李 鑫,張雨沐,孫鈺菲,劉興華,王文艷

(煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院,新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評(píng)價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 煙臺(tái) 264005)

S-EPA為硫取代epacadostat (EPA)[1]的類似物,是一種有效的小分子吲哚胺2,3-雙加氧酶(Indoleamine 2,3-Dioxygenase, IDO)抑制劑。IDO可催化色氨酸(teyptophan,Trp)轉(zhuǎn)化為犬尿氨酸(kynurnine,Kyn),其過度表達(dá)與腫瘤免疫逃逸密切相關(guān)[2-6]。實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明S-EPA與EPA(epacadostat)對(duì)荷瘤小鼠的IDO活性抑制率基本一致[7]。前藥設(shè)計(jì)可增加口服或者局部給藥的吸收度、提高生物利用度等,已成為一種有效策略而廣為接受[8-11]。李紅等設(shè)計(jì)了夫西地酸(Fusidic Acid,FA)羧酸酯前藥 F1 和 F2,在大鼠給藥 FA、F1、F2 后,其中 F1 的吸收程度更高,具有更高的生物利用度[12]。加巴噴丁酯是加巴噴丁的消旋體前藥,在大鼠和猴子中口服后,被有效吸收并迅速轉(zhuǎn)化為加巴噴丁[13],在臨床使用中,加巴噴丁酯可以通過提高療效、減少患者間差異和減少給藥頻率來改善神經(jīng)性疼痛、癲癇病和許多其他疾病的治療[14]。對(duì)于吸收較差、生物利用度低的藥物,可嘗試采用設(shè)計(jì)為酯類前藥的手段改善化合物的缺陷。在犬單次灌胃給予S-EPA和EPA后,S-EPA在體內(nèi)的暴露量低于EPA,約為其70%。因此本研究設(shè)計(jì)了一種S-EPA的羧酸酯前藥PCC1,結(jié)構(gòu)如圖1所示,旨在改善S-EPA的吸收度,提高其生物利用度。

圖1 PCC1化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器

AB 4500-Qtrap三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)AppliedBiosystems公司),配備有ESI 離子源;ExionLCTMAD系列高效液相色譜儀(美國(guó)AppliedBiosystems公司);Q Exactive Orbitrap高分辨質(zhì)譜(美國(guó)ThermoFisher公司);核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance, NMR)譜采用Avance Neo 600 超導(dǎo)核磁共振儀(德國(guó)Bruker公司)測(cè)定,1H-NMR、13C-NMR 的測(cè)定頻率分別為 600 MHz、150 MHz。

1.2 藥品與試劑

EPA (上海升德醫(yī)藥科技有限公司,純度>99%);S-EPA(煙臺(tái)大學(xué)藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制,純度>98%);PCC1 (實(shí)驗(yàn)室自制,純度>95%);甲醇、乙腈(色譜純,德國(guó)Merck);Solutol、乙酸銨(美國(guó)sigma公司);甲基叔丁基醚、二氯甲烷(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性比格犬6只,體重為10 kg左右,由山東綠葉制藥有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào) SCXK(魯) 20170006,所有動(dòng)物都嚴(yán)格按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南自由獲取飼料和水。動(dòng)物相關(guān)的所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)煙臺(tái)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜質(zhì)譜條件

色譜條件:色譜柱為shim-pack,XR-ODS C18柱(3.0 mm×50 mm, 2.2 μm)。

液相條件:流動(dòng)相為85% 乙腈-15% 水,含0.4 mmol·L-1醋酸銨;進(jìn)樣體積5 μL;流速為0.3 mL·min-1;柱溫為30 ℃。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子化電離源(ESI),負(fù)離子檢測(cè)模式:離子化電壓-4500 V,毛細(xì)管溫度450 ℃,氣簾氣30 psi,噴霧氣55 psi。兩種分析物及內(nèi)標(biāo)的LC-MS/MS參數(shù)見表1。

表1 兩種分析物及內(nèi)標(biāo)的LC-MS/MS 參數(shù)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別精密稱定PCC1、S-EPA各2份,用適量甲醇溶解稀釋配制成濃度為1 mmol·L-1的儲(chǔ)備液。分別取儲(chǔ)備液適量,用甲醇連續(xù)稀釋以制備所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液和質(zhì)控工作液,內(nèi)標(biāo)用甲醇稀釋至5 μmol·L-1待用。

2.3 全血樣品處理方法

精密量取冰水浴下融化的犬全血樣品 45 μL,加入5 μL內(nèi)標(biāo)(EPA, 5 μmol·L-1),精密加入500 μL 乙腈,渦旋1 min后,超聲10 min,以13 000 r/min離心10 min,取上清液加入提取液(叔丁基甲醚∶二氯甲烷=3∶2,V/V),渦旋3 min后,4000 r/min離心10 min,取上清液于37 ℃水浴氮吹,吹干后100 μL流動(dòng)相復(fù)溶,進(jìn)樣5 μL分析。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

根據(jù)《中國(guó)藥典》(2015 版)[15]對(duì)于生物樣品定量分析方法學(xué)驗(yàn)證的指導(dǎo)原則,針對(duì)S-EPA血藥濃度測(cè)定的 LC-MS/MS 方法進(jìn)行系統(tǒng)的方法學(xué)考察,內(nèi)容包括專屬性、線性范圍和定量限、提取回收率、精密度與準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)以及不同條件下的樣品穩(wěn)定性。

2.5 犬藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

比格犬禁食不禁水 12 h 后隨機(jī)分為 2 組,即PCC1 和S-EPA 組,每組3 只,分別灌胃給予 PCC1和S-EPA的 20% Solutol 溶液,給藥劑量為 5 mg/kg,給藥體積為1 mL/kg,分別于給藥前及給藥后 15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h靜脈采血約1 mL置于肝素化EP管中,-20 ℃凍存待測(cè)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果與討論

3.1 PCC1結(jié)構(gòu)確認(rèn)

經(jīng)高分辨質(zhì)譜掃描其m/z[M+H]+=496.969 82,其理論值為495.963 45,偏差在2.94。PCC1的1H-NMR和13C-NMR結(jié)果見表2,結(jié)果表明該化合物為所合成的目標(biāo)化合物PCC1。

表2 PCC1用氘代二甲基亞砜溶解后的 NMR結(jié)果

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證

3.2.1 專屬性 通過分析來自6個(gè)不同個(gè)體的空白全血考察方法的專屬性。結(jié)果表明,在測(cè)定條件下, 全血中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾分析物的測(cè)定,代表性色譜圖如圖2所示。

圖2 LC-MS/MS測(cè)定犬全血樣品中S-EPA藥物濃度的典型色譜圖

3.2.2 線性范圍、定量下限與殘留 取室溫下融化的空白犬全血45 μL,加入5 μL內(nèi)標(biāo)(EPA, 5 μmol·L-1)分別精密加入不同濃度S-EPA對(duì)照品工作液 5 μL(使全血中的S-EPA的濃度分別為10、20、40、80、200、400、800、2000 nmol·L-1,再精密加入500 μL乙腈,其余操作步驟同樣品處理過程,同時(shí)制備一個(gè)空白樣品和一個(gè)零濃度樣品(含內(nèi)標(biāo))。以待測(cè)藥物濃度為橫坐標(biāo),待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo),用加權(quán)(W=1/X2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算,三天的直線回歸方程分別為

Y=0.003 44x+0.007 46,

Y=0.002 65x+0.001 21,

Y=0.003 1x-0.001 04,

相關(guān)系數(shù)R分別為0.994 3、0.996 9、0.996 0。結(jié)果S-EPA全血藥物濃度在10～2000 nmol·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,R>0.994 3。定量下限為10 nmol·L-1。在最高濃度樣品(含內(nèi)標(biāo))進(jìn)樣后空白樣品中的分析物和內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間處均無明顯色譜峰(即待測(cè)物峰面積小于定量下限的20%,內(nèi)標(biāo)峰面積小于5%),表明系統(tǒng)無分析物及內(nèi)標(biāo)殘留。

3.2.3 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) 按樣品處理方法制備低、高濃度的質(zhì)控樣品,并且制備內(nèi)標(biāo)和低/高濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液加入到經(jīng)預(yù)處理的6 個(gè)不同來源的空白犬全血中配制成相當(dāng)于低、高質(zhì)控濃度的樣品,以及制備相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,分別比較提取樣品中每種分析物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比與含基質(zhì)工作液中峰面積比值,計(jì)算提取回收率,比較含基質(zhì)工作液與不含基質(zhì)工作溶液中的峰面積比考察基質(zhì)效應(yīng)。每個(gè)濃度平行6份,化合物回收率、基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見表3。

表3 犬全血中S-EPA的提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)(n=6)

3.2.4 精密度與準(zhǔn)確度 配制定量下限、低、中、高(10、30、200、1600 nmol·L-1) 4個(gè)濃度的 S-EPA 標(biāo)準(zhǔn)全血樣品各6 份,按“2.3”項(xiàng)下方法處理、測(cè)定,得日內(nèi)變異;每日配制定量下限、低、中、高4個(gè)濃度的S-EPA標(biāo)準(zhǔn)全血樣品各6份,連續(xù)3 d測(cè)定,得日間變異,并計(jì)算準(zhǔn)確度。如表4所示,S-EPA定量下限的批內(nèi)、批間精密度(用CV表示)均小于7.6%,準(zhǔn)確度(用RE表示)均小于6.6%。表明該方法的精密度和準(zhǔn)確度符合生物樣品測(cè)定要求。

表4 LC-MS/MS法測(cè)定犬全血中S-EPA的精密度和準(zhǔn)確度

3.2.5 穩(wěn)定性 取空白犬全血血漿45 μL,加入低、高濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制低、高濃度質(zhì)控,考察犬全血樣品自動(dòng)進(jìn)樣器放置24 h、3次凍融循環(huán)的穩(wěn)定性,-20 ℃下放置14 d的穩(wěn)定性。每種條件下每濃度3個(gè)平行樣本。穩(wěn)定性考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示,S-EPA在各條件下穩(wěn)定性良好,樣品測(cè)定和保存條件下的穩(wěn)定性均符合生物樣品測(cè)定要求。

表5 不同條件下S-EPA在犬全血中的穩(wěn)定性(n=3)

3.3 犬體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)評(píng)價(jià)

健康雄性比格犬在 5 mg/kg 劑量下單次灌胃給予 S-EPA和PCC1 后,PCC1迅速轉(zhuǎn)化為 S-EPA,全血中未檢測(cè)到該前藥,其S-EPA 的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖 3。根據(jù)血藥濃度經(jīng)時(shí)變化曲線數(shù)據(jù),采用 Winnonlin 8.1軟件非房室模型法計(jì)算各給藥組 S-EPA的藥動(dòng)學(xué)參數(shù),結(jié)果見表6。比格犬灌胃給藥 S-EPA和PCC1后,PCC1 組Cmax提高了1.54倍,改善了S-EPA的吸收,與S-EPA組比較,生物利用度是其135%。

表6 犬灌胃給予S-EPA及PCC1后平均全血S-EPA藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(n=3)

圖3 犬灌胃給予 S-EPA和PCC1后S-EPA在犬全血中的平均藥-時(shí)曲線(n=3)

4 結(jié) 論

本文建立了靈敏、快速、準(zhǔn)確的 LC-MS/MS 方法用于犬全血中 S-EPA藥物濃度測(cè)定,并進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證,符合S-EPA血藥濃度測(cè)定的生物分析要求,并且方法成功應(yīng)用于S-EPA的羧酸酯前藥與S-EPA的犬體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特征評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示,羧酸酯前藥 PCC1 較原型藥物 S-EPA 在吸收方面有明顯改善,提高了其在犬體內(nèi)的生物利用度。