杜世豪,張子惠,謝群玲,徐 浩,宋澤宇,鄭 濤,徐佳慧,劉中信,范華英

(煙臺大學(xué)藥學(xué)院,新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥效評價教育部重點實驗室(煙臺大學(xué)),山東 煙臺 264005)

腎病綜合征(Nephrotic Syndrome,NS)是慢性腎病(Chronic Kidney Disease,CKD)常見的臨床診斷類型,是以高蛋白尿、高血清白蛋白、高血脂和水腫為臨床特征的綜合征[1]。目前臨床上通常使用糖皮質(zhì)激素、細胞毒性藥物和免疫抑制劑治療NS,但在長期治療的過程中,通常伴隨著嚴重的不良反應(yīng)[2]。因此,尋找新的策略治療NS,或者減少治療NS過程中的不良反應(yīng)具有重要的臨床意義。

NS的發(fā)病機制復(fù)雜,目前認為發(fā)病原因主要與炎癥、免疫和氧化應(yīng)激等因素有關(guān)[3-5]。有研究證明,血液中的促炎癥因子白介素6(Interleukin-6,IL-6)和白介素8(Interleukin-8,IL-8)在NS的發(fā)病過程中升高[6-7],這些炎癥因子可能介導(dǎo)腎功能的損傷,不但促進炎癥的發(fā)展,還導(dǎo)致腎小球濾過屏障的破壞,加快NS的發(fā)病過程[8]。高遷移率族蛋白1(High mobility group box 1,HMGB1)是一種炎癥蛋白,能夠激活炎癥細胞,釋放大量炎癥因子,從而引發(fā)一系列免疫反應(yīng)[9]。機體內(nèi)多種疾病的發(fā)生都與HMGB1密切相關(guān),包括腎臟疾病、腫瘤以及自身免疫炎癥疾病[9-11],而在腎臟疾病中,HMGB1表達水平升高,激活炎癥反應(yīng),與炎癥因子相互促進,引發(fā)炎癥因子的級聯(lián)反應(yīng),從而加快腎臟疾病的進程[9]。因此,通過藥物干預(yù)HMGB1的表達,減少炎癥因子釋放,對于治療NS有著積極作用。

基于NS的復(fù)雜發(fā)病機制,天然藥物多靶點治療的特點可能具有顯著優(yōu)勢。目前臨床上,多種天然藥物如人參[12]、丹參[13]等提取物,已經(jīng)廣泛用于治療腎功能損傷等。曲札茋苷(圖1)是從拉薩大黃中提取的一種化合物,生物活性高,具有抑制炎癥、清除氧自由基等藥理作用[14-15],其廣泛的藥理作用可能有助于減輕腎功能損傷。因此,為了探討曲札茋苷與NS的發(fā)病機制的聯(lián)系,本研究利用注射用鹽酸多柔比星(Doxorubicin,Dox)誘導(dǎo)的NS大鼠模型[16]評價曲札茋苷對NS大鼠模型的治療作用。

圖1 曲札茋苷結(jié)構(gòu)式

1 實驗部分

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 成年雄性SD大鼠30只,180～220 g,購買自濟南朋悅實驗動物繁育公司,實驗動物合格證編號:SYXK(魯)20190003。實驗中所用大鼠均在溫度23±1 ℃,濕度55%±5%的條件下飼養(yǎng),并于實驗前進行7 d適應(yīng)性飼養(yǎng),給予足夠飼料和飲水。本研究經(jīng)過煙臺大學(xué)動物倫理委員會批準,實驗方案嚴格按照煙臺大學(xué)動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定設(shè)計。

1.1.2 實驗儀器 全自動血生化分析儀(美國雅培公司),SpectraMax iD3型酶標儀(美國Molecular Devices公司),ST16型離心機(賽默飛世爾科技有限公司),AE224C電子天平(上海舜宇恒平科技有限公司),ImageQuant LAS 4000型超靈敏化學(xué)發(fā)光成像分析儀(美國通用醫(yī)療有限公司)。

1.1.3 實驗試劑 曲札茋苷注射劑由鉑源藥物研究有限公司提供;醋酸潑尼松片購自浙江仙琚制藥股份有限公司;注射用鹽酸多柔比星購自深圳萬樂藥業(yè)有限公司; IL-6試劑盒、IL-8試劑盒購自南京建成科技有限公司;Bradford蛋白定量試劑盒購自索萊寶生物科技有限公司;HMGB-1多克隆抗體購自Abcam生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 健康成年雄性SD大鼠30只,隨機分為5組:空白對照組、模型組、醋酸潑尼松組、5 mg·kg-1曲札茋苷組、10 mg·kg-1曲札茋苷組,每組6只。

1.2.2 實驗造模及給藥 通過單次尾靜脈注射Dox溶液(6.5～7.5 mg·kg-1,溶于0.9 % NaCl溶液),空白對照組注射等體積的0.9% NaCl溶液,造模當日記為實驗第1天,實驗第7天開始給予藥物治療。(1)空白對照組:給予等體積0.5% 羧甲基纖維素鈉水溶液灌胃及0.9% NaCl溶液尾靜脈注射;(2)模型組:給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液灌胃及0.9% NaCl溶液尾靜脈注射;(3)醋酸潑尼松組:給予0.5% 羧甲基纖維素鈉水溶液配制醋酸潑尼松溶液,按照10 mg·kg-1的劑量灌胃及0.9% NaCl溶液尾靜脈注射;(4)5 mg·kg-1曲札茋苷組:給予體積0.5% 羧甲基纖維素鈉水溶液灌胃及0.9% NaCl溶液配制的曲札茋苷溶液,按照5 mg·kg-1的劑量尾靜脈注射;(5)10 mg·kg-1曲札茋苷組:給予等體積0.5% 羧甲基纖維素鈉水溶液灌胃及0.9% NaCl溶液配制的曲札茋苷溶液,按照10 mg·kg-1的劑量尾靜脈注射。

1.3 檢測指標

1.3.1 24 h尿蛋白含量 實驗期間,收集第3、7、14、21、28天的24 h尿液,收集尿液時,給予足夠飲水并且禁食,收集尿液后在1000×g的離心力的條件下離心20 min,取其上清液進行尿蛋白定量,尿蛋白定量時使用Bradford蛋白定量試劑盒,操作時嚴格按照試劑盒使用說明進行,按照試劑盒說明書要求計算蛋白含量。

1.3.2 血液生化指標 實驗第29天,取大鼠腹主動脈血液,靜置30 min,在1000×g的條件下離心15 min,取上清液,用全自動血生化檢測儀測取血清總蛋白,血清白蛋白,甘油三酯,總膽固醇,尿素氮,肌酐。

1.3.3 曲札茋苷對NS大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)的影響 實驗第29天,取大鼠雙側(cè)腎臟,取腎皮質(zhì)固定于2.5%戊二醛溶液中,經(jīng)過PBS清洗,1%鋨酸固定、以及梯度脫水等過程后,進行包埋,再升溫聚合,切片染色后觀察。

1.3.4 HMGB-1、Desmin、Nephrin蛋白含量測定 實驗結(jié)束時,摘取大鼠右側(cè)腎臟,取20 mg腎皮質(zhì)組織,加入250 μL組織裂解液,剪碎,然后勻漿并離心。取上清液,進行蛋白定量,加入5倍上樣緩沖液,加熱變性后待用。

1.3.5 曲札茋苷對血清IL-6和IL-8含量的影響 手術(shù)取材后,取每只大鼠腹主動脈血,靜置,離心,取血清,按照IL-6和IL-8定量試劑盒說明書操作,最后根據(jù)說明書要求計算血清中IL-6和IL-8含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 實驗結(jié)果

2.1 曲札茋苷對NS大鼠24 h尿蛋白含量的影響

如表1所示,注射Dox造模后,靜脈注射阿霉素后,大鼠尿蛋白排泄量逐漸增加。第7天時,模型對照組大鼠尿蛋白含量顯著高于正常對照組;第14天開始,模型對照組大鼠尿蛋白含量快速升高。醋酸潑尼松治療顯著降低大鼠第14、21和28天尿蛋白含量;5 mg·kg-1曲札茋苷在第14～21天治療效果相比于醋酸潑尼松的治療效果較差,第28天時治療效果優(yōu)于醋酸潑尼松;10 mg·kg-1曲札茋苷組第14、21、28天的治療效果較優(yōu)于醋酸潑尼松組。

表1 曲札茋苷對各個時間24 h尿蛋白的影響

2.2 曲札茋苷對NS大鼠血液生化指標的影響

如表2所示,模型組與空白對照組相比大鼠血清白蛋白和總蛋白含量下降,同時升高膽固醇和甘油三酯水平。醋酸潑尼松治療后血清白蛋白和總蛋白含量升高,降低了膽固醇和甘油三酯水平;與模型組相比,5 mg·kg-1和 10 mg·kg-1曲札茋苷組可以升高血清白蛋白和總蛋白含量,降低膽固醇和甘油三酯水平。5 mg·kg-1曲札茋苷組和醋酸潑尼松對血液生化指標的改善作用相差不大,差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義;10 mg·kg-1曲札茋苷對各項血液生化指標的改善效果較為顯著。這些數(shù)據(jù)表明,曲札茋苷對于NS的癥狀有著良好的治療作用。

表2 曲札茋苷對血生化指標的影響

2.3 曲札茋苷對NS大鼠腎功能的影響

為了評價曲札茋苷對NS大鼠腎功能損傷的治療程度影響,檢測了血清中肌酐和尿素氮的含量，結(jié)果見表3。模型組與空白對照組相比,模型組大鼠血清中的肌酐和尿素氮含量明顯升高;醋酸潑尼松治療后,血清中肌酐和尿素氮含量降低;5 mg·kg-1曲札茋苷組和10 mg·kg-1曲札茋苷組可以降低肌酐和尿素氮含量,且10 mg·kg-1曲札茋苷組治療效果優(yōu)于醋酸潑尼松組。

表3 曲札茋苷對腎功能的影響

2.4 曲札茋苷對NS大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)的影響

為了評價曲札茋苷對NS大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)的影響,利用透射電鏡觀察腎皮質(zhì)組織切片,結(jié)果見圖2?？瞻讓φ战M腎皮質(zhì)足細胞足突明顯,足突形狀正常;突觸間隙清晰可見。與空白對照組相比,模型組腎皮質(zhì)足細胞足突廣泛融合,突觸間隙消失。醋酸潑尼松組改善足突融合現(xiàn)象,突觸間隙略為清晰。5 mg·kg-1曲札茋苷組和10 mg·kg-1組曲札茋苷對腎皮質(zhì)足細胞足突形狀和突出間隙,10 mg·kg-1曲札茋苷組改善效果更明顯。

圖2 曲札茋苷對腎組織超微結(jié)構(gòu)的影響(標尺=1.0 μm)

2.5 曲札茋苷對HMGB1、Desmin、Nephrin的表達的影響

如圖3所示,模型組大鼠與空白對照組相比,HMGB1和Desmin表達水平增高,Nephrin表達水平降低。醋酸潑尼松干預(yù)后,HMGB1和Desmin表達水平降低,Nephrin表達水平增高。5 mg·kg-1和10 mg·kg-1曲札茋苷干預(yù)后,HMGB1和Desmin表達水平均有降低,Nephrin表達水平升高,且10 mg·kg-1曲札茋苷組對HMGB1、Desmin和Nephrin的表達水平改善效果較好。

與空白對照組相比,#P<0.05,##P<0.01；與模型組對比,*P<0.05,**P<0.01；與醋酸潑尼松組相比,&P<0.05,&&P<0.01。

2.6 曲札茋苷對血清IL-6和IL-8含量的影響

為了評價曲札茋苷對于NS大鼠炎癥因子的影響,檢測了血清中炎癥因子IL-6和IL-8的含量結(jié)果見表4。與空白對照組相比,模型組血清中IL-6和IL-8含量明顯升高,提示NS大鼠中有炎癥發(fā)生。醋酸潑尼松治療后,IL-6和IL-8含量下降。5 mg·kg-1曲札茋苷組和10 mg·kg-1組曲札茋苷對血清中IL-6和IL-8含量降低作用,且10 mg·kg-1曲札茋苷組治療效果較好。說明曲札茋苷能有效改善NS大鼠血清中炎癥因子,具有良好的抗炎作用。

表4 曲札茋苷對血清IL-6、IL-8的影響

3 討 論

注射用鹽酸多柔比星誘導(dǎo)的NS大鼠模型是最為常用的實驗性腎病模型之一[16]。在本實驗中,通過尾靜脈注射7.5 mg·kg-1Dox進行造模,在造模7 d后,NS大鼠的24 h尿蛋白含量隨著時間增加而升高,實驗結(jié)束時,模型組24 h尿蛋白含量已明顯高于正常組;血清總蛋白和血清白蛋白含量低于正常組;甘油三酯和血清總膽固醇含量高于正常組。與此同時,尿素氮和血肌酐升高,腎功能受損。透射電鏡下觀察,腎足細胞足突廣泛融合,突觸間隙消失,這些特征符合NS的臨床特征和病理表現(xiàn)[17-18]。這說明:本次實驗中所誘導(dǎo)的NS大鼠模型,可以用來研究曲札茋苷對NS的治療作用。

本實驗結(jié)果表明,醋酸潑尼松對NS大鼠有良好的治療作用,而10 mg·kg-1曲札茋苷對于NS大鼠的各種癥狀具有更好的緩解作用,可以更顯著地減緩Dox導(dǎo)致的腎功能損傷。應(yīng)用曲札茋苷治療后,NS大鼠的蛋白尿得到了有效緩解。在NS中,蛋白尿是最主要的癥狀,也是促進NS病理進程的重要原因。蛋白尿產(chǎn)生過程中,腎小球濾過功能紊亂是重要原因[19],本實驗中,Dox誘導(dǎo)的NS大鼠腎組織在透射電鏡下腎小球基底膜(Glomerular basement membrane,GBM)形態(tài)基本正常,但是足突廣泛融合,突觸間隙消失;血清中尿素氮和肌酐含量較高,這可能是腎小球足細胞裂孔(Slit diaphragm,SD)蛋白分子Nephrin受損表達降低[20],從而導(dǎo)致SD結(jié)構(gòu)遭到破壞,使腎小球濾過功能嚴重失調(diào);并且腎小球損傷的標志性蛋白分子Desmin表達升高提示了蛋白尿的產(chǎn)生可能與腎小球損傷密切相關(guān)[21]。在曲札茋苷治療后,Nephrin表達上升,Desmin表達下降,同時透射電鏡下的病理現(xiàn)象明顯改善。

NS的發(fā)病機制復(fù)雜,炎癥反應(yīng)已經(jīng)被證明為發(fā)病的重要原因[3],在NS病理進程中,炎癥蛋白HMGB1異常表達,從而激活炎癥反應(yīng),產(chǎn)生IL-6、IL-8等炎癥因子[22],加重腎功能損傷。本研究表明,NS大鼠與空白對照組相比,IL-6和IL-8含量明顯升高,這表明NS大鼠處于炎癥狀態(tài)。與模型組相比,10 mg·kg-1曲札茋苷能顯著降低NS大鼠血清中的IL-6和IL-8水平,表明曲札茋苷可以通過改善NS大鼠的炎癥反應(yīng)進而緩解NS。

4 結(jié) 論

綜上所述,曲札茋苷在治療NS大鼠中具有顯著療效。當給予NS大鼠10 mg·kg-1曲札茋苷時,對NS的治療效果稍優(yōu)于醋酸潑尼松,并對HMGB1的表達有下調(diào)作用,并下調(diào)炎癥因子IL-6和IL-8,這說明曲札茋苷可能通過抑制炎癥反應(yīng)治療NS。本實驗結(jié)果預(yù)示著曲札茋苷有著良好的開發(fā)前景,同時也為曲札茋苷的藥物研發(fā)和臨床上治療NS的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。