鄭建波 賈永義 蔡李娜, 顧志敏 劉士力 遲美麗 程 順

(1. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所, 湖州 313001; 2. 上海海洋大學(xué), 上海 200000)

魚類在所有脊椎動物中擁有最復(fù)雜的性別決定方式, 不僅存在雌雄同體、雌雄異體和順序性雌雄同體, 其性別決定類型有遺傳調(diào)控、環(huán)境調(diào)控或者兩者共同決定的調(diào)控方式[1—3]。胰島素樣生長因子(Insulin like growth factors, IGFs)是一類進(jìn)化上比較保守的基因家族, 調(diào)控多種細(xì)胞生物學(xué)過程, 包括生長、增殖、生存、遷移和分化[4—6]?；诓溉閯游镏械难芯堪l(fā)現(xiàn), 胰島素樣生長因子系統(tǒng)包括IGF配體、IGF受體及6種IGF蛋白[7,8]。當(dāng)前大量研究證實IGFs家族在魚類等脊椎動物性腺發(fā)育與分化中具有重要作用, 但大多偏向于igf1和igf2基因和受體的研究[9]。2008年有研究者在斑馬魚(Danio rerio)[10]和羅非魚(Oreochromis niloticus)[11]卵巢中首次分離到一種新穎的IGF類型家族基因(igf3), 隨后陸續(xù)在斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)[12]、雙棘黃姑魚(Protonibea diacanthus)[13]和鯉(Cyprinus carpio)[14]中獲得相關(guān)序列信息。初步研究證實igf3基因僅在魚類的卵巢和精巢中特異表達(dá), 并始于性別決定分化早期, 在性腺發(fā)育過程中持續(xù)高表達(dá)。由于igf3基因發(fā)現(xiàn)較晚, 目前盡管圍繞igf3基因的相關(guān)研究逐漸在增多, 但其在魚類性腺發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制仍然不清楚, 有待深入的研究來闡明igf3如何發(fā)揮重要的生理學(xué)功能。

在魚類性別決定和性腺分化的過程中, 許多環(huán)境因素(如溫度、外源激素)可以影響雌雄性別比例或性別分化, 這種性別決定與分化大多依賴于表觀遺傳調(diào)控, 特別是DNA甲基化修飾[15]。大量研究表明許多類固醇合成酶和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)受到表觀遺傳修飾調(diào)控, 如在溫度依賴的海龜性別分化過程中, 高溫處理下重要類固醇合成酶CYP19A在雌性幼龜中的甲基化水平增加, 致使cyp19a基因表達(dá)抑制繼而誘導(dǎo)成雄性[16—18]; 此外, 有文獻(xiàn)報道一些性別相關(guān)基因的啟動子CpG島甲基化修飾通過介導(dǎo)時空表達(dá)水平影響性別比例[19—22]。但是, 對于甲基化調(diào)控性別決定的分子機(jī)制尚需更深入的研究。

翹嘴鲌(Culter alburnusBasilewsky)俗稱白魚,廣泛分布于長江流域各水系及附屬湖泊, 肉白而細(xì)嫩, 味美而不腥, 一貫被視為上等經(jīng)濟(jì)魚類, 在湖泊和水庫漁業(yè)中占有重要的地位[23]。翹嘴鲌有著明顯的性別異型特征, 雌性個體在生長速度和商品規(guī)格方面比雄魚更有優(yōu)勢[24]。因此, 探索性別決定及性腺分化相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制, 進(jìn)而尋求性別決定基因, 開展全雌翹嘴鲌育種技術(shù), 對于增加經(jīng)濟(jì)效益和提升產(chǎn)業(yè)體系意義重大。近年來, 我們已經(jīng)克隆了一些翹嘴鲌性別決定和分化通路中的重要基因, 如Sox9、Dmrt1及Cyp19a[25—27],并對它們進(jìn)行了初步的功能分析, 結(jié)果表明盡管這些基因在翹嘴鲌雌雄間存在二態(tài)性表達(dá)特征, 但并不是性別決定主效基因。本研究我們以翹嘴鲌為實驗對象, 運用RT-PCR和RACE等克隆手段首次成功鑒定并獲得了igf3基因的cDNA全長序列, 隨后通過實時熒光定量技術(shù)檢測了其在不同組織的表達(dá)水平。為進(jìn)一步研究DNA甲基化修飾在該基因性二態(tài)性表達(dá)特征中的調(diào)控作用, 利用重亞硫酸鹽測序技術(shù)分析了性腺組織的DNA甲基化修飾水平, 這些初步實驗結(jié)果可為進(jìn)一步研究igf3基因在翹嘴鲌中的功能及其在性別控制育種中的價值提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗使用的性成熟翹嘴鲌(雌雄各3尾)收集于浙江省淡水水產(chǎn)研究所八里店綜合試驗養(yǎng)殖基地, 魚活體運回實驗室, 在冰浴中解剖魚體取出肝、心臟、腎、肌肉、腦和雌雄翹嘴鲌的性腺等組織, 液氮凍存, 用于提取基因組DNA和總RNA。

1.2 RNA提取和cDNA合成

本實驗采用Trizon法提取總RNA, 各組織樣品在Trizon提取試劑中充分裂解, 加入氯仿離心后收集上層清液, 經(jīng)異丙醇沉淀回收得到Total RNA。選取質(zhì)量和完整性較好的卵巢RNA為模板, 按照HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒(康為 北京)方法合成cDNA第一條鏈。

1.3 翹嘴鲌igf3編碼區(qū)的克隆及cDNA末端擴(kuò)增

根據(jù)已知的斑馬魚等物種igf3 cDNA序列信息設(shè)計簡并引物, 以反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模板, PCR擴(kuò)增獲得翹嘴鲌igf3編碼區(qū)中間片段。在已知序列區(qū)域分別設(shè)計正反向引物5′RACE-1、5′RACE-2和3′RACE-1、3′RACE-2, 并參照SMARTerTMRACE (Clontech Japan)試劑盒說明書進(jìn)行cDNA末端擴(kuò)增, 最后進(jìn)行連鎖分析獲得igf3基因全長序列。

1.4 氨基酸預(yù)測、比對及進(jìn)化樹分析

利用JELLYFISH軟件分析了翹嘴鲌igf3基因的核苷酸序列及開放閱讀框和氨基酸序列的預(yù)測;DNAMAN軟件對不同物種IGF3氨基酸序列進(jìn)行了同源性比對; 應(yīng)用MEGA 5. 0軟件的鄰接法(Neighbor-joining)法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹, 每個點的計算重復(fù)為1000次。

1.5 igf3基因組織表達(dá)特征分析

首先利用Primer Express 5.0設(shè)計跨內(nèi)含子的igf3靶基因和ef-1α內(nèi)參定量引物(表1), 我們使用的是北京康為世紀(jì)生物科技有限公司的UltraSYBR Mixture染料用于實時熒光定量PCR檢測。反應(yīng)條件為: 95℃, 10min, 1個循環(huán); 95℃, 15s, 60℃, 60s,40個循環(huán)。實時定量PCR反應(yīng)及后續(xù)信息都在LightCycler 480 System(Roche 瑞士)上進(jìn)行。由于定量反應(yīng)非常敏感, 我們對每個反應(yīng)設(shè)定了3個平行, 最后采用2–ΔΔCt法計算表達(dá)量[28]并使用Graph-Pad Prism 5軟件獲得直方圖。

表1 用于本實驗的引物序列Tab. 1 Primers used in this study

1.6 igf3啟動子區(qū)域擴(kuò)增及CpG島甲基化檢測

基于前面擴(kuò)增獲得的igf3 mRNA序列設(shè)計了鄰近翻譯起始位點的兩條反向引物Walking-AS1和Walking-AS2, 以翹嘴鲌卵巢基因組DNA為材料, 根據(jù)Genome WalkerTMUniversal Kit (CloneTech, 日本)試劑盒方法構(gòu)建基因組文庫, 利用特異性引物PCR擴(kuò)增未知的近端啟動子區(qū)域。隨后對近端啟動子序列通過在線軟件MethPrimer (http://www.urogene.org/methprimer/)和ALGGEN (http://alggen.lsi.upc.es/)分別進(jìn)行了CpG島和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的預(yù)測分析。在線軟件MethPrimer預(yù)測結(jié)果顯示有一個符合標(biāo)準(zhǔn)的CpG島(CG堿基比例>60%且CpG觀測值/預(yù)測值>0.6)。隨后按照CpGenomeTMDNA Modification Kit (Chemicon, USA)試劑盒說明書對翹嘴鲌精巢和卵巢基因組樣品(各3尾)進(jìn)行重亞硫酸氫鹽處理, 以處理完成的樣品組織為模板,利用預(yù)測獲得的甲基化分析引物對igf3-BSP-F和igf3-BSP-R進(jìn)行甲基化特異性擴(kuò)增, 最后將產(chǎn)物進(jìn)行純化、連接和測序分析。在測序結(jié)果中, 甲基化的胞嘧啶不發(fā)生變化, 不甲基化的則轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏? 根據(jù)是否發(fā)生轉(zhuǎn)變便可辨別甲基化修飾模式。

2 結(jié)果

2.1 igf3基因的cDNA全長克隆

本實驗通過已經(jīng)報道的鯉igf3(GenBank 登錄號: KT895500)基因序列設(shè)計簡并引物igf3-F和igf3-R, PCR擴(kuò)增到長度接近260 bp的電泳條帶, 經(jīng)測序和BLAST同源性分析, 證明其為斑馬魚和鯉igf3的同源片段。隨后利用SMARTerTMRACE試劑盒分別進(jìn)行5′/3′-RACE末端擴(kuò)增, 最后通過RT-PCR全長序列克隆和連鎖分析成功獲得了igf3基因的完整cDNA序列。該序列全長901 bp (GenBank登錄號:MT418905), 其中包含92 bp的5′端非編碼區(qū)和203 bp的3′端非編碼區(qū), 開放閱讀框(ORF) 606 bp, 編碼201個氨基酸。序列分析顯示, 類似于其他IGF家族成員igf1和igf2,igf3同樣存在保守的特征結(jié)構(gòu)域, 主要劃分為前體信號肽、B、C、A、D和E區(qū)。

2.2 翹嘴鲌IGF3氨基酸序列比對及進(jìn)化分析

使用JELLYFISH軟件對翹嘴鲌igf3核苷酸序列推測出的氨基酸與其他脊椎動物的同源性分析表明, 與鯉(Cyprinus carpio, GenBank登錄號: KT895 500)的序列同源性最高, 為85.64%; 與斑馬魚(D.rerio, GenBank登錄號: ADO16599)次之, 為70.65%;其次為點帶石斑魚(36.57%,E. coioides, GenBank登錄號: AML84199)、尼羅羅非魚(30.20%,Oreochromis niloticus, GenBank登錄號: ABY88870)、海鱸(29.25%,Dicentrarchus labrax, GenBank登錄號: AGB 51126)、斑紋隱小鳉(25.74%,Kryptolebias marmoratus, GenBank登錄號: AGA82753); 和爪蟾(Xenopus laevis, GenBank登錄號: NP_001082137)的同源性最低, 為18.93%。采用MEGA 5.0軟件的NJ鄰接法構(gòu)建了翹嘴鲌IGF3蛋白與其他7個物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)。結(jié)果顯示翹嘴鲌與鯉發(fā)生聚類, 較其他物種具有最接近的親緣關(guān)系, 所有魚類聚為一支, 爪蟾單獨構(gòu)成一支。

圖1 翹嘴鲌IGF3系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig. 1 Phylogenetic tree analysis of IGF3 in C. alburnus

2.3 翹嘴鲌igf3表達(dá)水平分析

以ef-1α為內(nèi)參基因, 采用qRT-PCR方法對igf3基因mRNA在翹嘴鲌各組織的表達(dá)豐度進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示igf3基因在翹嘴鲌不同組織中的表達(dá)豐度差異明顯, 在卵巢中表達(dá)量最高, 其次是精巢組織, 而在腦、心臟、脾臟、肝臟、肌肉和腎臟中表達(dá)豐度極低(圖2)。這表明igf3基因在性腺中的表達(dá)水平顯著高于其他組織, 提示其在性腺形成或功能維持方面具有重要作用。

圖2 igf3在翹嘴鲌各種組織中的表達(dá)水平Fig. 2 Relative expression of igf3 in different tissues in C. alburnus

2.4 翹嘴鲌igf3啟動子區(qū)域CpG島甲基化分析

為了解翹嘴鲌的卵巢和精巢中igf3基因啟動子CpG島甲基化程度, 我們對該基因近端啟動子序列進(jìn)行了擴(kuò)增和CpG島預(yù)測。結(jié)果表明該基因啟動子區(qū)域存在一段包含8個CG位點的CpG島(圖3a)。經(jīng)重亞硫酸氫鹽處理翹嘴鲌精巢和卵巢基因組,PCR檢測結(jié)果顯示在卵巢中的10個隨機(jī)挑選克隆所有CG位點幾乎不發(fā)生甲基化修飾, 相反精巢中高度甲基化(只有一個克隆的CG位點沒有發(fā)生甲基化), 兩個性腺組織甲基化修飾水平差異顯著(圖3b和3c)。這個結(jié)果表明igf3在性腺組織中的表達(dá)豐度與DNA甲基化修飾程度正好呈負(fù)相關(guān), 提示翹嘴鲌性別二態(tài)性表達(dá)特征可能受其啟動子區(qū)域CpG島甲基化修飾的調(diào)控。

圖3 翹嘴鲌igf3基因啟動子CpG島甲基化分析Fig. 3 CpGs DNA methylation of igf3 in C. alburnus

3 討論

魚類擁有所有脊椎動物都有可能出現(xiàn)的性別決定類型, 因此研究其性別決定和性別分化具有重要的學(xué)術(shù)價值。更為重要的是, 大多數(shù)魚類在生長過程中存在明顯的性別二態(tài)性, 即雌雄個體的生長速率、個頭大小差異顯著, 通過性別調(diào)控發(fā)展單性養(yǎng)殖技術(shù)有著較高的經(jīng)濟(jì)價值[29]。已有研究表明IGFs家族除對脊椎動物的生長發(fā)育方面具有重要調(diào)控作用外, 在性別決定與分化中的作用也受到廣泛關(guān)注[30]。近年來, 在硬骨魚中發(fā)現(xiàn)一種特有的新型IGF因子(igf3), 且僅出現(xiàn)在精巢和卵巢中的間質(zhì)細(xì)胞[31], 因此其在性腺發(fā)育中的作用受到了廣泛關(guān)注。到目前為止, 已在多個魚類物種中分離鑒定到igf3基因, 包括斑馬魚、羅非魚、斜帶石斑魚、雙棘黃姑魚、鯉、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[31]和雀鯛(Chrysiptera cyanea)[32]并進(jìn)行了一些初步的表達(dá)水平和功能機(jī)制分析。

3.1 翹嘴鲌igf3的克隆鑒定和保守性分析

本研究報道了翹嘴鲌igf3基因全長cDNA序列,該基因全長901 bp, 包含開放閱讀框606 bp, 92 bp的5′端非編碼區(qū)和203 bp的3′端非編碼區(qū), 編碼201個氨基酸。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析顯示翹嘴鲌IGF3同樣存在IGF家族特有的典型結(jié)構(gòu)域, 主要劃分為前體信號肽、B、C、A、D和E區(qū), 這與羅非魚、斑馬魚和鯉魚中的結(jié)構(gòu)較為一致[9,10,14]。多重氨基酸序列結(jié)果顯示所有魚類物種的IGF3蛋白在保守結(jié)構(gòu)域區(qū)域相似度較高, 表明這些保守結(jié)構(gòu)域?qū)τ贗GF家族發(fā)揮功能作用是必需的[12]。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果, 選擇分析的魚類物種都聚為一支, 這一結(jié)果表明IGF3的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與物種的分類地位保持一致。此外, 我們還發(fā)現(xiàn)igf3基因組啟動子區(qū)域存在多個與性別相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點, 如SRY、Sox2和HMG等, 這些數(shù)據(jù)有力地證明igf3作為下游基因可能參與翹嘴鲌的性別決定與分化過程。

3.2 翹嘴鲌igf3基因的功能研究

目前發(fā)表的研究數(shù)據(jù)表明igf3在硬骨魚類性腺中的表達(dá)水平都要遠(yuǎn)高于其他組織, 暗示其在性腺中具有重要的作用[9,10,12—14]。翹嘴鲌igf3基因在成體各組織的qRT-PCR結(jié)果顯示: 該基因主要在卵巢中表達(dá), 其次在精巢中有少量表達(dá), 而其他組織基本無法檢測到igf3的表達(dá), 且卵巢中的表達(dá)水平顯著高于其他組織(P<0.001)。翹嘴鲌成體組織的表達(dá)模式推測該基因可能參與成體卵巢的功能維持,由于igf3基因在精巢中也有少量表達(dá), 提示其功能不僅限于卵巢方面的作用, 對于2個不同性腺組織的形成可能都具有重要的功能。在羅非魚中的研究表明igf3參與調(diào)控性別分化相關(guān)基因(cyp19a1a、foxl2和dmrt1)的表達(dá), 同時igf3的表達(dá)也受到這些轉(zhuǎn)錄因子和雌激素的調(diào)控[33]。

在研究魚類等脊椎動物性別發(fā)育調(diào)控時會發(fā)現(xiàn)許多性別相關(guān)基因是雌性或雄性相關(guān)基因, 其表達(dá)模式顯示了明顯的性別二態(tài)性[34]。本實驗對翹嘴鲌性腺組織qRT-PCR的檢測結(jié)果顯示, 卵巢表達(dá)量約為精巢的3倍, 說明該基因的表達(dá)呈顯著的性別二態(tài)性。為了解涉及性二態(tài)性表達(dá)特征的調(diào)控機(jī)制, 我們對性腺組織的igf3基因啟動子區(qū)域進(jìn)行了甲基化分析, 結(jié)果表明基因表達(dá)水平與DNA甲基化修飾呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。在其他魚類物種中, 如牙鲆(Paralichthys olivaceus)、斑馬魚和黃鱔(Monopterus albus)等脊椎動物, 一些性別調(diào)控基因(cyp19a、cyp17和dmrt1)也被發(fā)現(xiàn)有兩性性腺甲基化水平和基因表達(dá)的差異[18,35]。已知CpG島所在啟動子區(qū)域富含轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,igf3在精巢中的高度甲基化可能阻礙了一些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合及轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成, 進(jìn)而抑制了該基因的表達(dá), 至于具體的阻礙機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。

本研究基于RACE方法成功克隆了翹嘴鲌igf3 cDNA序列, 并對其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、氨基酸序列同源性、組織表達(dá)模式及啟動子甲基化修飾水平進(jìn)行了系統(tǒng)的檢測分析, 為進(jìn)一步揭示igf3對于翹嘴鲌性腺發(fā)育的作用奠定了研究基礎(chǔ)。但igf3在性別調(diào)控和性腺發(fā)育中如何發(fā)揮作用及表觀遺傳修飾的具體調(diào)控機(jī)制仍未可知, 為此后續(xù)實驗應(yīng)該圍繞如下兩方面進(jìn)行深入研究: (1)通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)建立功能基因敲除模型, 研究各個基因間的相互作用, 最終闡明翹嘴鲌性別決定與分化過程的調(diào)控網(wǎng)絡(luò); (2)挖掘igf3潛在的轉(zhuǎn)錄因子, 分析其在性別決定與分化關(guān)鍵時期的基因表達(dá)和甲基化動態(tài)水平的檢測分析, 設(shè)計體外實驗研究轉(zhuǎn)錄因子對igf3基因的調(diào)控關(guān)系。