王艷芳,朱茂晶,李敏敏,應天昊,黃亞楠,盧永穎,杜 源,張雷明

(煙臺大學藥學院,分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學),山東 煙臺 264005)

抑郁癥是一種以顯著而持久的情緒低沉、心境低落等為臨床特征的情感性精神障礙疾病[1-2]。抑郁癥的發(fā)病機理尚不明確,經(jīng)典理論包括單胺能假說、神經(jīng)營養(yǎng)假說、神經(jīng)可塑性假說、神經(jīng)內(nèi)分泌假說及神經(jīng)免疫假說等。近年來,越來越多的研究表明下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis, HPA) 過度激活、炎癥反應與抑郁癥的發(fā)生密切相關[3-5],HPA軸是機體內(nèi)與應激反應密切相關的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)[6],機體處于應激狀態(tài)時會激活下丘腦室旁核神經(jīng)元引發(fā)軸興奮,經(jīng)過一系列傳遞使糖皮質(zhì)激素分泌增多,導致HPA軸過度激活，促進促腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticotropic hormone ACTH)、皮質(zhì)酮(corticosterone,CORT) 等持續(xù)性升高，造成海馬等腦區(qū)結構功能損傷;此外,應激可導致腸屏障功能破壞,腸黏膜通透性改變,腸道微生物及內(nèi)毒素(脂多糖Lipopolysaccharide,LPS)等泄漏入血,引起外周及中樞炎癥,過度產(chǎn)生的炎癥因子能抑制GR表達、核轉位以及結合活性,從而進一步加劇了HPA軸過度激活和糖皮質(zhì)激素(GCs)抵抗,產(chǎn)生更多的GCs,進一步損害海馬等腦區(qū)神經(jīng)元,促進抑郁發(fā)生[7]。

人參皂苷Rg1是人參的主要成分[8],現(xiàn)代研究顯示Rg1能夠拮抗應激導致的小鼠焦慮和抑郁樣行為[9],還能逆轉LPS誘導急性炎癥導致的RAW264.7 巨噬細胞 GR 表達下降[10],進而抑制NF-κB激活,從而發(fā)揮其抗炎特性[11]。因此,本研究采用經(jīng)典慢性不可預知溫和性刺激(Chronic unpredictable mild stress,CUMS)聯(lián)合LPS制備抑郁動物模型,從調(diào)節(jié)HPA軸過度激活、抑制炎癥反應角度研究Rg1抗抑郁的作用機制,為其臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物雄性C57BL/6J小鼠,體重19 ～ 21 g,購于濟南朋悅動物繁育有限公司,合格證SCXK(魯)2014-0007。適應性飼養(yǎng)3 d,23～25 ℃,相對濕度40%～60%,自由飲水攝食。動物實驗方案已獲得煙臺大學動物倫理委員會的批準。

1.2實驗藥品與試劑人參皂苷Rg1(批號:GR-133-160526,純度≥98%):南京廣潤生物制品有限公司提供;脂多糖(L2630):sigma公司提供;P65(sc-71675)、GR(sc-56851)抗體:美國Santa Cruz公司提供;小鼠TNF-α ELISA試劑盒(SEKM-0034):北京索萊寶科技有限公司提供;BCA 蛋白濃度測定試劑盒(P0010):上海碧云天生物技術有限公司提供。

1.3實驗儀器與設備液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher公司);高速臺式離心機(德國Eppendorf公司);酶標儀(美國Molecular Devices公司);Western blot 電泳儀、轉膜系統(tǒng)(Bio-Rad公司);凝膠成像系統(tǒng)(日本GE生物科技公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠抑郁模型的制備 將小鼠單籠飼養(yǎng),并接受11d CUMS,每天隨機給予1～2種刺激,刺激不連續(xù)出現(xiàn)。刺激結束后,腹腔注射LPS 200 μg/kg,制備小鼠抑郁模型[12]。

1.4.2 實驗分組及給藥 將動物隨機分為對照組、模型組、米諾環(huán)素20 mg/kg組、Rg1 5 mg/kg、10 mg/kg及20 mg/kg組,每組10只。除對照組外,其余各組動物給予CUMS,各給藥組同時灌胃給藥,每日1次,連續(xù)11 d,末次給藥1 h后腹腔注射LPS 200 μg/kg。

1.4.3 行為學實驗 (1)懸尾實驗。采用小鼠專用懸尾箱(30cm×30 cm×40 cm,內(nèi)有固定吊環(huán)),距尾尖2 cm處用醫(yī)用膠布固定于吊環(huán)上,使其頭部距離地面15 cm。各組懸尾6 min,小鼠首先適應1 min,從第2 min開始記錄后續(xù)5 min內(nèi)小鼠的不動時間的總和。

(2)強迫游泳實驗。首先將動物適應環(huán)境至少1 h,然后將小鼠放入強迫游泳實驗裝置,使小鼠在水中前爪攀附于缸壁并且不能以后爪支撐身體為標準,保持水溫 25±2 ℃。觀察6 min,記錄后5 min內(nèi)的累計不動時間。

(3)曠場實驗。采用周壁和地面為白色的敞箱,用黑線將白色地面劃分為面積相等的16塊,將一只100 W的燈泡懸掛在敞箱中央上方。將單只小鼠置于清潔敞箱中央,記錄小鼠的水平運動得分(小鼠穿過地面的方塊數(shù))和垂直運動得分(小鼠前兩爪離地站立次數(shù))。每只小鼠觀察5 min。

1.4.4 不同腦區(qū)單胺神經(jīng)遞質(zhì)DA和NE水平檢測 給予LPS 24 h后,每組隨機取6只小鼠處死,用生理鹽水進行心臟灌注,取腦,分離海馬、前額葉皮質(zhì),稱重,與5倍體積的0.1%甲酸水勻漿,與4倍體積的0.1%甲酸乙腈沉淀蛋白,于4 ℃,離心10 min(13 000 r/min),取上清,用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行檢測分析。

1.4.5 前額葉皮質(zhì)和血清TNF-α及血清ACTH、CORT水平檢測 小鼠麻醉取血,室溫自然凝固10 min,離心20 min(3500 r/min),收集上清,-20 ℃保存?zhèn)溆谩７蛛x前額葉皮質(zhì),用超聲破碎儀將標本勻漿充分,離心20 min(3500 r/min)。收集上清,分裝后-20 ℃保存?zhèn)溆?。按?ELISA 試劑盒說明書操作步驟進行測定。

1.4.6 Western blot檢測小鼠海馬組織核NF-κB P65、FKBP51、GR蛋白表達 小鼠麻醉處死,取腦組織,于冰上迅速剝離海馬組織,稱取20 mg海馬組織加入250 μL RIPA裂解液于冰上勻漿,4 ℃下12 000 r/min 離心5 min,收集上清液,測定蛋白濃度。將上清液加入5倍體積上樣緩沖液,煮沸10 min。10% SDS-PAGE凝膠電泳后進行轉膜,隨即5%脫脂奶粉溶液封閉2 h,TBST 緩沖液洗膜3次;加入一抗(1∶1000稀釋),4 ℃ 孵育過夜,洗膜,加入二抗孵育1 h,洗膜,加入ECL 發(fā)光色液,放入凝膠成像系統(tǒng),曝光拍照。用ImageQuant LAS 4000軟件計算條帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 實驗結果

2.1 Rg1對CUMS+LPS致抑郁小鼠行為學的影響

2.1.1 Rg1對CUMS+LPS致抑郁小鼠懸尾不動時間的影響 結果顯示,模型組小鼠懸尾不動時間顯著延長;米諾環(huán)素組小鼠懸尾不動時間顯著縮短;Rg1 5 mg/kg組小鼠懸尾不動時間有所縮短,但不具有統(tǒng)計學意義,Rg1 10 mg/kg、20 mg/kg組小鼠懸尾不動時間顯著縮短(圖1)。

與對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,

2.1.2 Rg1對CUMS+LPS致抑郁小鼠游泳不動時間的影響 結果顯示,模型組小鼠游泳不動時間顯著延長,米諾環(huán)素組小鼠游泳不動時間顯著縮短;Rg1 5 mg/kg及Rg1 10 mg/kg組小鼠游泳不動時間顯著縮短(圖2)。

與對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,

2.1.3 Rg1對CUMS+LPS致抑郁小鼠曠場實驗水平運動及垂直運動得分的影響 結果顯示,與對照組比較,模型組小鼠曠場實驗水平得分無明顯變化;與模型組比較,米諾環(huán)素組小鼠曠場實驗水平得分無明顯變化;Rg1各劑量組小鼠曠場實驗水平得分無明顯變化(圖3(a))。

與對照組比較,模型組小鼠曠場實驗垂直得分無明顯變化;與模型組比較,米諾環(huán)素組小鼠曠場實驗垂直得分無明顯變化;Rg1各劑量組小鼠曠場實驗垂直得分無明顯變化(圖3(b))。

圖3 Rg1對CUMS+LPS致抑郁小鼠曠場實驗水平得分、垂直得分的影響

2.2 Rg1對CUMS+LPS致抑郁小鼠不同腦區(qū)DA和NE水平的影響

結果顯示,模型組小鼠海馬DA、前額葉皮質(zhì)NE水平顯著降低,與模型組比較,米諾環(huán)素組小鼠海馬DA小鼠前額葉皮質(zhì)NE水平顯著升高;Rg1 5 mg/kg組海馬DA水平有所增加,但無統(tǒng)計學意義,Rg1 10 mg/kg、20 mg/kg組海馬DA水平顯著升高(圖4(a));Rg1各劑量組小鼠前額葉皮質(zhì)NE水平顯著升高(圖4(b))。

與對照組比較,#P<0.05;與模型組比較,

2.3 Rg1對CUMS+LPS致抑郁小鼠中樞炎癥的影響

2.3.1 Rg1對CUMS+LPS致抑郁小鼠前額葉皮質(zhì)及血清TNF-α水平的影響 結果表明,模型組小鼠前額葉皮質(zhì)及血清TNF-α水平顯著升高;米諾環(huán)素組小鼠前額葉皮質(zhì)和血清TNF-α水平顯著降低,在小鼠前額葉皮質(zhì)中,Rg1 5 mg/kg、10 mg/kg組TNF-α水平變化無統(tǒng)計學意義,Rg1 20 mg/kg組TNF-α水平顯著降低(圖5(a));Rg1 5 mg/kg組血清TNF-α水平變化無統(tǒng)計學意義,Rg1 10 mg/kg、20 mg/kg組血清TNF-α水平顯著降低(圖5(b))。

2.3.2 Rg1對CUMS+LPS致抑郁小鼠海馬組織核NF-κB p65表達的影響 結果顯示,模型組小鼠海馬核NF-κB p65表達顯著升高,米諾環(huán)素組小鼠海馬核NF-κB p65表達顯著降低;Rg1各劑量組小鼠海馬核NF-κB p65表達均顯著降低(圖6)。

與對照組比較,##P < 0.01;與模型組比較,

與對照組比較,##P < 0.01;與模型組比較,

2.4 Rg1對CUMS+LPS致抑郁小鼠HPA軸及海馬FKBP51、GR蛋白表達的影響

2.4.1 Rg1對CUMS+LPS致抑郁小鼠血清ACTH、CORT水平的影響 結果顯示,模型組小鼠ACTH、CORT水平顯著升高,米諾環(huán)素組小鼠ACTH、CORT水平顯著降低;Rg1 5 mg/kg組小鼠ACTH水平變化無統(tǒng)計學意義,Rg1 10 mg/kg、20 mg/kg組小鼠ACTH水平顯著降低(圖7(a));Rg1 5 mg/kg、10 mg/kg組小鼠CORT水平變化無統(tǒng)計學意義,Rg1 20 mg/kg組小鼠CORT水平顯著降低(圖7(b))。

與對照組比較,##P < 0.01;與模型組比較,

2.4.2 Rg1對CUMS+LPS致抑郁小鼠海馬組織FKBP51蛋白表達的影響 結果顯示,模型組小鼠海馬FKBP51表達顯著升高,米諾環(huán)素組小鼠海馬FKBP51表達顯著降低,Rg1各劑量組小鼠海馬FKBP51表達均顯著降低(圖8)。

與對照組比較,##P < 0.01;與模型組比較,

2.4.3 Rg1對CUMS+LPS致抑郁小鼠海馬組織GR蛋白表達的影響 結果顯示,模型組小鼠海馬GR表達顯著降低,米諾環(huán)素組小鼠海馬GR表達顯著升高,Rg1各劑量組小鼠海馬GR表達均顯著升高(圖9)。

與對照組比較,#P < 0.05;與模型組比較,

3 討 論

研究表明,應激導致的HPA 軸過度激活以及炎癥反應在抑郁癥發(fā)生中起重要作用,且二者能相互促進,加劇抑郁癥發(fā)生、發(fā)展[13-15]。動物接受CUMS后給予低劑量LPS,可增強慢性輕度刺激動物的抑郁癥狀,抑郁樣不動時間延長,且海馬和前額葉皮質(zhì)炎癥增加,5-HT及其受體5-HT2A表達減少[16]。米諾環(huán)素是一種四環(huán)素類抗生素,脂溶性高,易于穿過血腦屏障,具有良好的中樞神經(jīng)系統(tǒng)滲透性,可以影響與情緒障礙病理生理學有關的多種相互作用。有研究表明,米諾環(huán)素可減輕與LPS誘導的神經(jīng)炎癥有關的疾病癥狀,防止抑郁樣不動,同時海馬和皮質(zhì)中TNF-α以及吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)mRNA表達減少[17]。本實驗室前期在CUMS刺激小鼠11 d 的基礎上,疊加LPS刺激,成功制備了CUMS+LPS抑郁模型[12]。因此,本研究以米諾環(huán)素做陽性對照藥物,采用CUMS聯(lián)合 LPS 制備小鼠抑郁模型,從HPA軸過度激活,炎癥反應的角度深入研究Rg1的抗抑郁機制。

本研究結果顯示,動物接受CUMS后給予低劑量LPS,模型組小鼠懸尾不動時間和游泳不動時間均延長,Rg1可縮短抑郁小鼠懸尾不動時間與游泳不動時間;在抑郁行為學研究中,曠場實驗用于評價抑郁行為同時也用于評價藥物對自主活動的影響[18]。由于某些可增加動物活動性的藥物會使實驗出現(xiàn)假陽性結果, 為了排除Rg1提高動物自發(fā)活動性而使小鼠強迫游泳和懸尾不動時間縮短這一可能,實驗中采用曠場實驗測試了小鼠的自主活動性,結果顯示小鼠曠場實驗的水平得分和垂直得分均無顯著性變化,提示Rg1不影響小鼠的自主活動。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)學說認為抑郁癥的發(fā)病與腦內(nèi)多巴胺(Dopamine, DA)和去甲腎上腺素(noradrenaline, NE)水平低下有關[19],本研究結果顯示,模型組抑郁小鼠海馬DA和前額葉皮質(zhì)NE水平下降,Rg1能顯著逆轉抑郁小鼠海馬DA和前額葉皮質(zhì)NE水平下降。結果提示,Rg1能夠通過改善小鼠抑郁樣不動行為,提高腦內(nèi)DA和NE水平而發(fā)揮抗抑郁作用。

前期研究顯示,炎癥在抑郁癥的病理生理中起重要作用[20-21]。壓力能夠激活NLRP3/caspase 1炎癥信號通路,釋放IL-1β和IL-18。此外,外部壓力破壞腸道通透性,導致細菌和細菌產(chǎn)物(例如LPS)從腸道泄漏出來,然后激活了NF-κB等炎癥信號通路[22]。NF-κB激活后能夠促進TNF-α、IL-6等促炎細胞因子的釋放,腦內(nèi)過量的炎癥因子能夠激活IDO、iNOS從而減少單胺合成,增加單胺再攝取并增強谷氨酸興奮性毒性[23]。本研究結果顯示,模型組小鼠前額葉皮質(zhì)和血清中TNF-α水平增高,Rg1各組能夠降低前額葉皮質(zhì)和血清中TNF-α水平;CUMS聯(lián)合LPS使抑郁小鼠海馬組織與炎癥密切相關的NF-κB p65蛋白入核明顯增加,Rg1各組均可顯著下調(diào)核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達,提示Rg1對抑郁樣行為的影響與其抗炎作用有關。

動物受到CUMS刺激后HPA軸可過度激活,促進垂體ACTH從促腎上腺皮質(zhì)細胞釋放到全身循環(huán),ACTH刺激腎上腺皮質(zhì)合成分泌大量CORT從而影響GR功能導致HPA軸的負反饋調(diào)節(jié)失調(diào)[24]。同時,有研究表明,GR的功能還與FKBP51有關[25],FKBP51是GR功能的強抑制劑,可通過抑制GR與GC的結合、核轉位來影響GR功能,引起糖皮質(zhì)激素抵抗,最終導致與情感有關的腦區(qū)如前額葉皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元受損、結構和功能發(fā)生改變,產(chǎn)生抑郁[26]。本研究結果顯示,模型組小鼠血清中ACTH、CORT水平升高,Rg1能夠顯著降低抑郁小鼠的ACTH、CORT水平。此外,CUMS聯(lián)合LPS能夠顯著提高海馬FKBP51蛋白表達,抑制海馬GR表達。Rg1能夠逆轉海馬FKBP51、GR蛋白水平。提示Rg1可能通過調(diào)節(jié)FKBP51/GR表達抑制HPA軸的過度激活發(fā)揮抗抑郁作用。

綜上,Rg1的抗抑郁作用機制與其抑制HPA軸過度激活、調(diào)節(jié)GR功能和抑制炎癥反應有關。