錄水平較對照組顯著下降, UGPase酶活降低, 金藻昆布多糖含量減少。我們之前的研究表明, 磷對三角褐指藻UGP基因的表達起正調控作用[10], 由此推測, 該藻中可能也存在類似的磷鎘相互作用機制, 較高濃度Cd2+誘導產生磷缺乏, 進而下調UGP基因表達, 但具體的分子機制還需要進一步研究。

4 結論

綜上所述, 低濃度Cd2+促進三角褐指藻生長,增強藻細胞的光合作用能力, 上調UGP基因轉錄水平, 提高UGPase活性和金藻昆布多糖含量。本文首次探討了Cd2+對三角褐指藻UGP基因表達調控和金藻昆布多糖合成的影響, 為研究Cd2+調控UGP基因的表達及金藻昆布多糖的合成提供理論依據,但Cd2+調控UGP基因的具體分子機制及Cd2+是否作為活性因子參與了金藻昆布多糖的代謝調控還需要進一步研究。