臺丹丹,趙明日,孫 力

(煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺 264005)

藻膽蛋白(Phycobiliprotein,PBP)是一類存在于原核藍藻、真核紅藻、部分隱藻和一些甲藻中的水溶性色素-蛋白復(fù)合體[1-2]。根據(jù)光譜特性,分為藻紅蛋白(Phycoerythrin, PE)、藻紅藍蛋白(Phcoerycyanin, PEC)、藻藍蛋白(Phycocyanin, PC)和別藻藍蛋白(Allophycocyanin, AP)。構(gòu)成紅藻藻膽體(Phycobilisome,PBS)的藻膽蛋白為PE、PC、AP。其中多管藻(PolysiphoniaUrceolata)R-藻紅蛋白(R-PE)在498、538、567 nm處有特征吸收峰[3-4];R-藻藍蛋白(R-PC)在547、618 nm處有特征吸收峰[5];別藻藍蛋白(AP和AP-B)在650、620 nm處有特征吸收峰和肩峰[6]。

藻膽蛋白的顏色由所含的藻膽素(Phycobilin)[1,4,7]決定。在藍藻和紅藻中藻膽素主要有藻紅素(phycoerythrobilin,PEB)、藻藍膽素(phycocyanobilin,PCB) 、藻尿膽素(phycourobilin,PUB)和藻紫膽素(phycobiliviolin,PVB) 4種,其中藻紫膽素僅存在于一些藍藻所含有的PEC中[1,4]。在藻膽蛋白亞基中,藻膽素以單或雙硫醚鍵與脫輔基蛋白共價相連,交聯(lián)點相對保守[1,4,7]，其光譜特性[8-11]取決于四吡咯發(fā)色團中共軛雙鍵的數(shù)目及其π-電子的離域程度。例如,雙鍵數(shù)目較多、π-電子離域程度較大的PCB在R-PC中所表現(xiàn)的特征吸收峰一般位于615～620 nm,在AP中紅移至650 nm;雙鍵數(shù)目較少、π-電子離域程度小的PUB在PE中所表現(xiàn)的特征吸收峰一般位于498～500 nm;雙鍵數(shù)目和π-電子離域程度小于PCB大于PUB的PEB在R-PC中所表現(xiàn)的特征吸收峰位于548～550 nm,但在R-PE中其特征吸收峰可紅移至565～570 nm。由此可見,相同的PCB、PEB在不同藻膽蛋白R-PC和AP中均可表現(xiàn)出不同的光吸收特性。這種現(xiàn)象表明,除了藻膽素種類和數(shù)目之外，影響藻膽蛋白光物理特性的主要因素還包括發(fā)色團與多肽鏈的共價連接方式、發(fā)色團的微環(huán)境及其構(gòu)象、發(fā)色團間的相互作用及其能量傳遞關(guān)系[1,4,12]。多因素的綜合影響還可使來源于不同藻種的同類藻膽蛋白表現(xiàn)出吸收光譜及光吸收系數(shù)的差異,這種種源差異會使藻膽蛋白的光吸收系數(shù)失去種源間的通用性。因此,利用光吸收系數(shù)進行藻膽蛋白間的相對含量比例分析前,必須在分離純化制備出藻膽蛋白的基礎(chǔ)上完成各藻膽蛋白光吸收系數(shù)測定。

藻膽體中藻膽蛋白以特定的組成比例在連接多肽的輔助下有序組裝,為藻膽體單向、高效的光能傳遞提供了關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)支持,分析確定藻膽體藻膽蛋白的組成比例,可為利用透射電鏡技術(shù)準確模擬構(gòu)建藻膽體組裝結(jié)構(gòu)提供必要且關(guān)鍵的數(shù)據(jù)支持[13-14]。本研究以實驗室前期工作為基礎(chǔ)[15-16],利用多維層析技術(shù)方法,從多管藻藻膽蛋白提取液中分離純化、制備低含量R-PC、AP。選用Bradford 法和Hartree-Lowry法[17-19],根據(jù)Lambert-Beer Law獲得藻膽蛋白在特征吸收峰處的光吸收系數(shù),建立以特定波長的光吸收值(A)為變量,藻膽蛋白質(zhì)量濃度(CPE,CPC,CAP)為函數(shù)的線性方程組,用于藻膽蛋白提取液、層析產(chǎn)物、完整藻膽體及其部分解離產(chǎn)物等藻膽蛋白混合樣品的藻膽蛋白組成及其相對含量與分子比例分析。

1 材料方法

1.1 材料

實驗材料采自煙臺海濱,將采集到的海生紅藻多管藻按照質(zhì)量體積比1∶3的比例浸泡在50 mmol/L磷酸緩沖液(PBS,pH 7.0)中48～72 h,待藻膽體破碎后,抽濾,離心(15 000×g,15 min,10 ℃),收集上清,再依次經(jīng)500 kU和50 kU的膜包把樣品分子質(zhì)量截留在50～500 kU范圍內(nèi),將蛋白提取液濃縮至吸光度A498> 7.0,4 ℃保存。

1.2 藻膽蛋白純化制備

選用凝膠過濾、離子交換層析和疏水相互作用層析建立的多維層析技術(shù)方法,從多管藻藻膽蛋白提取液中分離純化制備R-PC和AP[15-16]。

藻膽蛋白提取液利用Sephacryl S-300 (S-300)和Sephacryl S-200順序進行凝膠過濾,S-300柱床5 cm×48 cm、S-200柱床2.5 cm×64 cm,洗脫液含200 mmo1/L NaC1 的50 mmo1/L PBS,洗脫流速6 cm/h,得到在 618和650 nm有特征吸收峰的R-PC/AP組分。

選用Q Sepharose Fast Flow進行離子交換層析,柱床1.6 cm×4.2 cm,選用600 mL 含有25 mmol/L PBS 的0～200 mmol/L 的NaC1 線性梯度、7.5～7.0 的pH值線性梯度溶液進行線性梯度洗脫,洗脫流速30 mL/h,根據(jù)洗脫曲線收集分別收集R-PC、AP組分。

選用Phenyl Sepharose 6 Fast Flow進行疏水相互作用層析,柱床 1.6 cm×4.2 cm,R-PC離子交換層析組分選用400 mL 425～10 mmol/L PBS、100～0 mmol/L NaCl進行線性梯度洗脫,AP疏水層析組分選用400 mL 200～10 mmol/L PBS 進行線性梯度洗脫,洗脫流速18 mL/h。疏水層析結(jié)束后根據(jù)洗脫曲線得到R-PC、AP和R-PC2。但疏水層析所得AP和R-PC2須選用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳進一步純化。

1.3 藻膽體樣品的制備

按照本實驗室已建立的多管藻藻膽體制備方法進行完整藻膽體的制備[20]。多管藻按照質(zhì)量體積比1∶1的比例加入1 mol/L磷酸鹽溶液,勻漿后18 000×g離心15 min,去沉淀取上清,經(jīng)蔗糖密度梯度離心得到完整藻膽體樣品。向保存在1 mol/L磷酸鹽溶液中的藻膽體加水,將磷酸鹽濃度稀釋至0.2 mol/L,藻膽體解離為R-PE、R-PC、AP的混合溶液。

1.4 光譜檢測

純化的藻膽蛋白樣品利用紫外分光光度計(UV-1900,北京普析)分別檢測R-PC、AP在280、498、567、618、650 nm處的吸收值,并掃描樣品在250～750 nm范圍內(nèi)的吸收光譜。

1.5 凝膠電泳

非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)[21]分析藻膽蛋白的純度。選用Bis-Tris HEPES電泳體系,pH=6.5,7%的分離膠(C=3%),pH=5.75,4%的濃縮膠(C=20%),穩(wěn)流方式電泳。

1.6 光吸收系數(shù)的測定

本研究選用Bradford法、Hartree-lowry法,以牛血清蛋白和γ-球蛋白為標準蛋白[19],測定多管藻的蛋白質(zhì)含量,Lambert-Beer law(A=K·C·L)求得藻膽蛋白吸收峰對應(yīng)的光吸收系數(shù),其中K為吸收系數(shù)〔L/(mg·cm)〕,L為比色皿的厚度(cm),C為濃度(mg/mL),紫外分光光度計測定吸光度,測定時,保證A約為0.2～0.8。

1.6.1 Bradford法蛋白定量 差光譜的測定:以牛血清蛋白為標準蛋白,與待測蛋白分別和含G-250的8.5%磷酸、4.75%乙醇溶液反應(yīng),選用不含G-250的磷酸-乙醇溶液作為參比液,分別測定考馬斯亮藍染液和標準蛋白、待測蛋白反應(yīng)后在250～750 nm范圍內(nèi)的吸收光譜,計算蛋白與考馬斯亮藍染液反應(yīng)前后的差光譜。由差光譜確定波峰和波谷,即為蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍染液反應(yīng)最靈敏的吸收點,記為λ峰、λ谷。

蛋白質(zhì)量濃度的測定:設(shè)計蛋白質(zhì)量濃度梯度為0、10、20、30、40、50、60 μg/mL,首先加入相應(yīng)濃度的蛋白溶液,與考馬斯亮藍G-250試劑旋渦混勻,室溫反應(yīng)30 min,確保蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍染液充分反應(yīng)。測定標準蛋白的λ峰、λ谷吸光度,以體系中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標,標準蛋白的λ峰/λ谷為縱坐標繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線選取合適的待測蛋白量,測定待測蛋白的λ峰/λ谷,由標準曲線求得待測蛋白質(zhì)量濃度。根據(jù)Lambert-Beer law,計算待測蛋白吸收峰對應(yīng)的光吸收系數(shù)。

1.6.2 Lowry法蛋白定量 以牛血清蛋白和γ-球蛋白兩種蛋白作為標準蛋白,設(shè)計蛋白質(zhì)量濃度梯度為0、20、40、60、80、100 μg/mL,使其反應(yīng)體積均為1 mL,充分混勻后分別加入0.9 mL的Hartree-Lowry試劑A,50 ℃水浴10 min,待冷卻至室溫加入0.1 mL Hartree-Lowry試劑B充分搖勻,置于室溫下反應(yīng)10 min 后加入3mL Hartree-Lowry 試劑C,50 ℃水浴10 min 后冷卻至室溫。在750 nm測吸光度,以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標,不同質(zhì)量濃度的吸光度為縱坐標,繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線上的吸光度范圍選取合適的待測蛋白量,在750 nm下測吸光度,根據(jù)標準曲線確定待測蛋白質(zhì)量濃度,由 Lambert-Beer Law 求出樣品的吸收系數(shù)。具體實驗方法參考文獻[17-19]。

1.6.3 建立方程組 根據(jù)混合樣品的光吸收值是各組分在任一波長吸光度的線性加和這一基本原理,利用Lambert-Beer law,建立R-PE、R-PC及AP特征光吸收A與質(zhì)量濃度的線性方程組:

聯(lián)立方程組,得到以A498、A567、A618和A651為變量,求CPE、CPC和CAP的方程組,用于計算藻膽體、藻紅-藻藍蛋白復(fù)合物及藻膽蛋白混合液中各藻膽蛋白的含量,進而分析各藻膽蛋白間的相對比例。

2 結(jié)果與討論

2.1 藻膽蛋白的分離純化

多維層析及層析后Native-PAGE得到的R-PC、AP的吸收光譜見圖1,根據(jù)吸收光譜,純化藻膽蛋白樣品的Amax/A280均大于4.5,符合試劑級[22]。前期Native-PAGE實驗結(jié)果[15]證明,多維層析后的R-PC蛋白純度符合吸光系數(shù)測定的要求。

圖1 2種純化藻膽蛋白的吸收光譜

2.2 藻膽蛋白吸收系數(shù)的測定

2.2.1 Bradford法 牛血清蛋白與考馬斯亮藍G-250染液結(jié)合前后的吸收光譜及其差光譜如圖2所示,與G-250染液的吸收光譜相比,牛血清蛋白與G-250結(jié)合后在465 nm處吸收顯著降低、在649 nm處吸收顯著升高,反應(yīng)后的差光譜在465 nm出現(xiàn)最低吸收值、在590 nm處出現(xiàn)最大吸收值,說明牛血清蛋白與考馬斯亮藍結(jié)合后吸光度的變化主要集中在465～590之間,峰、谷兩處吸收值的比值可敏銳反映考馬斯亮藍G-250和蛋白的結(jié)合量,選用牛血清蛋白的峰、谷比值A(chǔ)590/A466可進行藻膽蛋白質(zhì)量濃度定量測定。

圖2 牛血清蛋白與考馬斯亮藍G-250結(jié)合前后的吸收光譜及差光譜

R-PC、AP與考馬斯亮藍G-250染液反應(yīng)前后的吸收光譜及其差光譜如圖3所示,藻膽蛋白與考馬斯亮藍G-250結(jié)合后的吸收光譜與考馬斯亮藍G-250染液的吸收光譜相比, R-PC、AP與考馬斯亮藍染液結(jié)合前后在465 nm處的吸收值均未發(fā)生移動,與牛血清蛋白的吸收峰的變化相似。但在649 nm處的吸收峰分別移動到了644、646 nm處。R-PC、AP差光譜的λ峰分別在597和595 nm處,λ谷在466和469 nm處。R-PC、AP與考馬斯亮藍G-250結(jié)合后,吸收光譜變化不如牛血清蛋白顯著,但是R-PC與AP吸收光譜的變化具有相似性。根據(jù)R-PC、AP的差光譜分別選擇各自的峰谷進行吸收系數(shù)的測定。

圖3 藻膽蛋白與考馬斯亮藍G-250結(jié)合前后的吸收光譜及差光譜

由牛血清蛋白A590/A465比值和蛋白質(zhì)量濃度測定的標準曲線如圖4所示,根據(jù)標準曲線測定的藻膽蛋白的特征吸收峰的吸收系數(shù)于表1。

圖4 牛血清蛋白在A590/A465吸收比值處的標準曲線

表1 Bradford法測定的藻膽蛋白的特征吸收峰的吸收系數(shù)

2.2.2 Lowry法 由牛血清蛋白和γ-球蛋白在750 nm處的吸光度A750和蛋白質(zhì)量濃度做出的標準曲線如圖5。

圖5 標準蛋白在A750吸收處的標準曲線

根據(jù)標準曲線測定出的藻膽蛋白特征吸收峰的吸收系數(shù)于表2。Lowry法測定的藻膽蛋白R-PC和AP的特征吸收峰的吸收系數(shù),以牛血球蛋白作為標準蛋白時,R-PC測定的吸收系數(shù)小于以γ-球蛋白作為標準蛋白時測定的結(jié)果,AP則相反。且兩種標準蛋白測定的結(jié)果中,R-PC吸收系數(shù)之間的差別大于AP,AP吸收系數(shù)之間的差別幾乎可以忽略。Bradford法測定的結(jié)果與Lowry法測定的藻膽蛋白的特征吸收峰的吸收系數(shù)相比,以牛血球蛋白作為標準蛋白時,R-PC測定的吸收系數(shù)均大于以Lowry法測定的結(jié)果,與γ-球蛋白測定的結(jié)果相比,AP測定的吸收系數(shù)小于以Lowry法測定的吸收系數(shù)。

表2 Lowry法測定的藻膽蛋白的特征吸收峰的吸收系數(shù)

Bradford法作為一種檢測靈敏度較高且使用便捷的蛋白測定方法,依賴于考馬斯亮藍G-250與蛋白質(zhì)的結(jié)合。前期實驗[19]在對多管藻、異管藻的PE進行吸光系數(shù)測定時,PE在與G-250結(jié)合前后的吸收光譜表現(xiàn)出很大不同,異管藻吸收光譜變化明顯大于多管藻,因為異管藻PE易于解離而多管藻R-PE結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定,在與染液反應(yīng)時,蛋白質(zhì)的解離程度直接影響G-250與蛋白的結(jié)合,進而影響吸收光譜的變化。而Lowry 法是一種與肽鍵反應(yīng)為基礎(chǔ)的蛋白定量方法,測定時樣品經(jīng)NaOH處理后使蛋白樣品的二級以上結(jié)構(gòu)變性、解離,致使被檢測蛋白的一級結(jié)構(gòu)及其肽鍵可在后續(xù)反應(yīng)中與檢測試劑充分結(jié)合。與Bradford法相比,Lowry法基本消除了由于變性程度不同可能對蛋白定量產(chǎn)生的影響。以上實驗結(jié)果進一步說明了Bradford法測定的結(jié)果受蛋白解離程度的影響。而且，考馬斯亮藍G-250在與蛋白質(zhì)反應(yīng)時,染液中的陰離子更容易與Pr中的賴氨酸和精氨酸殘基結(jié)合,這種特異性可能導(dǎo)致該方法對不同蛋白的反應(yīng)發(fā)生變化,使得Bradford法在不同蛋白之間的反應(yīng)存在較大的差異,這也是該方法的主要缺點。因此,利用 Lowry 法測定的蛋白質(zhì)量濃度及光吸收系數(shù)更準確,與牛血清蛋白作標準蛋白相比,考慮到兩者間的結(jié)構(gòu)特性差異,γ-球蛋白更適合在多亞基復(fù)合體蛋白定量中作標準蛋白。最終選用Lowry 法中以γ-球蛋白為標準蛋白時,測定的吸光系數(shù)值。參考魏星等[19]前期測定的R-PE的吸光系數(shù)值,三種藻膽蛋白的吸收系數(shù)匯總于表3。

表3 多管藻三種藻膽蛋白的特征吸收峰的吸收系數(shù)

2.2.3 方程組的建立 根據(jù)混合樣品的光吸收值等于各組分在任一波長吸光度的線性加和這一基本原理,即A總=APE+APC+AAP,利用Lambert-Beer law,選取各藻膽蛋白的特征吸收峰,Lowry法中γ-球蛋白作為標準蛋白時測定的K值,計算蛋白質(zhì)量濃度CPE、CPC、CAP。當以498 nm處的特征吸收峰計算R-PE時,所得方程組為

以567 nm處的特征吸收峰計算R-PE時,得

同理,針對僅含有R-PE和R-PC或R-PC和AP的藻膽蛋白樣品,還可以建立相應(yīng)的二元方程組。

最終解得兩組有關(guān)藻膽蛋白含量的計算公式,以R-PE在498 nm的特征吸收峰的吸光系數(shù)計算蛋白含量時,根據(jù)不同色素的吸收光譜圖可知,λ498不僅包括R-PE、R-PC的吸收值,而且還可能包括β-胡蘿卜素及其蛋白復(fù)合體的光吸收干擾。在實際計算R-PE的含量時,來自β-胡蘿卜素的光吸收被疊加到R-PE的光吸收值上,可能使測定的R-PE的含量高于實際值,而R-PC、AP含量低于實際值。當以λ567為R-PE特征吸收峰計算蛋白含量時,測定的A567僅可能包含極微量的葉綠素-蛋白復(fù)合體的吸收干擾,與A498相比可更準確地反映R-PE質(zhì)量濃度;此外,A618和A651兩值受葉綠素-蛋白復(fù)合體的吸收干擾會更大。因此,在進行藻膽蛋白含量測定時,藻膽蛋白樣品中所含有的、在450～530 nm和550～660 nm有光吸收的雜質(zhì)成分越少,對藻膽蛋白的干擾越小,定量結(jié)果越準確。

2.3 藻膽蛋白含量及其相對比例分析

以Lambert-Beer law為基礎(chǔ),利用所測得的R-PE、R-PC及AP光吸收系數(shù),建立以藻膽蛋白特征光吸收(R-PEA498和A567,R-PCA618,APA651)為變量、蛋白質(zhì)量濃度(CPE,CPC,CAP)為函數(shù)的方程組。利用方程組,根據(jù)藻膽蛋白樣品的吸收光譜求得樣品中各藻膽蛋白的質(zhì)量濃度及其相對含量比例。這樣不僅為跟蹤藻膽蛋白分離純化過程中所得樣品中的各藻膽蛋白含量比例變化提供便利,而且還可用于完整藻膽體及其解離樣品中R-PE、R-PC和AP含量分析,確定藻膽蛋白組分在藻膽體中的物質(zhì)的量比例,為藻膽體有序組裝研究提供有力支持。

2.3.1 R-PE、R-PC混合溶液中各藻膽蛋白含量的計算 取兩個R-PE和R-PC含量確定的藻膽蛋白樣品,按比例混合并測定各蛋白混合溶液在250～750 nm的吸收光譜(圖6)及其在498、567、618 nm特征光吸收值(表4)。因樣品中只含有R-PE和R-PC不含AP,因此用二元方程組:CPE=137.501A567-70.825A618,CPC=181.661A618-1.800A567,計算混合液中R-PE和R-PC的質(zhì)量濃度,并與混合溶液中的藻膽蛋白質(zhì)量濃度的加和值進行比較(表4)。

圖6 R-PE、R-PC和混合樣品的吸收光譜

表4 混合溶液中R-PE、R-PC蛋白質(zhì)量濃度

各混合液中的R-PE和R-PC來自按比例混合的兩個藻膽蛋白樣品,因此根據(jù)A567(或A498)和A618利用二元方程組求得的各混合液中R-PE和R-PC質(zhì)量濃度的真實值應(yīng)為兩原始樣品R-PE和R-PC濃度的加和值。

2.3.2 完整藻膽體和解離后的藻膽體中藻膽蛋白含量的計算 圖7是完整藻膽體和解離藻膽體的吸收光譜。對比可知,藻膽體在解離前后吸收光譜在450～580 nm幾乎完全相同,且在498、567 nm的特征吸收峰處無變化。但兩者間的吸收光譜在580～680 nm和450～250 nm表現(xiàn)出明顯差別。例如,藻膽體解離后651 nm處的AP光吸收明顯降低,以約370 nm為中心的發(fā)色團的光吸收也明顯降低。分別測定完整藻膽體和解離后的藻膽體在498、567、618、651 nm處的特征光吸收值,便可利用三元方程組求得溶液中各藻膽蛋白(R-PE、R-PC和AP)的濃度,并根據(jù)已知分子質(zhì)量計算出物質(zhì)的量比。

圖7 完整藻膽體和解離藻膽體的吸收光譜

本實驗室用Superdex 200凝膠過濾測出的多管藻六聚體R-PE和三聚體R-PC的分子質(zhì)量分別為240 kU和136 kU。在用凝膠過濾進行R-PE與R-PC和AP分離時,三聚體R-PC和AP的洗脫峰重疊[15],表明兩者有相同(或至少非常相近)的分子大小,因此三聚體AP應(yīng)與三聚體R-PC具有相同136 kU的分子質(zhì)量。藻膽蛋白的六聚體是由兩個盤形三聚體以結(jié)構(gòu)互補方式相疊復(fù)合而成,因此R-PC和AP六聚體的分子質(zhì)量應(yīng)小于等于272 kU,大于等于R-PE的240 kU。

藻膽體解離前后各藻膽蛋白的質(zhì)量濃度如表5所示,依據(jù)藻膽體中各藻膽蛋白的質(zhì)量濃度,當R-PE、R-PC、AP分別以240、272、272 kU計算物質(zhì)的量比時,完整藻膽體中各藻膽蛋白的比例為12～13∶1∶3,解離完成之后各藻膽蛋白的比例為8～9∶1∶1。當R-PE、R-PC、AP都以240 kU的分子質(zhì)量計算物質(zhì)的量比時,完整藻膽體中各藻膽蛋白物質(zhì)的量比為11～12∶1∶3,解離后各藻膽蛋白的比例為7～8∶1∶1。為方便與8∶1∶1對比,完整藻膽體的12∶1∶3可改寫成8∶2/3∶2。就數(shù)值來看,似乎完整藻膽體中的AP增大了一倍,同時R-PC減少了1/3。這種變化應(yīng)與藻膽蛋白在藻膽體有序組裝時建立的R-PC與AP間的相互作用密切相關(guān),這種相互作用導(dǎo)致其特征光吸收增加或減少。例如,AP在618 nm處的特征吸收肩峰向651 nm吸收峰偏移,致使651 nm光吸收增加;又如,R-PC 618 nm吸收峰向長波偏移導(dǎo)致618 nm 處的光吸收降低。這一結(jié)果也證明,在用分光光度法測定藻膽蛋白及其他有色分子溶液成分質(zhì)量濃度時,溶液中各成分的質(zhì)量濃度必須足夠低,以保證各種分子均處于無分子間相互作用的獨立分布狀態(tài)。

表5 藻膽體解離前后各藻膽蛋白的濃度及相對比例

2.3.3 S-300、S-200凝膠過濾R-PC/AP混合樣品中R-PC、AP的比例 本研究在從多管藻藻膽蛋白提取液制備R-PC和AP時,首先先用S-300凝膠過濾分離R-PE同時富集R-PC/AP組分,R-PC/AP組分再經(jīng)S-200凝膠過濾以除去殘留的R-PE。根據(jù)兩種凝膠過濾所得R-PC/AP組分在567、618及651 nm的光吸收值,利用三元方程組可計算R-PC、AP的質(zhì)量濃度及物質(zhì)的量的比值,結(jié)果如表6所示。從S-300、S-200 R-PC/AP樣品的吸收光譜(圖8)中可以看出,位于R-PE的特征光吸收490～570 nm的吸收光譜明顯下降,結(jié)合表5中R-PE的質(zhì)量濃度變化,可以看出S-300樣品經(jīng)S-200凝膠過濾后R-PE含量明顯降低,S-300中R-PC和AP物質(zhì)的量比3.322∶1,S-200中R-PC與AP的物質(zhì)的量比為3.429∶1。這一結(jié)果表明,S-200凝膠過濾只是除去了S-300殘留的部分R-PE,對R-PC和AP的相對含量的影響不大。

圖8 S-300、S-200 R-PC/AP樣品的吸收光譜

表6 S-300、S-200 R-PC/AP溶液中各蛋白質(zhì)量濃度

與藻膽體中R-PC與AP 1∶1的組成比例相比,大于3∶1的R-PC與AP的比例表明,從藻膽蛋白提取到S-200凝膠過濾的實驗過程中有AP的丟失。從技術(shù)方法來看,這種AP丟失最大的可能是發(fā)生在多管藻藻膽蛋白提取是否充分上,因為在藻體中AP位于與類囊體膜直接接觸的藻膽體核結(jié)構(gòu)域中。 就此而言,從完整藻膽體分離制備AP組分應(yīng)更有利,但高質(zhì)量藻膽體樣品的制備量是一個關(guān)鍵的限制因素。

3 結(jié) 論

根據(jù)Bradford 法和Hartree-Lowry法,與結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定的多管藻六聚體R-PE相比[19],兩種方法測得的R-PC和AP光吸收系數(shù)差別相對較小。進一步證明,Bradford法測定蛋白含量與樣品蛋白質(zhì)變性解離程度密切相關(guān),而以γ-球蛋白作標準蛋白的Hartree-Lowry法更適合于多亞基復(fù)合體蛋白的含量測定。因此,選用γ-球蛋白作標準、Hartree-Lowry法測定蛋白含量所獲得的光吸收系數(shù),建立了相對誤差符合低濃度蛋白含量測定要求的、可利用特征吸收值計算R-PE和R-PC質(zhì)量濃度的一個二元線性方程組和計算R-PE、R-PC和AP的兩個三元線性方程組。

根據(jù)吸收光譜,利用三元方程組進行的完整藻膽體和解離藻膽體樣品藻膽蛋白組成分析表明:藻膽體中的R-PE、R-PC和AP物質(zhì)的量比例為11～13∶1∶3,而藻膽蛋白分子間已無相互作用的解離藻膽體的R-PE、R-PC和AP物質(zhì)的量比例則為7～9∶1∶1。這種R-PC與AP物質(zhì)的量比例的顯著差別,無疑應(yīng)來源于有序組裝藻膽體中R-PC和AP之間的結(jié)構(gòu)互補性相互作用,其結(jié)果將更有利于R-PE捕獲的光能經(jīng)過R-PC向AP的單向、高效傳遞。與本文分析確定的多管藻藻膽體中1∶1的R-PC和AP物質(zhì)的量比不同,近期以利用冷凍電競技術(shù)重構(gòu)的紅藻GriffithsiaPacifica[13]和Porphyridiumcruentum[14]藻膽體的R-PC與AP的物質(zhì)的量比均為6∶4 (3∶2)。與藻膽體的3柱體核相比,在兩者相同的核結(jié)構(gòu)域的兩個基部柱體(A)中各少了一個編號為4的三聚體AP-B,在頂部柱體中少了一對編號為1和2的三聚體AP;然而,在文章中均未給出源于其他方法分析確定的PE、PC、AP在藻膽體中的組成比例。此外,早期的研究報道[23]已確定,Porphyridiumcruentum藻膽體中是含有AP-B的。AP-B是藻膽體中除AP-LCM之外的另一個末端發(fā)射體,其主要功能之一是在藻膽體與PS I三聚體側(cè)向接觸時作為橋梁向PS I傳遞光能[12],以調(diào)節(jié)PS II與PS I之間的光能供應(yīng)平衡。就此而言,缺少AP-B會對紅藻尤其是底棲紅藻的光能利用及其光合效率產(chǎn)生非常不利的影響,因此對紅藻的光合及生長不具有合理性,需進一步研究予以確定。

本實驗分析確定的多管藻藻膽體中藻膽蛋白的組成比例及在完整藻膽體中由于結(jié)構(gòu)互補性相互作用而表現(xiàn)出的相對比例變化,將為藻膽體中R-PE、R-PC、AP的有序組裝以及光能的單向、高效傳遞提供有力的數(shù)據(jù)支持。同時,本研究所建立的二元和三元線性方程及藻膽蛋白定量分析方法,也為后續(xù)研究工作中藻膽蛋白溶液的R-PE、R-PC及AP組成分析建立了便利的技術(shù)基礎(chǔ)。